t l诱导分化成熟脂肪细胞方案

3T3-L1 前体脂肪细胞诱导分化小结1、诱导液配制先配母液：IBMX（0.5 mM）碱性溶液或乙醇溶解，由于下面的Dex 需要用乙醇溶解，所以这里建议用碱性溶液溶解，因为乙醇对细胞分化有影响（可以查到相关文献）。

100×母液配制：0.0115 g IBMX + 940 µl dd H2滤膜过这只是1 ml体积，你可以按照比例多配些。

保存温度我记不清了，你自己查一下。

Dex (1 µM)配制成1000×母液，-20 ℃保存Insulin (10 µg/ml, 比文献中报道的浓度高，可能是我买的胰岛素是分装的，效价比他们的低些，你可以稍微摸索一下)配制成300×母液溶于pH 2-3 0.22µm滤膜过滤除菌，用PCR小管分装，-20以上母液配好后，下面来配诱导液：诱导液Ⅰ：59 ml DMEM（10% FBS）+ 600 µl IBMX + 200 µl Insulin + 60 µl Dex再加140 µl DMEM 补齐到60 ml诱导液Ⅱ：59 ml DMEM（10% FBS）+ 200 µl Insulin再加800 µl DMEM 补齐到60 ml注：“59 ml DMEM”可以用20 ml或30 ml注射器加比较方便。

最终浓度：IBMX 0.5 mMDex 1 µMInsulin10 µg/ml2、诱导分化程序按照经典的“鸡尾酒”法进行诱导分化，稍微改动点，具体细节自己把握。

一般第5天可以看到明显脂滴，第8-10天左右，能有90%左右的分化率。

未分化的3T3-L1 第5天以上所述，仅供参考。

许多细节自己可以根据实验结果来摸索调整。

提前大家实验顺利，新年快乐！xiaoma44。

诱导分化成熟脂肪细胞方案集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]Sigma的试剂：IBMX（Sigma I-7018)Dexamethasone (Sigma D-4902)Insulin (Bovine; Sigma I-5500)gibco血清：小牛血清 (GibcoBRL-Cat#16170-078/Lot #1060198)胎牛血清(GibcoBRL-Cat# 10437-028/Lot # 1026566)培养基DMEM;（GibcoBRL-Cat# 11965-084）MEM Sodium Pyruvate (100mM; GibcoBRL Cat#11360-070)Pen/Strep/Glutamine (100x P/S/G; GibcoBRL Cat#10378-016)一: 本次3T3-L1细胞共一25cm3培养瓶消化后传代分为2个10cm培养皿， 3天后每个10cm皿分别传代3个10cm皿。

共6个10cm皿，将其中5个皿细胞冻存于-80°，将一个10cm皿中3t3-l1细胞分别接种于一个6孔板一个12孔板其中4孔和2个10cm皿，待2个10cm皿中细胞铺满90%后消化冻存于-80。

二：6孔板和12孔板4孔即将用于分化。

两者均在细胞铺满90%左右接触抑制2d开始加诱导剂，诱导方案严格按照之前计划的施行，诱导剂①培养2d后换为诱导剂②培养2d，后换诱导剂③培养，以后每48h换液，均采用诱导剂③，8天左右即可看到脂滴，此次整个诱导过程共用14天，出脂滴后继续48h换液，目的主要是获得更多的脂肪细胞。

三：3t3-l1诱导分化过程整体较为顺利，之前考虑到的诸如细胞可能贴壁不牢，易漂浮的情况基本未出现（漂浮很少），诱导剂配置过程中由于剂量极低，担心的浓度不准问题，后证明对分化影响不是很大。

一、诱导液配制1、4,3-异丁基-1-甲基黄嘌呤溶液（IBMX）配制。

3T3-L1 Differentiation ProtocolStep 1: 3T3-L1细胞传代于35或60-mm培养板中，使用DMEM-F12培养基培养2 day（以此为基点，即：诱导分化的第0 day）。

