人源溶菌酶在毕赤酵母中的高效表达
人溶菌酶(hLYZ)作为一种天然的抑菌活性物质,在畜牧、医药及食品等行业具有潜在的应用价值。
但由于制备材料来源有限,产物分离纯化费用高等因
素,hLYZ的应用受到了极大的限制。
本论文旨在利用毕赤酵母系统表达具有生物活性且易于纯化的hLYZ,以期降低生产成本解决溶菌酶应用受限的问题。
主要研究内容如下:(1)将α信号肽和hLYZ基因作为整体进行密码子优化,并将其插入pPICZαA空载体,构建重组表达载体pPICZ-OptαF+hLYZ。
通过转化筛选,获得一株稳定性较好的重组子K1。
K1摇瓶表达发酵液总蛋白浓度为260 mg·L-1,总酶活为12,937 U·mL-1。
在5 L发酵罐中培养K1,细胞密度达到50 g-DCW·L-1开始诱导,甲醇浓度控制于5 g·L-1,最终的总蛋白浓度为1.71 g·L-1,总酶活达到262,152 U·mL-1。
(2)对α信号肽做了进一步的优化处理,新插入39个碱基,构成包含增长的信号肽和hLYZ基因的新序列将其插入pPICZαA空载体,构建得到另一表达载体pPICZ-EhnαF+hLYZ,通过转化筛选获得重组子K4。
K4摇瓶表达发酵液总蛋白浓度为320 mg·L-1,总酶活为16,974 U·mL-1,均优于K1。
在5 L发酵罐中采用与K1相同的诱导策略,最终发酵液中的总蛋白浓度可达到2.54 g·L-1,比K1提高48.5%,但总酶活为258,712 U·mL-1,比 K1 略低。
(3)考察了 K4在高细胞密度(～100 g-DCW·L-1)下起始诱导的hLYZ表达性能。
进行纯甲醇诱导,并将甲醇浓度控制于5 g·L-1,诱导54 h发酵液中的总蛋白浓度为3.02 g·L-1,但随后发生严重降解,诱导68 h后仅剩2.07 g·L-1。
采用甲醇/山梨醇共混流加策略,优先将甲醇浓度控制于5 g·L-1,不控制溶解氧浓度,诱导68 h总蛋白浓度可达到2.88 g·L-1,未出现明显的蛋白降解现
象。
上述二种诱导策略下最高的总酶活水平分别为324,072 U·mL-1 和 290,438 U·mL-1。
(4)利用Bgl Ⅱ和BamH Ⅰ属于同尾酶的特点,设计多拷贝串联hLYZ
基因表达载体,并获得了两拷贝及四拷贝串联hLYZ基因转化重组子K-2-2、K-4-2。
摇瓶发酵条件下,K-2-2和K-4-2的最高总蛋白浓度分别为193.0mg·L-1和185.3 mg·L-1,对应的总酶活分别为5,256 U·mL-1和5,424 U·mL-1。
5 L发酵罐中,K-2-2低细胞密度(～50 g-DCW·L-1)诱导73 h及高细胞密度(～100
g-DCW·L-1)诱导65 h后,发酵液中的总蛋白浓度分别为0.79 g·L-1和0.93 g·L-1,总酶活分别为70,332 U·mL-1和71,529 U·mL-1,约为重组子K1的50%。
K-4-2诱导表达10 h后细胞失去活性,发酵失败。
多拷贝串联hLYZ基因转化重组子的溶菌酶表达性能较低。
