4 微生物反应动力学
教学基本内容：
微生物反应的特点；微生物反应的质量衡算，包括碳素衡算、碳源衡算、氧衡算；微生物反应的能量衡算。微生物反应动力学，包括生长动力学、基质消耗动力学和产物生成动力学
4.1 微生物反应的特点
4.2 微生物反应过程的质量与能量衡算
4.2.1 碳素衡算
4.2.2 碳源衡算
4.2.3 氧衡算
4.2.3 能量衡算
4.3 微生物反应动力学
4.3.1 生长动力学
4.3.2 基质消耗动力学
4.3.3 产物生成动力学
授课重点：
1. 微生物反应与酶促反应的比较。
2. 微生物反应式及微生物反应平衡式的概念。
3. 菌体实验化学式的概念与测定方法。
4. 微生物反应中的动力学变量。
5. 微生物反应的得率系数的概念。
6. 微生物反应的维持常数的概念。
7. 碳素衡算。
8. 碳源衡算。
9. 氧衡算。
10. 能量衡算。
11. 莫诺方程。
12. 产物的Gaden模型。
难点：
1. 微生物反应涉及到的动力学变量和参数远多于酶促反应。
2．微生物反应过程中碳源衡算、氧衡算和能量衡算间的关系。
3. 自由能消耗对菌体得率Y KJ的计算。
本章主要教学要求：
1. 理解微生物反应与酶促反应的区别。
2. 掌握菌体实验化学式的测定方法。
3. 掌握微生物反应式中系数的确定方法。
4. 掌握微生物反应中动力学变量及参数的数学定义。
5. 理解碳素衡算式。
6. 理解碳源衡算式。
7 理解氧衡算式。
8. 理解碳源衡算与氧衡算、能量衡算之间的内在联系。
9. 掌握有效电子转移的概念，掌握Y KJ的计算方法。
10. 了解生长模型的分类。
11. 理解莫诺方程与米氏方程的区别。掌握莫诺方程中动力学参数的测定方法。
12. 理解产物的Gaden模型。
4 微生物反应动力学
19世纪生物学家巴斯德坚持由糖变为酒精的发酵过程是由细胞产生的，而毕希纳却发现磨碎了的酵母仍能使糖发酵产生酒精，认为发酵是由活细胞产生的非生命物质引起的，称为酶。
可见微生物反应与酶促反应在催化作用的实质看是一致的。区别在于微生物反应过程是自催化过程，生物反应过程中出现菌体增殖；酶促反应过程中，酶只可能失活，不可能增多。 4.1微生物反应的质量能量衡算 4.1.1 微生物反应式
在微生物细胞中，包含的酶促反应成百上千，产物是否也是这样多呢？并非如此。这是由于一个反应的产物，又是另一个反应的基质，这样就形成了一条条代谢途径，如糖类代谢、脂类代谢、蛋白质代谢。由于存在精巧的代谢调控，如正反馈、副反馈，中间产物不会大量积累，最终大量积累的只是少数几种终产物。可见，我们不仅没有可能一个一个研究微生物细胞中的酶反应，也没这个必要。我们可采用黑箱的研究方法，只考虑其与外界环境的物质交换。因此，微生物反应过程可以用微生物反应式表示：
碳源 + 氮源 + O 2 菌体 + CO 2 + H 2O + 产物
与普通化学反应及酶促反应不同的是，在微生物反应式中，出现了菌体项。菌体可以用实验化学式来表示。我们来看微生物细胞的化学成分（见教材P 49表3－2）。在微生物细胞中，C 、H 、O 、N 四种元素含量占菌体干重的90%左右，因此可用实验化学式表示：C αH βN γO δ，通常令α＝1。
例1：细菌的化学元素测定结果是：碳元素含量(干重)53%，氢元素7.3%，氮元素12.0%，氧元素19.%，确定其化学式。
解：α = 1
65.1125313
.7==β
2.012
53140
.12==γ
27.012
53160
.19==δ
细菌的化学式：CH 1.65N 0.2O 0.27
表4-1 微生物的元素组成[1]
微生物反应式中各项系数的确定，部分通过实验测定，部分根据元素平衡计算确定。
