分光光度法测定叶绿素a含量的方法探讨_张新

养鱼塘水中叶绿素a的测定孔琪摘要测定叶绿素a的仪器和方法有许多种，分光光度法测定叶绿素a是一简便易行的测定方法，水样经离心或过滤浓缩、研磨、丙酮提取后，定容，取上清液分别测量750nm、645nm、663nm、652nm等几个波长下的吸光度值，根据经验公式可分别计算出叶绿素a含量关键词分光光度法叶绿素a前言叶绿素作为水生态系统中主要初级生产者一浮游植物的生物量和生产力的指标,具有测定方便快速和重复性好等优点.在水生生物学研究,水质评价和富营养化水体的调查研究中,叶绿素既作为生态系统结构指标,又作为功能指标被广泛使用.叶绿素在红光(600nm以上)区域有吸收波长极值,因而用分光光度法可以测定叶绿素的含量1 试验部分1.1主要仪器与试剂90%丙酮溶液，2mol/LHcl；10mL具塞小试管 1cm玻璃比色皿，滤纸玻璃纤维滤膜，可见分光光度计1.2实验步骤1.2.1水样处理：所取的水样应往湖中间点不能去表面水样，水样中如有大的微粒，可用搅拌器搅拌2～3 min，以至混合均匀。

1.2.2 将100~500mL水样经玻璃纤维滤膜过滤，记录过滤水样的体积。

将滤纸卷成香烟状，放入小瓶或离心管。

加10mL或足以使滤纸淹没的90％丙酮液，记录体积，塞住瓶塞，并在4℃下暗处放置4h。

如有浑浊，可离心萃取。

将一些萃取液倒入1cm玻璃比色皿，加比色皿盖，以试剂空白为参比，分别在波长665nm和750nm处测其吸光度。

1.2.3 加滴2mol/L盐酸于上述两只比色皿中，混均并放置1min，再在波长665nm和750nm 处测定吸光度。

2 结果与讨论2.1结果处理酸化前： A=A665-A750酸化后： A a=A665a-A750a在665 nm处测得吸光度减去750 nm处测得值是为了校正浑浊液。

用下式计算叶绿素- a的浓度（μg/L）：2.2计算：叶绿素-a=29*（0.01+0.05）*12/200=0.1044μg/L3结论3.1池塘水中的叶绿素-a含量为0.1044μg/L.参考文献[1]王飞儿, 吕唤春, 陈英旭, 等. 2004. 千岛湖叶绿素a浓度动态变化及其影响因素分析[J]. 浙江大学学报(自然科学版)，30(1): 22-26.[2]中国药典2005版一部[s].北京:化学工业出版社.2005:3SQ[3]胡韧, 林秋奇, 段舜山, 等. 2002. 热带亚热带水库浮游植物叶绿素a与磷分布的特征[J]. 生态科学，21(4): 3l0-3l5.[4]林丽贞, 陈纪新, 刘媛,等.2007. 东、黄海典型海区分粒级浮游植物叶绿素a的周日波动及影响因子[J].台湾海峡，26(3): 342-350.[5] 刘镇盛, 王春生, 倪建宇, 等. 2003.抚仙湖叶绿素a的生态分布特征[J]. 生态学报，23(9): l773-l780.[6] 国家环境保护总局《水和废水监测分析方法》编委会编. 2002. 水和废水监测分析方法(第四版) [M]. 北京: 中国环境科学出版社，2002.[7] 黄祥飞. 湖泊生态调查观测与分析[M]. 2000北京: 中国标准出版社.。