Step2: 使用诱导液I诱导3T3-L1分化。

加入配制好的诱导液I于3T3-L1细胞中，培养2 day（诱导分化的第2 day）。

诱导液I：0.5m M IBMX;0.25 μM地塞米松；1μg/ml insulin;含10% FBS 的DMEM-F12。

Step3: 使用无血清培养基清洗细胞，去除残余的IBMX和地塞米松。

使用诱导液II诱导细胞分化，并培养2 day （诱导分化的第4 day）。

诱导液II：1μg/ml insulin;含10% FBS 的DMEM-F12。

Step4: 最后用普通DMEM-F12培养基培养并每2 day 换一次液。

Step5: 每次实验前，用serum-free DMEM-F12 或KRP buffer 培养单层细胞2 h。

Step6: 用于实验的脂肪细胞应该在诱导分化后的8-12 day之间为宜。

这样的条件下≥ 95%的细胞表现为脂肪细胞的表型。

Step7: Oil Red O staining鉴定分化后的脂肪细胞内的脂质，可以使用油红染色。

细胞用PBS轻轻冲洗2次，使用10 %的formalin或4% paraformaldehyde 室温固定30 min。

固定后的细胞使用新配制的Oil Red O solution 染色（注意避光）1 h，之后只用蒸馏水轻轻冲洗3次，最后观察结果。

Oil Red O solution 配制：0.5%（W/V）的Oil Red O-异丙醇溶液。

取0.5%的Oil Red O-异丙醇溶液6份，加入4份的蒸馏水，配制成Oil Red O solution。

Step8: 获得结果并进行后期处理。

Other protocol can be used:美国密歇根大学的3T3-L1细胞分化的PROTOCOL(非常详细)3T3-L1 Differentiation ProtocolMATERIALSDulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM; GibcoBRL-Cat# 11965-084: high glucose, with L-glutamine, with pyroxidine HCl, without sodium pyruvate)Calf Serum (GibcoBRL-Cat#16170-078/Lot #1060198)Fetal Bovine Serum (GibcoBRL-Cat# 10437-028/Lot # 1026566)-filter sterilize (0.22um filter) before mixed into DMEMIsobutylmethylxanthine (IBMX; Sigma I-7018)Dexamethasone (Sigma D-4902)Insulin (Bovine; Sigma I-5500)MEM Sodium Pyruvate (100mM; GibcoBRL Cat#11360-070)Pen/Strep/Glutamine (100x P/S/G; GibcoBRL Cat#10378-016)SOLUTIONS10% Calf Serum/DMEM60mL Calf Serum6mL 100mM MEM Sodium Pyruvate6mL 100x P/S/G500mL DMEM10% FBS/DMEM60mL Fetal Bovine Serum (Filter Sterilized)6mL 100mM MEM Sodium Pyruvate6mL 100x P/S/G500mL DMEMIBMX Solution (make fresh)a)Dissolve IBMX in a solution made of 0.5N KOH to a final concentration of 0.0115g/mL.b)Filter sterilize through a 0.22 mm syringe filter.Insulin Stock Solution167 uM (1mg/mL) in 0.02M HClFilter sterilized through 0.22 mm filterCan store at -20C for long term, 4C short term.Dexamethasone Stock SolutionsFreezer Stock: 10mM of Dex in 100% ethanol (store at -20C)Working Stock: Dilute Freezer stock to 1mM in PBSFilter sterilize and store at 4C.MDI Induction Media (10mL/10cm plate; 5mL/6cm plate)To required volume of 10% FBS/DMEM add:1:100 IBMX1:1000 Insulin1:1000 Dexamethasone working stockInsulin Media (10mL/10cm plate; 5mL/6cm plate)To required volume of 10% FBS/DMEM add:1:1000 InsulinMETHODPreadipocyte maintenance and passage:We plate the cells in 10% CS/DMEM on treated polystyrene culture dishes from Corning (Cat#430167) and incubate them at 37C in 10% CO2. It is important to feed the preadipocytes every couple of days and avoid letting them get too confluent (>70%), if you want to continue to passage them and differentiate them at a later date. So, take care to split them appropriately. They can be split as far as 1:15, though we usually do 1:10 or less depending on need.Adipocyte Differentiation Protocol:1. Grow preadipocytes to confluency in 10% calf serum/DMEM2. Two days post confluency (DAY 0) stimulate the cells with MDI induction media. You will notice a distinct change in the morphology of the cells (become more spindly) in the next 2 days.3. Two days after MDI (DAY 2) change the media to Insulin Media. The media will begin to get more viscous as free fatty acids are produced by the cells and secreted into the media.4. Two days later (DAY 4) change media to 10% FBS/DMEM. Feed cells with 10%FBS/DMEM every two days. Full differentiation is usually achieved by DAY 8.。

3T3-L1 前体脂肪细胞诱导分化小结1、诱导液配制先配母液：IBMX（0.5 mM）碱性溶液或乙醇溶解，由于下面的Dex 需要用乙醇溶解，所以这里建议用碱性溶液溶解，因为乙醇对细胞分化有影响（可以查到相关文献）。