例2：乙醇为基质，好氧培养酵母，反应式为
O eH dCO O N cCH bNH aO OH H C 225.015.075.13252++→++ 呼吸商6.0=RQ 。求系数a 、b 、c 、d 、e 。 解：已知 6.0==
a
d
RQ (1) 根据元素平衡式，有
C ： d c +=2 (2) H ： e c b 275.136+=+ (3) O ： e d c a ++=+25.021 (4) N ： C b 15.0= (5)
联立(1)~(5)式求解，得
a =0.364
b =0.085
c =0.564
d =1.436
e =2.634
所以，反应式为
O H CO O N CH NH O OH H C 225.015.075.13252634.2436.1564.0085.00364.0++→++
4.1.2 微生物反应动力学的研究特点
微生物反应动力学研究各种过程变量在活细胞作用下变化的规律，以及各种反应条件对这些过程变量变化速度的影响。必须注意，微生物反应动力学研究的对象既然时运动着的物质，就不能单纯地用传统的静态变量如质量、溶氧量、菌体量等等进行描述，而必须涉及到许多动态变量，如细胞比生长率、基质比消耗率、CO 比生成率、产物比生产率等等。这些动态变量一般不能直接测量，只能根据动力学方程式间接估计。
发酵过程的传统控制方法，是凭经验对一些静态变量如pH 、溶氧、残余基质浓度等按设定点进行孤立控制，它没有系统考虑各变量之间的内在联系，也未能反映发酵过程的动态特性，因而带有很大的局限性和盲目性。例如，pH 的控制可用加入酸、碱或者增加培养基中的缓冲成分，或者调节各种基质的补加率来维持生理酸、碱性物质的代谢平衡的方法在同一水平上实施，但可能出现截然不同的结果。又如，为了维持某一水平的基质浓度，采用高水平的碳、氮平衡补料或低水平的碳、氮平衡补料，必然产生大相径庭的结果。还有，以高菌体浓度、低生长率或低菌体浓度、高生长率达到同一溶氧水平，结果也大不相同。
要对发酵过程进行优化控制，必须了解达到高产所必须具备的生产菌株生长状态（生长速率、形态、浓度等），相应的基质和氧的需要率，以及各种发酵条件对这种生长状态和需要量的影响。由于发酵动力学是关于微生物生长率、基质和氧消耗率、产物合成率等动态变量之间关系以及它们与发酵条件之间关系的学问，因而掌握这些学问，就能更加系统（而不是孤立）、有效（而不是盲目）的驾驭这些发酵条件和动态变量，发酵过程的控制问题也就应刃而解了。
按发酵动力学原理对发酵过程进行优化控制，涉及到许许多多数据的采集、处理、综合、运算和参数估计，并要求具有实时性，这对于常规检测和控制手段来说是不可能做到的，必须采用在线检测技术和过程控制计算机。反过来，实施计算机系统对发酵过程的参数估计与动态优化控制，也必须以能够描述各变量变化速率之间关系的动力学方程（即数学模型）为基础。
发酵动力学研究的动态变量：
菌体生长比速 Xdt dX
=μ
基质消耗比速 Xdt dS
-=γ
产物生成比速 Xdt
dP
=π
O 2消耗比速 Xdt
O 2
O2d Q -
=
CO 2生成比速 Xdt
CO 2
CO2d Q =
式中X 为菌体浓度（菌体量通常以菌体干重表示），S 为基质浓度，P 为产物浓度。O 2代表O 2浓度，CO 2代表CO 2浓度。
4.1.3 微生物反应的得率系数
得率系数是对碳源等物质生成菌体或其他产物的潜力进行定量评价的重要参数。
表4－2 微生物反应的菌体得率与产物得率
得率系数
定义式
定义式（微分形式）
菌体得率 S X
Y S X ?-?=
/ dS dX
Y S X -=
/ 菌体得率常数 G
G S X
