抵抗素成熟肽的制备及其对猪葡萄糖和脂肪代谢的影响

抵抗素成熟肽的制备及其对猪葡萄糖和脂肪代谢的影响　

白翠玲　，罗　丹　，刘艳芬　，陈绍红　，刘　铀　（１．广东海洋大学农学院，广东湛江５２４０８８；２．广东海洋大学生化中心，广东湛江５２４０８８）　

摘　要：为探讨抵抗素成熟肽对猪葡萄糖和脂肪代谢的影响，将猪抵抗素成熟肽（ＭＲ）编码序列克隆至　

ｐＥＴ一３２ａ（十），在大肠埃希茵中表达重组ＭＲ融合蛋白，并用Ｎｉ—ＮＴＡ亲和层析纯化。经肠激酶消化切除融　合蛋白，用Ｎｉ—ＮＴＡ分离ＭＲ。随后将１８头５月龄去势巴马香猪随机分为３个组，对照组肌肉注射生理盐　水０．５　ｍＩ　，试验ｌ组和２组分别肌肉注射２０　ｎｇ／ｋｇ和４０　ｎｇ／ｋｇ的ＭＲ，于注射后０、１、２、３、４、５　ｈ分别采　血，检测血清葡萄糖及脂肪代谢相关指标。结果表明，重组ＭＲ融合蛋白分子质量为２９　ｋｕ，切除融合蛋白　

的ＭＲ分子质量为１２　ｋｕ，纯化的ＭＲ浓度约３　ｍｇ／Ｉ　。给予外源性ＭＲ后，试验组猪血清葡萄糖显著高于　对照组（Ｐ＜０．０５）；脂蛋白酯酶活性亦有升高的趋势，但组间差异不显著（Ｐ＞０．０５）；两个试验组猪血清甘油　

三酯含量均显著降低，试验２组显著低于试验１组和对照组（Ｐ＜０．０５）；试验２组猪血清游离脂肪酸含量显　著高于试验ｌ组和对照组（Ｐ＜０．０５）。由此可见，抵抗素能抑制组织细胞的葡萄糖摄入，并通过提高脂蛋白　

酯酶活性促进甘油三酯分解，在调节机体能量代谢与能量平衡中发挥重要作用。　关键词：抵抗素成熟肽；葡萄糖代谢；脂肪代谢；猪　

中图分类号：￥８５２．２；￥８５８．２８　文献标识码：Ａ　文章编号：ｌＯＯ７—５０３８（２０１３）１卜００４６—０５　

抵抗素是一种富含半胱氨酸的分泌型蛋白质，　人和动物脂肪组织　】、肝脏　］、骨骼肌　ｊ、外周血单　

核细胞　。　、卵巢　等组织器官均有分布。抵抗素在　调节机体脂肪代谢和能量平衡中发挥着重要作用，　

饮食诱导或遗传性肥胖小鼠、肥胖症和２型糖尿病　患者血清抵抗素水平显著升高，并伴随胰岛素抵　

抗。。。　ｊ，可能是联系肥胖和２型糖尿病的纽带。大量　研究证实，机体能量代谢失调时，脂肪组织能分泌多　种细胞因子如抵抗素、肿瘤坏死因子（ＴＮＦ—ａ）、白细　

胞介素６（ＩＩ　一６）等　并引起肝脏、骨骼肌和脂肪组织　的胰岛素抵抗和代谢性炎症ｃ８］。　猪是生脂作用最强的动物之一，有关抵抗素在　

猪脂肪代谢中的作用尚不清楚。本研究旨在检测抵　抗素成熟肽对猪葡萄糖和脂肪代谢相关生化指标的　影响，为进一步阐明抵抗素的作用机制奠定基础。　

１材料与方法　

１．１　材料　

１．１．１　菌种与质粒　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５ａ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＩ　一２１　（ＤＥ３）、ｐＥＴ一３２ａ（十）、ｐＭＤ—ＲＥＴＮ由广东海洋大学　生化中心保存。　１．１．２　主要试剂　Ｅｘ　Ｔａｑ酶、Ｂ“ｍＨ　Ｉ、ＨｉｎｄⅢ、　ｄＮＴＰｓ（２．５　ｒｅｔｏｏｌ／Ｌ　ｅａｃｈ）、Ｔ４　ＤＮＡ连接酶、ＤＮＡ　