100×母液配制：0.0115 g IBMX + 940 µl dd H2滤膜过这只是1 ml体积，你可以按照比例多配些。

保存温度我记不清了，你自己查一下。

Dex (1 µM)配制成1000×母液，-20 ℃保存Insulin (10 µg/ml, 比文献中报道的浓度高，可能是我买的胰岛素是分装的，效价比他们的低些，你可以稍微摸索一下)配制成300×母液溶于pH 2-3 0.22µm滤膜过滤除菌，用PCR小管分装，-20以上母液配好后，下面来配诱导液：诱导液Ⅰ：59 ml DMEM（10% FBS）+ 600 µl IBMX + 200 µl Insulin + 60 µl Dex再加140 µl DMEM 补齐到60 ml诱导液Ⅱ：59 ml DMEM（10% FBS）+ 200 µl Insulin再加800 µl DMEM 补齐到60 ml注：“59 ml DMEM”可以用20 ml或30 ml注射器加比较方便。

最终浓度：IBMX 0.5 mMDex 1 µMInsulin10 µg/ml2、诱导分化程序按照经典的“鸡尾酒”法进行诱导分化，稍微改动点，具体细节自己把握。

一般第5天可以看到明显脂滴，第8-10天左右，能有90%左右的分化率。

未分化的3T3-L1 第5天以上所述，仅供参考。

许多细节自己可以根据实验结果来摸索调整。

提前大家实验顺利，新年快乐！xiaoma44。

TL诱导分化成熟脂肪细胞方案为了诱导分化成熟脂肪细胞，需要采取一系列措施来模拟体内脂肪细胞的发育过程。

下面是一个基于胎儿稳定细胞株人类成熟脂肪细胞系（ST-13）的方案，在富含小鼠成年体内碎屑坏死和抗生素的DMEM培养基中进行诱导分化。

1.培养脂肪前体细胞：将ST-13细胞接种于DMEM培养基中，并在37℃、5%CO2的条件下培养。

培养基需添加10%胎牛血清（FBS）和生长因子（如胰岛素、肾上腺皮质激素等），以促进细胞增殖和生长。

2. 诱导分化：当细胞生长到80%的密度时，将培养基更换为富含诱导因子的培养基，如胰岛素、胰高血糖素苷（IBMX）和去氧皮质酮（Dex）等。

让细胞在这样的培养基中继续培养48小时。

3.培养终分化脂肪细胞：将细胞培养基更换为富含10%FBS和高浓度胰岛素的DMEM培养基。

这样的培养条件可以帮助细胞继续分化成完全成熟的脂肪细胞。

4. 油红O染色：使用油红O染色方法来检测分化程度。

将细胞固定在4% paraformaldehyde中，然后用60%异丙醇洗涤。

将油红O溶液添加到细胞上，染色20分钟后洗涤。

观察细胞内的红色油滴，这是脂肪细胞特有的特征。

5.RT-qPCR：利用实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）来测量脂肪细胞特异基因表达水平。