Y )(?-?=
G
G dS dX
Y )(-=
产物得率 S P
Y S P ?-?=/
dS dP
Y S P -=/
产物得率常数 P
P S P
Y )(?-?=
P
P dS dP
Y )(-=
相对氧的菌体得率 2/O X
Y O X ?-?=
2/dO dX
Y O X = 相对氧的菌体得率常数 G
GO O X
Y )(2?-?=
G
GO dO dX
Y )(2-=
相对氧的产物得率 2/O P
Y O P ?-?=
2/dO dP
Y O P -=
相对氧的产物得率常数 G PO O P
Y )(2?-?=
G PO dO dP
Y )(2-=
相对自由能的菌体得率 E X Y kJ ??=
例3 求例2中酵母细胞培养的S X Y /和O X Y /。 解：由例2中系数计算结果可确定微生物反应式为
O H CO O N CH NH O OH H C 225.015.075.13252634.2436.1564.0085.0394.2++→++
292.016
6212)
5.01615.01475.112(564.0/=++??+?++?=S X Y
176.032
394.2)5.01615.01475.112(564.0/=??+?++?=O
X Y
4.1.4 微生物反应的维持常数
碳源维持常数m ：单位质量的菌体单位时间内维持生存所需的碳源。 氧维持常数m o ：单位质量的菌体单位时间内维持生存所需氧气。 ATP 维持常数m ATP ：单位质量的菌体单位时间内维持生存所需ATP 。
4.1.5微生物反应过程的质量衡算 4.1.
5.1 碳素平衡
43221ααααdt dP dt dCO dt dX dt dS ++=??
?
??- (4-1) 或：43212πααμαγα++=CO Q (4-2) 式中：
α1 — 每摩尔基质中碳的含量（g/mol ），如葡萄糖α1= 72 α2 — 每克（干）菌体内碳的含量（g/g ），一般α2 = 0.5 α3 — 每摩尔二氧化碳中碳的含量（g/mol ），α3 = 12
α4 — 每摩尔产物中碳的含量（g/mol ），对乙醇α4 =24，对醋酸α4=24，对乳酸α4=36。
4.1.
5.2. 碳源恒算
在微生物反应过程中碳源主要消耗于：
(1) 满足于微生物菌体生长的需要，可用(?S)G 表示。 (2) 维持微生物生存的消耗，可用(?S)m 表示。
(3) 生成代谢产物的消耗，可用(?S)P 表示。
则有：
-?S = (-?S)G + (-?S)m + (-?S)P (4-3)
表示为微分形式，方程两侧同除dt ，得
P
m G dt dS dt dS dt dS dt dS ??? ??-+??? ??-+??? ??-=-
(4-4) 根据得率常数的定义，（4－4）式可变形为
??
?
??+?+??? ??=-
dt dP Y X m dt dX Y dt dS P G 11 (4-5) 两侧同除X ，得
πμγP
G Y m Y 1
1++=
(4-6) 在以培养微生物细胞为目的的微生物反应过程中，代谢产物的积累可以忽略
不计的情况下，(4-6)式可以简化为：
m Y G
+=
μγ1
(4-7) 因此采用直线作图法可测定参数Y G 和m 。
4.1.
5.3氧衡算
微生物反应过程中的耗氧量由三部分组成，一部分用于微生物维持生命活动的耗氧，一部分为生长菌体的耗氧，另一部分为产物耗氧。即：
?O 2 = (?O 2)m + (?O 2)G +(?O 2)P (4-8) 表示为微分形式，两侧同除dt ，
P m G dt dO dt dO dt dO dt dO ???
