第2章 生物样品制备技术

有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。
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细胞破碎相关的器械与器材
电动组织捣碎机
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电动组织捣碎机
原理：用可调速电机驱动捣碎转子（头）在高速旋转下将组织打碎达到匀浆目的。
市售仪器多数是可调速机型，有不同口径、头端式样的转子供选择，平头转子适于制备乳浊液及悬浮液，锯齿状转子适于制备组织和含纤维物质的匀浆。
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4.2 透析用器材
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透析膜的处理：
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注意事項： *操作时必需戴手套*
1. 取出透析袋要先用蒸餾水清洗乾淨，綁透析袋前要先試裝蒸餾水，看透析袋有沒有蛀孔，會不會有水噴出。 綁透析袋不要太用力拉扯，否則透析袋可能會裂。
2. 一般透析至少要 3 h，至少要換兩次透析液 (100 至 1000 倍樣本體積) 才能完全。
透析只需要使用专用的半透膜即可完成。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”，袋（膜）外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。截留分子量MWCO通常为1万左右。
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透析
透析：膜分离技术的一种，仅让小分子扩散性的选择性的通过透过膜，把小分子从溶液中分离出去而保留生物大分子的技术。
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应用：常用于改换大分子溶液的盐成分，除去小分子，改变溶剂成分等。
超滤法利用半透膜截流大分子，适于浓缩生物大分子。
离子交换法与吸附法是稀溶液通过离子交换柱或吸附柱，溶质被吸附后，再用少量液体洗脱、分部收集能使所需要物质的浓度提高几倍以至几十倍。
还有冷冻融化、加沉淀剂、溶剂萃取、亲和层析等方法也能达到浓缩的目的。我们只介绍蒸发浓缩。

方法
物理固定法：指用冷、热或微波等物理方法对生物组织进行固定。 在超微结构研究中，冷冻固定和微波固定是较为常用的物理固定 方法。 化学固定法：采用一定的化学试剂锇酸、戊二醛、甲醛、高锰酸 钾等对组织或细胞进行固定。这种化学试剂称“固定剂”。它能 和细胞内的大分子物质，主要是蛋白质发生化学结合形成交联， 使蛋白成分得以凝固稳定，与此同时也能保存糖类和脂肪，使其 保持生活时的状态和位置，从而达到把细胞的精细形态结构保存 下来的目的。
优点：
① 对组织的渗透力比锇酸大，而且能保存组织内某些酶活性； ② 与蛋白质之间的反应较快，能较好地保存蛋白质的结构； ③ 对细胞内的微管及滑面内质网、线粒体等膜性结构保存较好； ④ 可以较好地固定和保存组织里的糖原，用大白鼠的肝脏可证明 大约有65％的糖原可被戊二醛保存下来；
⑤ 能够较好的固定植物组织。
第二章 电镜生物制备技术
• 第一节 生物样品制备技术的重要性 • 第二节 透射电镜生物样品制备技术
• 第三节 扫描电镜生物样品制备技术
第一节 生物样品制备技术的重要性
1. 决定电镜图像分辨率的两个因素
① 电镜本身的分辨本领； ② 样品结构和反差（样品结构与反差在很大程度上又取决 于样品制备技术）。
2. 电镜样品应具备的基本条件
① 样品必须彻底干燥； ② 样品要进行提高反差处理； ③ 样品厚度要适宜；
④ 样品耐受电子束的轰击；
⑤ 充分保存好生物样品的超微结构。
第二节 透射电镜生物样品制备技术
一．超薄切片技术
二．冷冻超薄切片技术
三．负染色技术
一. 超薄切片技术
（一）. 超薄切片技术概述
1. 超薄切片
2. 固 定
定义
用化学或物理法迅速杀死细胞，使所取材料各种细胞或大分子尽可 能保持生活状态的结构，尽可能地减少细胞的死后变化，使细胞及 其细胞器的精细结构完好无损地得以保存。