叶绿素含量的测定分光光度法叶绿素是植物和一些原生生物中重要的光合色素之一，它在光合作用中起到接收和转换光能的关键作用。

测定叶绿素含量可以帮助我们了解植物的光合效率和健康状况，以及研究光合作用的机制和调控。

分光光度法是一种常用的测定叶绿素含量的方法，本文将介绍该方法的原理、实验步骤和数据分析。

一、原理分光光度法测定叶绿素含量的原理是基于叶绿素对光的吸收特性。

叶绿素分子可以吸收特定波长的光，特别是蓝光和红光，而对绿光的吸收较弱。

利用分光光度计测量叶绿素溶液在不同波长的光下的吸光度，可以通过比较吸光度与叶绿素浓度的标准曲线，计算出待测样品中叶绿素的含量。

二、实验步骤1. 制备叶绿素提取液：将适量的鲜叶片（去除茎和大的叶脉）放入离心管中，加入少量酒精，并用研钵捣碎，使叶绿素释放到酒精中。

然后用酒精将研钵中的残渣洗入离心管中，最后用酒精将叶绿素完全溶解。

注意，酒精的使用要避免火源。

2. 离心沉淀：将叶绿素提取液离心10分钟，以沉淀残渣和悬浮物。

3. 分光光度计测量：取离心后的叶绿素提取液，用分光光度计在特定波长下（如645 nm和663 nm）测量其吸光度。

记录吸光度值。

4. 制备标准曲线：取不同浓度的叶绿素标准溶液，用同样的方法测量其吸光度，记录吸光度值。

5. 计算叶绿素含量：根据标准曲线，将待测样品的吸光度值代入，通过计算叶绿素浓度的公式，得出叶绿素的含量。

三、数据分析1. 标准曲线的绘制：将各个标准溶液的叶绿素浓度作为横坐标，吸光度作为纵坐标，绘制曲线。

利用标准曲线可以通过待测样品的吸光度值，反推出其叶绿素的浓度。

2. 计算待测样品中叶绿素的含量：根据标准曲线，将待测样品的吸光度值代入，通过计算叶绿素浓度的公式，得出叶绿素的含量。

四、注意事项1. 实验中应尽量避免阳光直射，以免光线对实验结果的干扰。

2. 操作时应注意安全，避免酒精接触到火源。

3. 叶绿素提取液的制备应充分溶解，避免残渣和悬浮物的影响。

分光光度法测定湖泊水中叶绿素a含量的研究
赵荣龙;梁欣欣;吴玉萍;崔丹;张玲
【期刊名称】《中国标准化》
【年(卷),期】2024()7
【摘要】叶绿素a含量是评价水体富营养化水平的重要依据,水体营养化程度过高会影响水生生物的生存和繁殖,导致水体生态系统紊乱,生物多样性受到破坏。

叶绿素a几乎是所有浮游植物类别都含有的叶绿素类型。

所以,叶绿素a含量既是水体富营养化的判断标准,又是浮游植物现存量的重要推断依据。

水体富营养化是我国当前水环境面临的主要问题。

为阐明分光光度法测定水体中叶绿素a含量结果的快速性和准确性,本研究用研磨机代替手工研磨进行样品制备,用标准物质进行加标测定。

结果显示叶绿素a检测值符合标准要求。

【总页数】4页(P247-250)
【作者】赵荣龙;梁欣欣;吴玉萍;崔丹;张玲
【作者单位】昆明滇池水务环境监测有限公司;贵州省环境监测中心站;昆明滇池物流有限责任公司
【正文语种】中文
【中图分类】X52
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探讨分光光度法测定水中叶绿素a的方法改进【摘要】针对水中叶绿素含量测定步骤繁琐，操作过程损失多，人为干扰因素大等特点，在不改变原有方法的基础上，对叶绿素处理方式进行改进：用丙酮超低温冷冻萃取；超声波充分震荡破碎混匀；微孔滤膜进一步过滤去除杂质干扰。

通过试验，发现新方法测定在很大程度降低了操作过程中人为因素的耗损，提高了检测效率和检测质量。

【关键词】叶绿素a；分光光度法；醋酸纤维膜；丙酮；微孔滤膜1 前言随着现代经济的高度发展和人口膨胀，湖泊、水库正接纳越来越多的氮、磷等营养负荷，也使得浮游生物及其他水生生物异常繁殖，造成水体富营养化，严重影响供水水质。

藻类计数和叶绿素含量的测定是用于评价水体富营养化水平的两大生物水质检测指标，利用显微镜对水中藻类计数耗时长、检测人员存在主观判断差异不同，测得的藻类计数结果往往相差较大。

叶绿素测定受人为主观判断影响相对较小，含量比较稳定，因此，成为评价水质富营养化水平的主要水质指标。

2 叶绿素测定新方法本文是根据《中国湖泊富营养调查规范》、《水与废水标准检验方法》第四版等资料提供的操作方法，在不改变原方法的基础上，对含藻水样经过过滤浓缩、冷冻萃取、超声波振动、再对离心后的水样进行再过滤，通过分光光度计测定萃取液中叶绿素的浓度。

通过反复试验，取得了较好的试验结果。

同原方法相比较，叶绿素测定含量提高了11.8%～23.3 %。

3 实验原理和材料3.1 实验原理分光光度法测定水中叶绿素含量的原理是以有机溶剂丙酮溶液直接提取浮游生物浓缩样中的叶绿素，测定其吸光度，根据叶绿素a在特定波长的吸收，用公式计算其含量。

3.2 试剂（1）90%的丙酮溶液（2）1%的碳酸镁悬浊溶液（3）仪器设备及器皿1）过滤装置：过滤器，醋酸纤维滤膜（直径50mm，孔径0.45um）、真空泵2）台式医用离心机（最大转速4000r/min）、超声波仪、微漩涡器3）器皿：研钵，微孔滤膜、镊子、剪子、塑料离心管、10mL标准容量瓶4 测试方法的比较（方法Ⅱ为改进方法，方法Ⅰ为原有方法）叶绿素测试步骤为：浓缩___萃取___离心___分光光度测定。