??-+??? ??-+??? ??-=-
2222 (4-9) 根据氧得率常数的定义，（4－9）式可变形为
dt
dP
Y X m dt dX Y dt dO PO o GO 112+
+=-
(4-10) 两侧同除X ，得
πμGO
o GO
O Y m Y Q 112+
+=
(4-11)
例4：乙醇为碳源，进行酵母好氧培养，结果如下：
解：根据氧衡算，πμGO
o GO
O Y m Y Q 112+
+=
，因产物可忽略不计，所以，
o GO
O m Y Q +=
μ12，以 Q O2~μ绘图，为一直线，直线的截距为m 0，斜率为
GO
Y 1。
根据实验数据绘制实验曲线。 由图中可知：m 0 =0.01[g/(g ?h)]，
GO
Y 1＝0.8717,
解得：m 0 =0.01[g/(g ?h)]，Y GO =1.15(g/g)
4.1.6 微生物反应的能量衡算
4.1.6.1有效电子转移和有机物氧化焓变
物质的氧化总伴随着电子的转移。在氧化过程中，每分子氧可以接受4个电子。我们把物质在氧化过程中伴随着能量释放所进行的电子转移称为“有效电子转移”。例如：0.5mol 氧气与1mol 氢气化合形成1mol 水蒸汽，同时放出241.4KJ 热量，过程中有效电子转移数为2，记作2(av,e -)。当1mol 葡萄糖完全氧化时，需要消耗6mol 的氧，相应的有效电子转移数为：6?4=24(av,e -/mol)。从大量实验得到，有机化合物氧化时每转移一个有效电子，平均释放出111KJ 的热量，记作：
?Hav,e - = -111KJ/ av,e -
因此，葡萄糖完全氧化释放的能量应为：
?Hs * =(-111)?24 = -2664KJ/mol
但是，当我们用量热器测定葡萄糖燃烧过程得到的是：?Hs= - 2816kJ/mol ，两者相差在5%左右，这样的误差在工程上是允许的。因此可以用有效电子转移数来计算有机物氧化所释放的能量，这在工程上是十分方便的。任何有机物只要写出其氧化的反应方程式，根据反应式中所消耗氧的摩尔数，就可以计算出反应所释放的能量。为了区别有机物氧化实际焓变和通过有效电子转移的计算值，分别用?H 和?H *表示，后者称为有机物氧化以有效电子转移为基准的“焓变”。
由于微生物反应过程一般是在25~37℃温度范围内进行的，以葡萄糖作碳源为例，在发酵过程中，碳源完全氧化相应的标准自由能变化的计算如下：
C 6H 12O 6 + 6O
2 6CO 2 + 6H 2O 过程熵变为：
?S 0 =
∑∑-
反应物
产物
S
S
= (002266O H CO S S +)-(0
02
612666O
O H C S S +) 00.02
0.040.060.080.10.12
0.140
0.05
0.1
0.15
μ(1/h)
Q O2 [g/(g ?h)]
=(6×0.213+6×0.0698)-(0.212+6×0.205) = 0.255kJ/kmol
标准自由能变化由于:
T ?S 0=(298~310) ×0.255=76~79kJ/mol<<-?Hs *=2664kJ/mol
则有：?6
126O H C G = ?Hs ≈?Hs * = -2664kJ/mol 因此，微生物反应过程基质和产物的标准自由能变化可近似等于其焓变。
4.1.6.2自由能消耗对菌体得率Y KJ
能变化
微生物反应过程的自由菌体所保持的自由能菌体增长量
+=
KJ Y
=
焓变
微生物反应过程的氧化增长菌体的氧化焓变菌体增长量
+
即 )
())((C a KJ H X H X
Y ?-+??-?= (4-12)
讨论：
1) 最低培养基中进行通风培养
由于培养基内葡萄糖是唯一碳源，它既作为能源，又作为构成细胞的材料。
)
)(())((2*
0O H X H X
Y a KJ ??-+??-?=
＝
O
X a Y H H /*
/)(1
?-
?- (4-13)
式中：-?H 0*：微生物呼吸（耗氧）反应的焓变
- ?H a ：以菌体燃烧热为基准的焓变。取- ?H a = -22.15kJ/g
2)最低培养基中进行厌氧培养
葡萄糖既作为能源，又作为构成细胞的材料。构成菌体以外的碳源消耗为
X ?12αα，构成菌体以外的碳源消耗为?S -X ?1
2αα
，所以 ∑??--?-?-?-+??-?=
)
)(())(())((1
2P H X S H X H X