收集分化脂肪细胞，提取总RNA，并合成cDNA。

使用特异性引物检测目标基因的表达水平，如脂肪细胞标记基因PPARγ和C/EBPα等。

6.蛋白质免疫印迹：用免疫印迹方法检测特定蛋白质的表达水平。

收集分化脂肪细胞，提取蛋白质，并进行电泳分离。

将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶上，然后用特异性抗体检测目标蛋白质的表达水平。

7. 脂肪细胞代谢测定：应用适当的测定方法来评估脂肪细胞代谢特性。

例如，使用改良的AdipoRed（泛素酯类）试剂，它可以选择性地结合脂肪细胞中的甘油三酯，以测定细胞的脂肪含量。

8. 细胞迁移和侵袭实验：测量分化脂肪细胞的迁移和侵袭能力，以评估其功能。

3t3-l1细胞诱导分化原理
3T3-L1细胞是一种常用的成纤维细胞株，可通过特定的诱导条件转分化为脂肪细胞。

其诱导分化的原理是通过连续培养和控制细胞外
环境，使细胞经历特定的分化过程。

首先，3T3-L1细胞会被培养在含有高营养的培养基中，其中含有高浓度的葡萄糖和羊血清。

这一步骤有助于细胞增殖和发育。

接下来，在细胞生长至达到密度的时候，减少培养基中营养物的浓度，同时添
加较低浓度的羊血清。

这种改变细胞外环境的操作有助于减少细胞增殖，促进细胞向分化方向发展。

然后，在细胞进入密集生长阶段之后，可以应用一种称为诱导剂
的物质来促使细胞向脂肪细胞分化。

常用的诱导剂有一种混合物，包
括二甲苯和异丙基甲基酰胺(DMI)。

这种物质可以诱导细胞内的转录因
子PPARγ和C/EBPα的表达，这两个转录因子在脂肪细胞分化中起到
关键作用。

最后，在细胞处于诱导剂作用下，可以观察到细胞的形态和特征
从成纤维样逐渐转变为脂肪细胞特征。

这包括细胞膜的变化、细胞内
脂滴的积聚以及与脂肪细胞相关的基因表达的增加。

综上所述，3T3-L1细胞的诱导分化原理主要包括通过调节细胞外环境和应用特定的诱导剂，促使细胞向脂肪细胞方向分化，并最终表
现出脂肪细胞特征。

首先细胞数一定要够，接触抑制后，加诱导液，诱导液一（IBMX是SIGMA的，浓度我用0.5m mol/l,配的时候用DMSO浓缩1000倍，DEX我用的是Solarbio分装的100MG的也用DMSO 溶，Ins我用的人用胰岛素，医院买的），最主要的是要细胞代数20代以内，换诱导液2时不用1ML的移液枪加用200ul的慢慢加.让细胞长满以后，接触抑制2天（是细胞退出生长周期），加入含有IBMX（一般使用浓度0.5mmol/L），DEX（地塞米松，一般使用浓度是1umol/L）和insulin（胰岛素，一般使用浓度1-10ug/ml）的培基2天，再换成只含胰岛素的培基2天，然后每两天换液（普通培基）。

这是分化的步骤，但是最关键的是细胞的传代次数，我现在就在做诱导，细胞传代次数较多，分化率很低。

一般说不能超过20代，最好在10代以内。

诱导分化中，细胞的传代数和状态是最重要的。

诱导剂的配制IBMX(异丁基-甲基-黄嘌呤):分子量：222.2（Sigma:I5879）-20度保存用二甲基亚砜DMSO配制111.1mg/ml（0.5mol/L）储存液终浓度为0.5mmol/L,即每100ml培养液加100ul储存液。

DEX：分子量：392.5（Sigma:D4902）-20度保存用无水乙醇配制1mg/ml(2.5mmol/L)储存液终浓度为1umol/L,即每100ml培养液加40ul储存液。

可用2年。

Insulin：分子量：6000 ,4度保存原液为诺和灵R：400IU/10ml终浓度为10ug/ml,即每100ml培养液加600ul原液。

4度保存3T3-L1前脂肪细胞株的诱导分化1)将3T3-L1前脂肪细胞接种于培养板，用含10%小牛血清的高糖DMEM培液在37℃、5％CO2培养;2)待细胞长满至80-90%，融合2天（融合的意思是指让细胞接触抑制，就是长满后换液让其再长两天）后，加含终浓度为0.5mmol/L IBMX（储存液浓度0.5mmol/L）、终浓度为1umol/L(储存液浓度为1mg/ml(2.5mmol/L))DEX 和终浓度为10ug/ml的胰岛素的10%小牛血清高糖DMEM培养48h；（诱导剂临用时再加到培液中混匀）3)48h后换含终浓度为10ug/ml的胰岛素的10%小牛血清高糖DMEM培养液再培养48h，48h后再换10%小牛血清高糖DMEM继续培养，2天后换培养液一次，诱导分化8～12天3T3-L1细胞90%多呈成熟脂肪细胞表型，可用于实验。