实验报告植物体叶绿素含量的测定摘要：本实验采用分光光度法，利用95%乙醇提取菠菜叶片中和番茄叶片中叶绿体色素，叶绿素a ，叶绿素b 和类胡萝卜素最大吸收峰的波长分别是665nm 、649nm 和470nm 。

根据分光光度计测定的吸光度值，从而计算出乙醇提取液中叶绿体色素含量。

实验原理：利用95%乙醇提取叶绿体色素，叶绿素a ，叶绿素b 和类胡萝卜素最大吸收峰的波长分别是665nm 、649nm 和470nm 。

根据分光光度计测定的吸光度值，可以计算出乙醇提取液中叶绿体色素含量。

实验目的：掌握分光光度计法对叶绿素a 、叶绿素b 、叶绿素总浓度和类胡萝卜素总浓度测定和计算的方法。

实验材料：生物材料：菠菜叶片0.25g ，自己培养的全素番茄苗叶片0.2g ，缺磷番茄苗叶片0.2g ；试剂：95%乙醇、石英砂、碳酸钙；仪器：分光光度计、电子天平、研钵、漏斗、玻璃棒、小烧杯、10ml量筒、50ml 容量瓶、剪刀、滤纸、滴管。

实验步骤：1.叶绿体色素的提取取新鲜菠菜叶片0.25g ，擦干，去中脉，剪碎放入研钵，加入少许石英砂和CaCO 3，再加入95%乙醇3ml,研磨成匀浆，再加95%乙醇10ml ，静置10min ，用漏斗滤去残渣，用乙醇反复冲洗研钵、残渣至无色；用容量瓶定容至50ml 。

2.吸光度的测定取光径1cm 比色杯，注入上述叶绿素提取液，以95%乙醇注入另一同样的比色杯内作为空白对照，在波长665、649、和470nm 下测定吸光度。

3.结果计算依据下列计算公式，分别计算出叶绿素a 、B 的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的浓度。

C a （叶绿素a ）=13.95A 665 – 6.8A 649C b （叶绿素b ）=24.96A 649 – 7.32A 665C T （叶绿素）=C a +C b =18.16A 649 + 6.63A 665C x.c （类胡萝卜素）=(1000A 470 – 2.05C a -114.8C b )/248叶绿体色素含量 = ）样品鲜重（稀释倍数）提取液体积（）色素浓度（g /mg ⨯⨯L L实验结果：菠菜叶片提取液吸光值：1、测定叶绿素ab为什么选用红光波长？叶绿素吸收红光和蓝紫光，故有两个吸收峰，光合色素还有类胡萝卜素，只吸收蓝紫光，所以不能选蓝紫光区测定，否则被类胡萝卜素干扰，只能用红光。

一、实验目的1.了解植物组织中叶绿素的分布及性质。

2.掌握测定叶绿素含量的原理和方法。

二、实验原理叶绿素广泛存在于果蔬等绿色植物组织中，并在植物细胞中与蛋白质结合成叶绿体。

当植物细胞死亡后，叶绿素即游离出来，游离叶绿素很不稳定，对光、热较敏感；在酸性条件下叶绿素生成绿褐色的脱镁叶绿素，在稀碱液中可水解成鲜绿色的叶绿酸盐以及叶绿醇和甲醇。

高等植物中叶绿素有两种：叶绿素a 和b ，两者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。

叶绿素的含量测定方法有多种，其中主要有：1.原子吸收光谱法：通过测定镁元素的含量，进而间接计算叶绿素的含量。

2.分光光度法：利用分光光度计测定叶绿素提取液在最大吸收波长下的吸光值，即可用朗伯—比尔定律计算出提取液中各色素的含量。

叶绿素a 和叶绿素b 在645nm 和663nm 处有最大吸收，且两吸收曲线相交于652nm 处。

因此测定提取液在645nm 、663nm 、652nm 波长下的吸光值，并根据经验公式可分别计算出叶绿素a 、叶绿素b和总叶绿素的含量。

三、仪器、原料和试剂仪器分光光度计、电子顶载天平(感量0．01g)、研钵、棕色容量瓶、小漏斗、定量滤纸、吸水纸、擦境纸、滴管。

原料新鲜(或烘干)的植物叶片试剂1. 96％乙醇(或80％丙酮)2. 石英砂3. 碳酸钙粉四、操作步骤取新鲜植物叶片(或其它绿色组织)或干材料，擦净组织表面污物，去除中脉剪碎。

称取剪碎的新鲜样品2g ，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及3mL95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10mL ，继续研磨至组织变白。

静置3～5min 。

取滤纸1张置于漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗，滤液流至100mL 棕色容量瓶中；用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。