Y P S a KJ α
＝
∑?+-?-?-S
P P S X S S
X a S
X Y H Y H Y H Y //1
2//)()1()(αα
(4-14)
式中：-?Hs ：碳源氧化的焓变(kJ/mol)
-?H P ：代谢产物氧化的焓变(kJ/mol)
3)复合培养基中进行厌氧培养
此时葡萄糖只作能源，所以 ∑??--?-?-+??-?=
)
)(())(())((P H S H X H X
Y P S a KJ
=
∑?--?-+?-S
P P S S
X a S
X Y H H Y H Y ///)()()( (4-15)
4）复合培养基中进行通风培养
)
)(())((2*
0O H X H X
Y a KJ ??-+??-?=
=
O
X a Y H H /*
/)(1
?-
?- (4-16)
当培养基内缺少构成细胞材料时（即所谓最低培养基），碳源既作能源，也能作为构成细胞的材料如3-1（a ）所示；当培养基为复合培养基时，碳源只作能源，如图3－1（b ）所示。
ADP ATP
H H 2O
(a)
( b )
图4-1 最低培养基(a)和复合培养基(b)碳源利用图
在微生物生长过程中，依靠ATP 中高能键释放的能量将菌体构成材料合成细胞高分子物质如蛋白质、DNA 、RNA 、脂类以及多糖的需要。有大量合成菌体材料存在时，这时微生物生长取决于ATP 的供能，这种生长就是能量生长偶联型；反之缺少合成菌体的材料或存在生长抑制物质，这时的生长取决于合成菌体材料的供应或合成反应的进程，这是往往多余的ATP 会被相应的酶作用使高能键水解，能量以废热的方式释放，这种生长就是能量生长非偶联型。 通常能量生长偶联型生长Y kJ 值较大，能量生长非偶联型生长Y kJ 值较小，能量利用率较低。
例5 （教材56页例3－6） 干酪乳杆菌在蛋白胨、牛肉膏为主要成分的复合培养基中，分别以葡萄糖和甘露醇为能源厌氧培养，结果如下表。试计算Y kJ 。
能源 Y P/S (mol/mol) (以产物／基质计) Y X/S (g/mol) 乳酸
乙酸 乙醇 甲醇 (以细胞/基质计）
葡萄糖 0.05 1.05 0.94 1.76 62.0 甘露醇
0.4
0.22
1.29
1.6
40.5
解：由化工手册可知，
?H G ＝-2816kJ/mol ，?H L = -1363kJ/mol ，?H A = -870kJ/mol ，?H E = -1368kJ/mol ，
?H F = -264kJ/mol ，?H a = -22.15kJ/mol ，?H M = -3038kJ/mol 。 以葡萄糖为能源时，
∑=?+?+?+?=?-)/(273276.126494.0136805.187005.01363)(/mol kJ Y H S P P 所以，∑?--?-+?-=
S
P P S S
X a S
X kJ Y H H Y H Y Y ///)()()(
2732
28160.6215.220
.62-+?=
＝0.043 (g/kJ)
以甘露醇为能源时，
∑=?+?+?+?=?-)/(29256.126429.1136822.08704.01363)(/mol kJ Y H S P P 所以，∑?--?-+?-=
S
P P S S
X a S
X kJ Y H H Y H Y Y ///)()()(
2925
30385.4015.225
.40-+?=
＝0.041 (g/kJ)
例6（教材58页例3－7）葡萄糖为唯一碳源，进行酵母培养，反应式为
O H CO O H C O O H C 2294.15.692.32612642.375.210.211.1++→+
求（1）Y X/S ；（2）生成1kg 细胞量时的?H h 。已知酵母细胞和葡萄糖的燃烧热分别为1.50?104kJ/kg 和1.59?104kJ/kg 。
解：（1）)/(42.018011.194
.1165.692.312/kg kg Y S X =??++?=
（2）生成1kg 细胞量消耗的葡萄糖 )(38.242
.01
/kg Y X S S X ==?=
?- 菌体含碳量 )/(56.094.1165.692.31292
.3122g g =?++??=
α
葡萄糖含碳量 )/(4.0180
72
1g g ==α 葡萄糖为唯一碳源，因此葡萄糖既作能源，又提供构成细胞的材料。所以
()∑??--??