1.0 L(SH30021.01B, Hyclone) 2. 胎牛血清( Fetal Bovine Serum ，FBS)10%1%1 pmo/ L10 mol / L黄嘌呤0.5 mmol/L200 mol / L (ES-009-B, Millipore)(TMS-AB2C, CHEMICON ) 分子量：392.46(D4902-25MG, Sigma)分子量：5808(91077C—1g, Sigma)分子量：222.24( I5879-100MG, Sigma)分子量：357.79(I7378 —5G, Sigma)脂肪干细胞成脂诱导及鉴定程序、试剂准备一）成脂分化诱导液（Adipogenic Medium, AM ）配方【1】：试剂名称浓度商品信息1. 极限必须培养基(Dulbecco 'S Modified Eagle Medium，DMEM)二）成脂分化诱导液浓储液配制试剂名称f=p 曰.质量浓缩倍数配制方法1. Stock A 分装1ml/管X100胎牛血清1ml/ 管1X( liquid )保存：-20C2. Stock B 分装0.1ml/管X100青霉素/ 链霉素0.1ml/ 管100X( liquid )保存：-20C3. Stock C 溶于30ml 无水乙醇（0.1%）地塞米松0.0117738 g 1000X 分装0.1ml/管X300保存：-20C4. Stock D 溶于10ml Hcl(0.1 mol/L ，PH2.0)胰岛素0.05808 g 100X 分装0.1ml/管X100保存：4C5. Stock E 溶于 2.5ml DMSO(0. 5%)3-异丁基-1 -甲基黄嘌呤0.05556 g 200X 分装0.05ml/EP 管X50保存：-20C6. Stock F 溶于2ml 无水乙醇（0.2%）吲哚美辛0.07155 g 500X分装0.02ml/ 管X100 保存：-20C （三）成脂分化诱导液工作液配制（10ml）1. 取DMEM（L）8.72ml 加入15ml 离心管（BD ）2. 加1 管Stock A（1ml）；3. 加1 管Stock B（0.1ml）；4. 取1 管Stock C （0.1ml）溶解，加入0.01ml ;5. 加1 管Stock E（0.05ml）；6. 加1 管Stock F （0.02ml）;7. 加1 管Stock D （0.1ml）;8. 测渗透压，调pH7.2-7.4;9. 0.22 m微孔过滤，4C贮存，一周内使用。

T新编L诱导分化成熟脂肪细胞方案近年来，肥胖已经成为全球范围内的重要公共健康问题。

肥胖与多种疾病，如心血管疾病、糖尿病和一些癌症等密切相关。

因此，寻找一种新编的诱导分化成熟脂肪细胞的方案具有重要的临床和研究意义。

首先，我们可以选择细胞培养中常用的3T3-L1细胞系，这是一种已广泛应用于脂肪细胞分化研究的成熟细胞系。

3T3-L1细胞系分为原始细胞（pre-adipocytes）和已分化成的脂肪细胞（mature adipocytes）。

因此，通过处理原始细胞，我们可以诱导它们分化为成熟的脂肪细胞。

其次，我们需要选择适当的培养基。

在脂肪细胞分化过程中，两个培养基是必需的：增殖培养基和分化培养基。

增殖培养基通常包含高浓度的蔗糖、胰岛素和亲和性变性血清（fetal bovine serum）等成分，以促进细胞增殖。

当细胞达到足够密度后，我们可以切换到分化培养基。

分化培养基中，常见的成分有胰岛素、去甲肾上腺素、磷酸甘油酯等，这些成分可以诱导原始细胞分化为脂肪细胞。

此外，我们还可以添加一些维生素和矿物质等成分，以提高细胞分化效率。

第三，为了增加诱导分化成熟脂肪细胞的效率，我们可以采用一些药物或生物活性物质。

例如，我们可以使用最常用的诱导分化剂DMEM （dexamethasone）、IBMX（3-isobutyl-1-methylxanthine）和胰岛素。

DMEM具有抗炎和抗异种反应等多种作用，可以促进脂肪细胞的分化。

同时，IBMX也可以抑制脂肪酸摄取和降解，从而增加细胞内三酰甘油的积聚。

此外，胰岛素是另一个重要的诱导剂，可以促进脂肪细胞的分化和生长。

最后，为了验证脂肪细胞的分化效果，我们可以使用一些标记物来检测脂肪细胞的成熟程度。

例如，通过检测特定的脂肪细胞标志物，如脂肪酸结合蛋白（FABP4）和脂肪细胞多酯脂合酶（DGAT1），可以评估脂肪细胞的分化水平和功能。

此外，我们还可以使用油红O染色来观察细胞内三酰甘油的积聚情况，从而判断脂肪细胞的成熟程度和数量。

Sigma的试剂：IBMX（Sigma I-7018)Dexamethasone (Sigma D-4902)Insulin (Bovine; Sigma I-5500)gibco血清：小牛血清 (GibcoBRL-Cat#16170-078/Lot #1060198)胎牛血清(GibcoBRL-Cat# 10437-028/Lot # 1026566)培养基DMEM;（GibcoBRL-Cat# 11965-084）MEM Sodium Pyruvate (100mM; GibcoBRL Cat#11360-070)Pen/Strep/Glutamine (100x P/S/G; GibcoBRL Cat#10378-016)一: 本次3T3-L1细胞共一25cm3培养瓶消化后传代分为2个10cm培养皿， 3天后每个10cm 皿分别传代3个10cm皿。