用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。

直至滤纸和残渣中无绿色为止。

最后用乙醇定容至100mL ，摇匀。

取叶绿体色素提取液在波长665nm 、645nm 和652nm 下测定吸光度，以95％乙醇为空白对照。

分光光度法测定水中的叶绿素a分光光度法测定水中的叶绿素a1 检出限水样体积300 mL、使用1 cm比色皿时，叶绿素a的检出限为0.11 μg/L，测定下限为0.5 μg/L；叶绿素b的检出限为0.25 μg/L，测定下限为1.0 μg/L；叶绿素c的检出限为0.25 μg/L，测定下限为1.0 μg/L。

2 方法原理将一定量水样用玻璃纤维膜过滤，收集藻类，使用反复冻融法对藻类细胞进行破碎，用90%丙酮溶液提取叶绿素，根据叶绿素光谱依次测定750 nm、664 nm、647 nm、630 nm波长下的吸光度，计算叶绿素含量。

3 试剂和材料3.1 碳酸镁悬浊液：ω（MgCO3）= 1%，1.0 gMgCO3 100 mL纯水3.2 丙酮溶液：ψ（C3H6O）= 90%，900 mL丙酮加100 mL纯水3.3 盐酸溶液：c（HCl）=0.1 mol/L。

8.5 mL浓盐酸加入500 mL纯水，冷却后稀释至1000 mL。

4 仪器和设备4.1 抽滤装置4.2 滤膜4.3 具塞玻璃离心管4.4 水浴锅4.5 离心机：转速3000 ~ 4000 r/min4.6 分光光度计4.7 比色杯：3 cm5 水样采集5.1 水样采集采集500 ~ 1000 mL 水样于棕色玻璃瓶或深色塑料瓶中。

5.2 保存避光保存，低温运输，在-20℃以下的冰箱内保存，在25 d 内分析测试。

6 分析步骤6.1 清洗玻璃仪器所有玻璃仪器应该清洗干净，尤其避免酸性条件下引起的叶绿素a 的分解。

6.2 滤膜过滤每种测定水样取300 mL ，加入0.6 mLMgCO 3悬浊液，用滤膜过滤。

6.3 提取将滤膜转移至具塞试管，加少量碳酸镁粉末和10 mL 已水浴加热至50℃的90%丙酮溶液。

塞紧塞子并在管子外部罩上遮光物，充分震荡，避光提取4 h 。

6.4 离心提取完毕后，离心管置于离心机上4000 r/min 离心20 min ，取出离心管，用移液管将上清液移入刻度离心管中，塞紧塞子，4000 r/min 再离心10 min 。

分光光度法测定海水中叶绿素a的方法研究一、叶绿素a的重要性。

叶绿素a在海洋生态系统里那可是相当重要的角色。

它就像是海洋里的一个小太阳，是海洋植物进行光合作用的关键物质。

通过光合作用，海洋植物能制造出氧气，还能把二氧化碳固定下来。

这对于维持整个海洋生态系统的平衡，就像定海神针一样重要。

而且呢，叶绿素a的含量也能反映出海洋浮游植物的生物量，就像一个小指标，告诉我们海洋里这些小家伙们是多是少。

二、分光光度法的基本原理。

这个分光光度法呀，其实就是利用物质对不同波长光的吸收特性来进行分析的。

对于叶绿素a来说，它对特定波长的光有特殊的吸收情况。

就好像叶绿素a只喜欢某些颜色的光，不喜欢其他的，我们就可以通过测量它对这些特定光的吸收程度，来确定它在海水中的含量。

具体来说，当一束光穿过含有叶绿素a的海水样本时，叶绿素a会吸收一部分光，而未被吸收的光会被检测到，通过比较吸光度的大小，就能计算出叶绿素a的浓度啦。

三、测定的前期准备。

1. 样本采集。

采集海水样本可是个技术活。

要选择合适的采样地点，一般会在海洋里有代表性的区域，像一些浮游植物可能比较丰富的地方。

然后用专门的采水器，小心翼翼地把海水取上来，就像从大海这个大宝藏里取出一小份宝藏一样。

在采集过程中，要尽量避免样本受到污染，不然测出来的数据可就不准啦。

2. 样本保存。

采到样本后，得好好保存它。

通常会在样本里加入一些保护剂，就像给样本穿上一层保护衣，防止叶绿素a在保存过程中发生变化。

而且要尽快把样本带回实验室进行分析，就像对待一个急需救治的小病人一样，时间拖久了可就不好了。

四、测定过程。

1. 样本处理。

回到实验室后，首先要对样本进行处理。

这可能包括过滤等操作，把海水中的叶绿素a和其他杂质分离开来，让叶绿素a能单独接受检测。

这个过程就像是从一堆杂物里把我们想要的宝贝挑出来一样，得特别细心。

2. 选择合适的波长。

根据叶绿素a的吸收特性，要在分光光度计上选择合适的波长。