?????-?-?-=?))(()(12P H X S H H P S h αα
?????
?
?-??=14.056.038.21059.14
)(1056.14kJ ?= 4.2微生物反应动力学
在微生物反应中，除了生成产物，还有菌体增殖，因此微生物反应动力学包括三个内容：
1）微生物生长动力学，研究的是
?=dt dX
2）产物生成动力学，研究的是?=dt dP
3）基质消耗动力学，研究的是?=-dt
dS
4.2.1微生物生长动力学
4.2.1.1 倍增时间（doubling time ）与世代时间(generation time)
倍增时间和世代时间是两个不同的概念。二者的关系在本章复习题第10题中讨论。
生长比速与倍增时间的关系：d
t 2
ln =
μ
例7（教材60页例3－8） 以乙醇为唯一碳源进行产气杆菌培养，菌体初始浓度X 0＝0.1kg/m 3，培养至3.2h ，菌体浓度为8.44kg/m 3，如果不考虑延迟期，比生长速率μ一定，求倍增时间t d 。
解：Xdt
dX
=μ （边界条件：0,0X X t ==）
μ一定时，对上式积分，得
t X X
μ=0
ln 所以，)(39.11
.044
.8ln 2.31ln 10h X X t ===μ
d t t =时，
20
=X X
)(5.039
.12
ln 2ln h t d ==μ=
＝ 4.2.1.2生长的非结构模型
自20世纪40年代至今，微生物生理学者和生物化学工程学者提出了许多关于微生物生长的动力学模型。这些生长模型根据Tsuchiya 理论可分为 （1）确定论的非结构模型，是一种理想状况，不考虑细胞内部结构，每个细胞之间无差别。
（2）确定论的结构模型，每个细胞之间无差别，细胞内部有多个组分存在。 （3）概率论的非结构模型，不考虑细胞内部结构，每个细胞之间有差别。 （4）概率论的结构模型，考虑细胞内部结构，每个细胞之间有差别。 从工程角度看，理想的微生物生长模型应具备下列4个条件： （1）要明确建立模型的目的。
（2）明确地给出建立模型的假定条件，这样才能明确模型的适用范围。 （3）希望所含有的参数，能够通过实验逐个确定。 （4）模型应尽可能简单。
目前，常使用确定论的非结构模型是Monod 方程。 4.2.1.3莫诺方程（Monod 方程）
S
K S
S +=
max μμ，式中：
μ：生长比速(h -1) μmax ：最大生长比速(h -1) S: 单一限制性基质浓度(mol/L) K S : 微生物对基质的半饱和常数(mol/L)
讨论：什么是单一限制性基质？如何判断是否限制性基质？
限制性基质可根据临界基质浓度判断，临界基质浓度是指达到
μmax 的最低基质浓度
S crit ，如图中所示。
若S ≤S crit ，则为限制性基质，若S >S crit ，则为非限制性基质。
在一个分批培养的全过程中，完全有可能出现多种限制性基质的情况。
表4－3 莫诺方程与米氏方程的比较
莫诺方程：S
K S
S +=
max μμ
米氏方程：S
K S
r r m +=max
描述微生物生长 描述酶促反应
经验方程
理论推导的机理方程 方程中各项含义： μ：生长比速(h -1
)
μmax ：最大生长比速(h -1
) S: 单一限制性基质浓度(mol/L) K S :半饱和常数(mol/L)
方程中各项含义：
r ：反应速率(mol/L.h) r max ：最大反应速率(mol/L.h) S ：基质浓度(mol/L) K m ：米氏常数(mol/L)
适用于单一限制性基质、不存在抑制的情况
适用于单基质酶促反应不存在抑制的情况
方程中K S 、μm 可根据实验确定。 莫诺方程可变形为：
S
K S
11
1
max
max
?