共6个10cm皿，将其中5个皿细胞冻存于-80°，将一个10cm皿中3t3-l1细胞分别接种于一个6孔板一个12孔板其中4孔和2个10cm皿，待2个10cm 皿中细胞铺满90%后消化冻存于-80。

二：6孔板和12孔板4孔即将用于分化。

两者均在细胞铺满90%左右接触抑制2d开始加诱导剂，诱导方案严格按照之前计划的施行，诱导剂①培养2d后换为诱导剂②培养2d，后换诱导剂③培养，以后每48h换液，均采用诱导剂③，8天左右即可看到脂滴，此次整个诱导过程共用14天，出脂滴后继续48h换液，目的主要是获得更多的脂肪细胞。

三：3t3-l1诱导分化过程整体较为顺利，之前考虑到的诸如细胞可能贴壁不牢，易漂浮的情况基本未出现（漂浮很少），诱导剂配置过程中由于剂量极低，担心的浓度不准问题，后证明对分化影响不是很大。

一、诱导液配制1、4,3-异丁基-1-甲基黄嘌呤溶液（IBMX）配制。

分子量222，几乎不溶于水，现配现用，过滤除菌。

100×母液（50mmol/L）： IBMX+940ul超纯水+60ul 1mol/L KOH。

T新编L诱导分化成熟脂肪细胞方案Document number [ 980KGB-6898YT-769T8CB-246UT-18GG08 ]Sigma 的试剂:IBMX (Sigma 1-7018)Dexamethasone (Sigma D-4902)Insulin (Bovine; Sigma I一5500)gibco 血淸:小牛血清(GibcoBRL-Cat#1617(H)78/Lot #1060198)胎牛血｝^(GibcoBRL-Cat# 10437-028/Lot # 1026566)培养基 DMEM; (GibcoBRL-Cat# 11965-084)MEM Sodium Pyruvate (lOOmM; GibcoBRL Cat#l1360-070)Pen/Strep/Glutamine (lOOx P/S/G; GibcoBRL Cat#10378-016)-：本次3T3-L1细胞共一 25cm3培养瓶消化后传代分为2个10cm培养皿，3天后每个lOcmllll分别传代3个lOcmllll。

共6个lOcmlillt将其中5个皿细胞冻存于-80° ,将一个10cm皿中3t3-ll细胞分别接种于一个6孔板一个12孔板其中4孔和2个10cm皿，待2 个10cm皿中细胞铺满90%后消化冻存于-80。

-：6孔板和12孔板4孔即将用于分化。

两者均任细胞铺满90%左右接触抑制2d开始加诱导剂，诱导方案严格按照之前计划的施行，诱导剂①培养2d后换为诱导剂②壻养2d.后换诱导剂③培养，以后每48h换液，均采用诱导剂③，8天左右即可看到脂滴.此次整个诱导过程共用14天，岀脂滴后继续48h换液，目的主要是获得更多的脂肪细胞。

三：3t3-ll诱导分化过程整体较为顺利，之前考虑到的诸如细胞可能贴壁不牢，易漂浮的情况基本未出现(漂浮很少).诱导剂配置过程中由于剂是极低.担心的浓度不准问题，后证明对分化影响不是很大。