Ｍａｒｋｅｒ　ＤＩ　２　０００、ＤＬ　１５　０００、质粒抽提试剂盒、　

ＤＮＡ片断纯化回收试剂盒均为大连宝生物公司产　品；低分子量蛋白质标准、低分子预染蛋白质Ｍａｒｋ—　

ｅｒ、Ｎｉ　ＮＴＡ亲和层析树脂购自鼎国生物科技有限　

公司；葡萄糖（ＧＩ　Ｕ）、甘油三酯（ＴＧ）、总胆固醇　

（ＴＣ）、高密度脂蛋白（ＨＤＩ　）、低密度脂蛋白（Ｉ　ＤＩ　）、　脂蛋白脂酶（Ｉ　ＰＩ　）、游离脂肪酸（ＦＦＡ）测定试剂盒　

为南京建成生物工程研究所产品。　１．２　方法　１．２．１　ＭＲ重组表达质粒的构建　根据猪ＲＥＴＮ　基因序列设计合成引物Ｐ１和Ｐ２。Ｐ１中含有肠激　酶识别序列（划线部分）和ＢａｍＨ　Ｉ酶切位点（斜　体），Ｐ２含有ＨｉｎｄＨＩ识别序列（斜体），Ｐｌ：５＇－ＧＣＧ—　

ＧＡＴＣＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＴＧＧＧＧＴＡＡＧＴ　ＣＴＴＴＧＴＧＴＣＣＡＧＴＴ一３　，Ｐ２：　５｜＿ＧＣＡＡＧＣ丁丁Ｃ—　

ＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＴＣＡＡＴＣＴＡＣＡＡＣＡＴＣＴＡＧ　Ａ—　ＣＣＧＧＴ一３　。以ｐＭＤ—ＲＥＴＮ为模板，用ＰＣＲ扩增　猪抵抗素成熟肽（ＭＲ）编码序列。扩增产物用　

ＢａｒｎＨ　Ｉ和Ｈｉｎｄ　ｍ消化，电泳纯化，克隆至ｐＥＴ一　

３２ａ（十）表达载体，用于转化ＢＩ　一２１（ＤＥ３）感受态细　

收稿日期：２ｏ１３　０５—２８　基金项目：广东海洋大学人才引进项目（０６１２０５３）　作者简介：白翠玲（１９８７一），女，河南开封人，硕士研究生，主要从事动物营养免疫的研究；罗　丹（１９８５一）．女，湖南长　沙人，

硕士研究生，主要从事动物营养免疫的研究。△同等贡献作者。＊通讯作者　４８　动物医学进展２０］３年第３４卷第１１期（总第２４５期）　

９７ｈ　６６ｋｕ　５３ｋｕ　

３６ｋ－ｕ　

２４】ｃＩｌ　

Ｍ。蛋白质分子量标准；１．ＭＲ融合蛋白酶切产物；２．纯化的ＭＲ　Ｍ．Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　Ｍａｒｋｅｒ；１．Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆ　ＭＲ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ；２．Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ＭＲ　图３　ＳＤ　ＰＡＧＥ检测ＭＲ纯化产物　Ｆｉｇ．３　ＳＤＳ—ＰＡＧＥ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ＭＲ　２．４　ＭＲ对猪葡萄糖和脂肪代谢相关指标的影响　

２．４．１　ＭＲ对猪血清葡萄糖水平的影响　注射　ＭＲ后，血清ＧＬＵ含量始终高于对照组，给药２　ｈ　后血糖水平达到峰值，且呈现明显量效关系；给药５　ｈ后，两个实验组ＧＬＵ水平仍略高于对照组（表１）。　