+
=
μμμ
绘制
S 1~
1
μ
曲线，为一直线，直线截距为max 1
μ，斜率为max
μS K ，可计算出K S 、μmax 。数据处理中发现，对于基质浓度较低的情况下，误差较大，采用下
式：
max
max
μμμ
S
K S
S
+
=
绘制
S S
~μ
曲线，为一直线，直线截距为
max
μS
K ，斜率为
max
1
μ。
采用上式的优点是：数据处理简便，误差小。 例8：乙醇为唯一碳源进行面包酵母培养，获得如下数据：
S(g/L) 0.40
0.33
0.18
0.10
0.071 0.049 0.038 0.020
0.014
μ(h -1)
0.161 0.169 0.169 0.149 0.133 0.135 0.112 0.0909 0.0735
求μmax 和K S 。 解：莫诺方程可变形为
max
max
μμμ
S
K S
S
+
=
。计算S/μ，绘制
S S
~μ
曲线。
μ(h-1) 0.161 0.169 0.169 0.149 0.133 0.135 0.112 0.0909 0.0735
S/μ(g ?h/L)
2.48
1.95
1.07
0.67
0.53
0.36
0.34
0.22
0.19
00.511.522.530
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
S(g/L)
S /μ(g .h /L )
由图中可知：直线截距
max
μS
K =0.095,斜率为
max
1
μ=5.7865,则
)(17.01
1max -==
h K
μ,)/(016.0L g K S = 某些微生物的K S 、μmax 值如表1所示：
表4-4 一些典型的K S 、μmax 值
微生物 生长限制基质
K S (mg/L) μmax (h -1) 产朊假丝酵母 氧 0.032 0.44 棕色固氮菌 氧 0.224 0.35 产朊球拟酵母 氧 0.45 0.51 酿酒酵母
葡萄糖 s ≤720mg/L 34.2 0.54 s ≥720mg/L 167.4 0.65 木酶sp
葡萄糖 28.8-59.4 0.13 纤维二糖 118-194 0.10 曲酶sp
葡萄糖 154.8 0.125 半乳糖 514.0 0.10 大肠杆菌
乳糖 20.9
甘露糖
3.96
可见，典型的K S 值均很小，这就预示着，只有采用极为灵敏、准确的测定基质、菌体浓度的方法，才能通过测定分批培养的初速度反应动力学来测定K S 。
4.2.1.4 其他生长模型
许多学者发现，有些情况下Monod 方程并不完全符合微生物的生长规律。例如，由于初始浓度过高而造成的细胞生长过快的细胞反应，可采取下述方程：
S
S K K S
S ++=
00max μμ
存在两种限制性基质的微生物生长模型：
2
22
111max S K S S K S S S +?
+?