人体脂肪干细胞培养及成骨诱导分化人体脂肪干细胞培养及成骨诱导分化引言干细胞是一类具有自我更新和多能性的细胞，可以不断分化生成各种不同类型的细胞。

人体脂肪组织中存在一种特殊类型的干细胞，即人体脂肪干细胞（human adipose-derived stem cells，hADSCs）。

与其他干细胞相比，hADSCs具有较高的抽取和培养效率，而且可以从自身脂肪组织中获得，不需要侵入性手术。

因此，hADSCs成为研究人体再生医学和组织工程领域的热门课题之一。

本文将介绍人体脂肪干细胞的培养方法以及成骨诱导分化的研究进展。

人体脂肪干细胞培养1. 来源和提取人体脂肪组织富含脂肪干细胞，因此从脂肪组织中提取hADSCs是最常用的方式之一。

提取过程通常通过脂肪抽吸或手术操作完成。

在脂肪抽吸中，通过低压吸引脂肪组织，并用特殊工具将其收集。

手术操作则需要进行小切口，直接收集脂肪组织。

提取得到的脂肪组织需要经过一系列处理，如洗涤、消化、离心等，以获得单个细胞悬浮液。

2. 培养条件提取得到的hADSCs需要在适宜的培养条件下进行扩增。

通常，使用营养丰富的培养基，如DMEM/F12，加入适量的胎牛血清和抗生素，以提供必需的生长因子和营养物质。

细胞培养的环境需要保持在37℃，5% CO2的恒温恒湿条件下。

培养过程中，需要定期更换培养基以保持细胞的生长和代谢活性。

3. 鉴定和鉴定为了确认提取得到的细胞为hADSCs，需要进行鉴定和鉴定。

常用的方法包括油红O染色、免疫细胞化学染色和流式细胞术分析。

油红O染色可用于检测细胞中脂滴的积累情况，免疫细胞化学染色可检测特定表面标记物的表达水平，流式细胞术则可对细胞表型进行全面的分析。

人体脂肪干细胞成骨诱导分化人体脂肪干细胞具有向多个细胞系分化的潜力，其中包括成骨细胞。

为了将hADSCs诱导分化为成骨细胞，需要在体外提供特定的诱导因子。

1. 前处理在进行成骨诱导前，需要对hADSCs进行适当的前处理。

专利名称：一种诱导人脐带间充质干细胞分化为脂肪样细胞的培养基及其诱导方法
专利类型：发明专利
发明人：何华秀
申请号：CN201510005681.5
申请日：20150106
公开号：CN104593323A
公开日：
20150506
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种诱导人脐带间充质干细胞分化为脂肪样细胞的培养基及其诱导方法。

该培养基含有葡萄糖、四氧化三铁纳米颗粒、胰岛素、青霉素、链霉素和L-DMEM培养基。

该诱导方法为：采用上述诱导培养基对间充质干细胞进行诱导分化培养即可。

本发明诱导培养基含有简单的诱导因子，不含有毒有害物质，更安全。

本发明诱导人脐带间充质干细胞分化为脂肪样细胞的方法，3天即可获得脂肪样细胞，7天可获得大部分成熟分化的脂肪样细胞，大大缩短了诱导分化时间；具有广阔的临床应用前景。

申请人：江苏三特生物科技有限公司
地址：213000 江苏省常州市天宁区恒生科技园二区16栋01号
国籍：CN
代理机构：广州嘉权专利商标事务所有限公司
代理人：胡辉
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首先细胞数一定要够，接触抑制后，加诱导液，诱导液一（IBMX是SIGMA的，浓度我用0.5m mol/l,配的时候用DMSO浓缩1000倍，DEX我用的是Solarbio分装的100MG的也用DMSO溶，Ins我用的人用胰岛素，医院买的），最主要的是要细胞代数20代以内，换诱导液2时不用1ML的移液枪加用200ul的慢慢加.让细胞长满以后，接触抑制2天（是细胞退出生长周期），加入含有IBMX（一般使用浓度0.5mmol/L），DEX（地塞米松，一般使用浓度是1umol/L）和insulin（胰岛素，一般使用浓度1-10ug/ml）的培基2天，再换成只含胰岛素的培基2天，然后每两天换液（普通培基）。

这是分化的步骤，但是最关键的是细胞的传代次数，我现在就在做诱导，细胞传代次数较多，分化率很低。

一般说不能超过20代，最好在10代以内。

诱导分化中，细胞的传代数和状态是最重要的。

诱导剂的配制IBMX(异丁基-甲基-黄嘌呤):分子量：222.2（Sigma:I5879）-20度保存用二甲基亚砜DMSO配制111.1mg/ml（0.5mol/L）储存液终浓度为0.5mmol/L,即每100ml培养液加100ul储存液。

DEX：分子量：392.5（Sigma:D4902）-20度保存用无水乙醇配制1mg/ml(2.5mmol/L)储存液终浓度为1umol/L,即每100ml培养液加40ul储存液。

可用2年。

Insulin：分子量：6000 ,4度保存原液为诺和灵R：400IU/10ml终浓度为10ug/ml,即每100ml培养液加600ul原液。

4度保存3T3-L1前脂肪细胞株的诱导分化1)将3T3-L1前脂肪细胞接种于培养板，用含10%小牛血清的高糖DMEM培液在37℃、5％CO2培养;2)待细胞长满至80-90%，融合2天（融合的意思是指让细胞接触抑制，就是长满后换液让其再长两天）后，加含终浓度为0.5mmol/L IBMX（储存液浓度0.5mmol/L）、终浓度为1umol/L(储存液浓度为1mg/ml(2.5mmol/L))DEX 和终浓度为10ug/ml的胰岛素的10%小牛血清高糖DMEM培养48h；（诱导剂临用时再加到培液中混匀）3)48h后换含终浓度为10ug/ml的胰岛素的10%小牛血清高糖DMEM培养液再培养48h，48h后再换10%小牛血清高糖DMEM继续培养，2天后换培养液一次，诱导分化8～12天3T3-L1细胞90%多呈成熟脂肪细胞表型，可用于实验。