1.2 注意事项 • 采样要有代表性(体液：几μL ，器官组织：几 mg); • 采样时机； • 采样部位准确； • 采样后应立即加以处理，如采好血样后立即加 抗血凝剂，组织器官加防腐剂，动物样品速冻处 理，植物样品脱水处理。 • 采用工具需消毒，最好经过无毒处理。
2 细胞破碎 2.1 目的
破坏细胞外壳，使细胞内含物有效地释放出来。 即：将生物体细胞内及多细胞生物组织中的待测组 分(如激素、酶、基因工程产物等)充分释放到溶液 中。 不同的生物体
(2) 盐析法 原理：利用不同蛋白质在高浓度的盐溶液中溶 解度不同程度的降低来沉淀除去蛋白质。 在低盐浓度下，蛋白质溶解度随着盐浓度升 高 而增加－－盐溶作用； 当盐浓度不断升高时，不同蛋白质溶解度又以
不同程度下降，并先后析出沉淀－－盐析作用。 （这是蛋白质分子内及分子间电荷的极性基团的静电引力造成的。由于水中
表面活性剂处理法：
常用的有：十二烷基磺酸钠
氯化十二烷基吡啶
去氧胆酸钠
其他方法：
改变细胞膜透性、破坏蛋白质与脂类结合等。 如真空干燥、制成丙酮粉。 注意：
• 无论用哪一种方法破碎细胞，都需要在一定的
稀盐溶液或缓冲溶液中进行；
• 一般还需加入保护剂防止生物大分子变性和
降解。
二 生物大分子的提取与蛋白质的去除
加入少量盐，增加了溶液的极性，减弱了蛋白质分子间的作用力，促使其溶解 度增大。当盐浓度增加到一定程度时，水活度被降低，蛋白质表面的电荷大量 被中和，水化膜被破坏，蛋白质分子又相互聚集而沉淀析出。）
盐析法的优点： 对设备和条件要求低，安全，应用范围广泛； 一般可在室温下操作； 常用的中性盐有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、 氯化钠、磷酸钠等。 硫酸铵的盐析能力强，饱和液浓度大，溶解

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细胞破碎相关的器械与器材
• 1)电动组织捣碎机
• 原理：用可调速电机驱动捣碎转子（头）在 高速旋转下将组织打碎达到匀浆目的。 • 市售仪器多数是可调速机型，有不同口径 、头端式样的转子供选择，平头转子适于 制备乳浊液及悬浮液，锯齿状转子适于制 备组织和含纤维物质的匀浆。 • 应用：一般用于动物组织，植物肉质种子， 柔嫩的叶、芽等材料。国产的捣碎机最高 转速可达1-2万转/分，因旋转刀刃的机械 切力很大，制备较大分子样品很少使用。 动、植物细胞30-45秒完全破碎，酵母菌和 细菌需加入石英砂加强效果。
2. 通过文献调研和预备性实验，掌握目标产物的物理、 化学以及生物学性质
3. 生物材料的破碎和预处理 4. 分离纯化方法的选择和探索 5. 选择相应、可靠的分析技术，建立鉴定生物分子制备 物的均一性（即纯度）的方法 6. 产物的浓缩、干燥和保存 基本原则： 以尽可能少的步骤、尽可能短的时间，获得 尽可能多的目标产品
可将自然流出的唾液1～2mL ，置干净容器内置冰冻保存 ，或者立即
放水浴中煮沸10min，灭活唾液中的血型分解酶活性，然后置4℃冰箱 保存。
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生物材料的选择
（四）组织 1.匀浆化法（简单，回收率低）
2.蛋白沉淀法（简单，回收率低）
3.酸碱水解（适合于酸碱条件下稳定的药物或毒物） 4.酶水解法（避免高温降解，不适合碱性条件下水解的 药物或毒物）
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超声波细胞破碎机
• 原理：仪器发出一定频率的超声波产生振动力破碎细胞壁和细胞器
。由超声波发生器和超声换能器两部分极成。
• 相应超声换能器的长度及尖端口径也可挑选不同长短、粗细，以满 足0.1~250ml的容量需要。 • 应用：用于各种动植物细胞、病毒细胞、细菌及组织的破碎，也可用 于各类高分子物质的破碎，同时可用来乳化、分离、匀化、提取、消