提示外源性ＭＲ能显著抑制组织细胞葡萄糖摄入，　提高血糖水平。　２．４．２　ＭＲ对脂肪代谢相关指标的影响　给予外　

源抵抗素成熟肽１　ｈ后，试验２组猪血清ＴＧ含量即　

显著低于对照组和试验１组（Ｐ％０．０５），此后，两个　试验组ＴＧ水平始终显著高于对照组，试验２组也　显著低于１组。提示抵抗素能显著促进甘油三酯分　

解成脂肪酸和甘油。从血清ＦＦＡ水平来看，试验２　组猪血清ＦＦＡ水平在给药后２　ｈ显著升高，且整个　

试验期均显著高于对照组和低剂量组（Ｐ＜０．０５），　试验１组血清ＦＦＡ含量与对照组相仿。注射ＭＲ　对猪血清ＴＣ、ＨＤＬ、ＬＤＬ水平影响不大，各组间差　

异不显著（Ｐ＞０．０５）（表２）。　表１　ＭＲ对猪血清ＧＩ　ｕ水平的影响　Ｔａｂｌｅ　１　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＭＲ　ｏｎ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ＧＩ　Ｕ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｍｍｏｌ／Ｉ　

注：同列数据标注不同字母者表示差异显著（Ｐ＜０．０５）。　Ｎｏｔｅ：Ｄａｔａ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｃｏｌｕｍｎ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｌｅｔｔｅｒｓ　ｍｅａｎ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ（Ｐ＜Ｏ．０５）　

表２　ＭＲ对猪血清ＴＧ、ＴＣ、ＦＦＡ、ＨＤＩ　和ＬＤＬ含量的影响　Ｔａｂｌｅ　２　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＭＲ　ｏｎ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ＴＧ，ＴＣ，ＦＦＡ，ＨＤＩ　ａｎｄ　ＬＤＬ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｍｍｏｌ／［　

注：同列数据标注不同字母者表示差异显著（Ｐ＜ｏ．０５）。　Ｎｏｔｅ．Ｄａｔａ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｃｏｌｕｍｎ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｌｅｔｔｅｒｓ　ｍｅａｎ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ（Ｐ＜０．０５）．　２．４．３　ＭＲ对猪血清中Ｉ　ＰＬ活性的影响　给予高　对照组和试验ｌ组（表３）；说明外源ＭＲ能通过提　剂量ＭＲ后，猪血清ＬＰＬ活性呈上升趋势，给药后　高ＬＰＩ　活性促进甘油三酯分饵；血清ＴＧ、ＦＦＡ含　