细胞成脂或成骨诱导的具体方法及注意事项
一、技术简介
干细胞和祖细胞群体存在于多种成体组织中，包括皮肤、肌肉、骨髓和脂肪。

越来越多的研究表明这些细胞可能具有多系分化的潜能，能够生成除来源组织以外的细胞类型。

近年来，人们发现成体脂肪组织可作为间充质干细胞另外一个丰富的来源。

这残细胞被命名为脂肪来源的干细胞（ASCs)。

在特定的培养条件下，ASCs可诱导分化为多种间充质和神经类型细胞。

二、实验流程
成骨诱导培养液配备与诱导操作
1. 准备含10%FBS的α-MEM培养液。

2. 在备好的α-MEM培养液中添加50μM抗坏血酸，10mM β-磷酸甘油和
100nM地塞米松。

3. 准备6孔培养板，将细胞接种于原始α-MEM培养液。

4. 每三天换液一次，细胞长至7天时进行碱性磷酸酶染色。

5. 28天后再进行矿化结节的茜素红染色。

成脂诱导培养液配备与诱导操作
1. 配置PBS10%含量的HG-DMEM培养液。

2. 在配置完成的HG-MEM培养液中加入10μM地塞米松、10μg/ml胰岛素、200μM吲哚美辛和0.5mM IBMX。

3. 准备6孔培养板，将细胞接种于原始HG-MEM培养液中。

4. 待细胞长至基本融合后，更换上述制备完成的成脂诱导培养液培养2天，在用只含有10μg/ml胰岛素的成脂维持培养液培养1天，如初交换培养至14天，使用红油O染色。

三个方向诱导分化诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化一、诱导方法将细胞悬液置于50 mL聚苯乙烯培养瓶(Nunclon)中培养。

完全培养基中加入能诱导MSCs 向软骨细胞转化的诱导因子: (一致统一的诱导物质)转化生长因子β1 10ng/ml,（左旋）维生素C 50 mg/L(也有0.1mmol/L)地塞米松0.1nmol/L （也有10 nmol/L）ITS 50mg/ml丙酮酸钠1mmol/L亚油酸5.35ug/mg牛血清白蛋白1.25ng/ml。

倒置显微镜逐日（1－3 weeks）观察细胞生长情况。

细胞长成单层后进行传代。

细胞培养3周。

去除培养液,晾干,①细胞用通用Ⅱ型胶原检测试剂盒(晶美生物工程有限公司) 免疫组化，按试剂盒说明书操作；②用alcian blue 孵育5 min, 流水冲洗2 min ,麦氏苏木素复染5 min ,流水冲洗2 min ,晾干，显微镜下观察细胞的蛋白聚糖沉积。

或者用甲苯胺蓝染色，具体我也没做过，查到一篇文章中是这么说的：MSC成软骨诱导后的甲苯胺蓝染色检测：培养不同时间的MSC培养皿倒掉诱导培养液，10％甲醛固定lh，自来水冲洗15min，双蒸水冲洗1次，滴加1％甲苯胺蓝染液于培养皿内，染色3h，加人95％乙醇，洗去多余的染液，烘干，中性树胶封片。

诱导骨髓间充质干细胞成骨方向分化成骨诱导培养: 取第3代细胞, 接种入含体积分数为0.1 的新生牛血清、0.1 μmol/L 地塞米松、50 μmol/L 抗坏血酸、10 mmol/L β- 甘油磷酸钠的高糖DMEM培养基进行成骨诱导培养, 进行形态观察、功能检测。

间充质干细胞成骨特性检测:①碱性磷酸酶组织化学染色:取成骨诱导14 d 的细胞, 40 g/L 中性甲醛固定15 min, Gomori改良钙钴法染色。

取5 块玻片, 每片随机取2个视野, 采用网格计数法, 计算碱性磷酸酶染色阳性细胞的百分比。

:取第3 代细胞, 以1×105/ 孔的密度接种于6 孔板中, 分别成骨诱导3, 5, 7, 10, 12,14 d,按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测。