２　ｈ，血清ＬＰＩ　活性达到高峰，且试验期内始终高于　量的变化与此相符。

　白翠玲等：抵抗素成熟肽的制备及其对猪葡萄糖和脂肪代谢的影响　４９　

３讨论　

抵抗素是抵抗素样分子家族（ｒｅｓｉｓｔｉｎ—ｌｉｋｅ　ｍｏ—　ｌｅｃｕｌａｒｓ，ＲＥＬＭｓ）的重要成员，研究证实在饮食诱　

导或遗传性肥胖小鼠中抵抗素水平显著升高，葡萄　糖耐受性、胰岛素敏感性降低［１　；抵抗素能下调葡　

萄糖转运蛋白４（ＧＬＵＴ一４）表达，抑制胰岛素诱导的　

骨骼肌细胞葡萄糖摄人，产生胰岛素抵抗＿３］。２型　

糖尿病患者血清抵抗素、体重指数、腰围、血糖以及　

胰岛素抵抗水平显著高于正常人，但体重超标似乎　与抵抗素水平无明显相关性［７］。但有学者认为，肥　

胖患者血清抵抗素水平与上述指标关系不大，而与　

应激反应蛋白（ＣＲＰ）和肿瘤坏死因子（ＴＮＦ—ａ）水平　呈正相关　。　

本研究结果表明，外源性抵抗素能提高猪血清　

ＬＰＬ活性，促进甘油三酯分解为脂肪酸和甘油，使　血清ＦＦＡ水平升高，进而导致组织细胞能荷水平升　

高，葡萄糖摄入减少，血糖升高，从而使机体表现胰　

岛素抵抗，但抵抗素作用的机制有待进一步研究。　动物脂肪组织不仅是机体能量储藏场所，同时　

也是重要的内分泌器官，在机体能量代谢、炎症反应　和免疫应答中发挥重要作用＿ｌ１　。机体能量代谢紊　

乱、脂质过度沉积能诱发以炎性细胞因子分泌为主　

要特征的慢性代谢性炎症，抵抗素是重要的促炎因　子之一［１　。研究证实，抵抗素能通过Ａｋｔ和　

ＡＭＰＫ信号通路介导促胰岛素肽（ＧＩＰ）调解ＬＰＬ　

活性，调解３Ｔ３一Ｌ１细胞葡萄糖摄入，而在抵抗素敲　

除的３Ｔ３一Ｌ１脂肪细胞中，ＡＭＰＫ信号通路中的　ＪＮＫ途径的磷酸化、ＴＮＦ—ａ及其受体表达水平显著　下降口　，提示抵抗素能作为促炎因子调节脂肪细胞　

的能量代谢与炎症反应；抵抗素促进脂多糖（ＬＰＳ）　

诱导的炎性因子分泌，加剧肝脏炎症反应口。　；致病　

性大肠埃希菌感染的小鼠肠道抵抗素表达显著升　

高，抵抗素基因敲除的小鼠ＣＤ４　Ｔ细胞分泌的炎　

性细胞因子ＩＬ一１７显著减少，用抵抗素样分子处理　感染小鼠后，肠道炎症反应加重，ＩＬ一１７分泌增加，　进一步证实抵抗素能加剧机体的炎症反应［－１４］。　

研究表明，抵抗素也能通过抑制Ａｋｔ信号通路　

和ＥＲＫ１／２途径磷酸化作用于下丘脑，抑制胰岛素　体３　物芏并考　受号达底　体参ｍ　嘲　嘲　刚　嘲　嘲　踟　

嘲　５Ｏ　动物医学进展２０１３年第３４卷第１１期（总第２４５期）　

Ｋｉｍ　Ｓ　Ｊ，Ｎｊａｎ　Ｃ，Ｍｃｌｎｔｏｓｈ　Ｃ　Ｈ．Ｒｅｓｉｓｔｉｎ　ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｍｉｃｅ　ｅｘ—　ｈｉｂｉｔ　ｉｍｐａｉｒｅｄ　ａｄｉｐｏｃｙｔｅ　ｇｌｕｃｏｓｅ——ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ　ｐｏｌ—　ｙｐｅｐｔｉｄｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＧＩＰＲ）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ￣．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２０１３，６２　（２）：４７１—４７７．　Ｂｅｉｅｒ　Ｊ　１，Ｇｕｏ　ｌ　Ｐ，Ｍｏｎｔｆｏｒｔ　Ｃ　Ｖ，ｅｔ　ａ１．Ｎｅｗ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｒｅｓｉｓｔｉｎ　ｉｎ　ｌｉｐ０ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒ１ｄｅ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ｌｉｖｅｒ　ｄａｍａｇｅ　ｉｎ　ｍｉｃｅ［ｊ］．　ｊ　Ｐｈａｒｍａｃｏ１　Ｅｘｐ　Ｔｈｅｒａ，２００８，３２５（３）：８Ｏ１－８０８．　［１４］　

［１　５］　Ｏｓｂｏｒｎｅ　Ｉ　Ｃ，Ｊｏｙｃｅ　Ｋ　Ｉ　，Ａｌｅｎｇｈａｔ　Ｔ，ｅｔ　ａ１．Ｒｅｓｉｓｔｉｎ—ｌｉｋｅ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｓ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　Ｔｈｌ　７　ｃｅｌｌ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ａｎｄ　ｂａｃ—　ｔｅｒｉａｌ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９０　（５）：２２９２－２３００．　Ｂｅｎｏｍａｒ　Ｙ，Ｇｅｒｔｌｅｒ　Ａ，Ｄｅｌａｃｙ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．Ｃｅｎｔｒａｌ　ｒｅｓｉｓｔｉｎ　ｏ—　ｖｅｒｅｘｐｏｓｕｒｅ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ｉｎｓｕｌｉｎ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｈｒｏｕｇｈ　Ｔｏｌｌ——ｌｉｋｅ　ｒｅ　。　ｃｅｐｔｏｒ　４［Ｊ３．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２０１３．６２（１）：ｌ０２　１１４．