=μμ 存在竞争性抑制的微生物生长模型：
S
K C K S
I I S ++=
)1(max μμ
存在非竞争性抑制的微生物生长模型：
其他生长模型见教材63页表3－6。
4.2.2产物生成动力学
发酵产物是非常多样的，其动力学远比菌体生长动力学复杂，不可能得到一个统一的象莫诺模型那样的产物生成动力学。
Gaden 根据产物生成速率与菌体生成速率之间的关系，将其分成三种类型。 1、相关模型：产物生成与菌体生长呈相关的过程，即：
dt
dX
B dt dP = 或：μπB = 属于这类模型的大多是基质分解产物，如乙醇、乳酸等。 2、相关模型：产物生成与菌体生长仅有间接的关系，即：
dt
dX B AX dt dP += 或：μπB A += 3、非相关模型：产物生成速率与菌体生长无关，即：
AX dt
dP
= 或：A =π 属于这类模型的大多为次级代谢产物，如青霉素、谷氨酸等。 以上三种型式可统一表示为：
dt
dX B AX dt dP +=或μπB A +=。A ＝0、B ≠0为相关模型；A ≠0，B ＝0为非相关模型；A ≠0且B ≠0为部分相关模型。如图所示。
一些符合π为μ
68页表
3－7。
表4-5 一些符合π为μ的一次函数关系的微生物反应
)
1)((max I I S K C S K S ++=
μμ b
a
c
4.2.3基质消耗动力学
根据碳源衡算，有
dt
dP
Y dt dX Y mX dt dS P G 11+
?+=-
或：P
G
Y Y m π
μ
γ+
+
=
上式反映了基质消耗与菌体生长及产物生成之间的关系。因此当生长动力学模型和产物生成动力学模型确定后，基质消耗动力学模型即可确定。
代谢工程在工业微生物育种中的应用 摘要：传统的诱变育种仍是目前发酵工业菌种选育中最常用的育种技术，以基因工程技术为主的多元化育种方式的发展，为代谢途径操作引入了全新的理念和方法，使代谢工程得以发展。代谢工程是对细胞代谢网络的代谢流量及代谢控制进行定量地、系统地分析，并通过DNA重组技术和相关的遗传学手段对微生物细胞进行代谢改造，提高其目的产物代谢量。本文论述了微生物代谢工程的理论基础及其在发酵工业微生物育种中的应用现状。 关键词：代谢工程；代谢途径；菌种选育 发酵工业自20世纪40年代发展至今，在青霉素等抗生素的发酵生产、赖氨酸等一系列氨基酸的发酵生产以及核苷酸、有机酸等物质的发酵产业发展中起了极其重要的作用。在工业微生物育种的过程中，对个别基因进行改造的经典基因工程技术不能保证对微生物代谢网络结构和功能的准确分析和高效利用，影响了相关行业的生产效率的稳定和经济效益的提高。目前，几乎所有重要工业微生物模式菌种的基因组全序列已经或即将公布，转录组、蛋白质组、代谢组、通量组等数据资源正在迅速扩展。充分利用组学数据中包含的有用信息，可以更有效地改造和控制细胞性能、提高底物利用以及产品的产率、改善微生物工业适应性，促进工业生物技术发展[1]。 菌种筛选和持续不断的改良贯彻于发酵生产过程的始终，以基因工程为核心的现代生物技术正越来越显示出其在菌种改良上的魅力，将最终成为微生物育种的主导技术[2]。建立在重组DNA技术基础之上的代谢工程技术，可以更容易地选择菌种的改良靶点，构建具有新的代谢途径的微生物细胞，提高其发酵性能，生产特定目的产物，从而可以推动发酵工业的发展。 一、代谢工程概述 代谢工程（Metabolic engineering），又称途径工程（Pathway engineering），是指利用生物学原理，系统地分析细胞代谢网络，并通过DNA重组技术合理设计细胞代谢途径，通过遗传修饰，完成细胞特性改造的应用性学科。1974年，Chakrabarty在假单胞菌属的两个菌种中分别引入几个稳定的重组质粒，从而提高了对樟脑和萘等复杂有机物的降解活性，这成为代谢工程技术的第一个应用实例。代谢工程的概念是1991年由生化工程专
2 反应动力学基础 2.1在一体积为4L 的恒容反应器中进行A 的水解反应，反应前 A 的含量为12.23%（重量），混合物的密度为1g/mL ，反应物A 的分子量为88。在等温常压 解：利用反应时间与组分A 的浓度变化数据，作出C A ～t 的关系曲线，用镜面法求得t=3.5h 时该点的切线，即为水解速率。 切线的斜率为 0.760.125/.6.1 α-==-mol l h 由（2.6）式可知反应物的水解速率为 0.125/.-==dC A r mol l h A dt 2.2在一管式反应器中常压300℃等温下进行甲烷化反应： 2423+→+CO H CH H O 催化剂体积为10ml ，原料气中CO 的含量为3%，其余为N 2,H 2气体，改变进口原料气流量Q 0解：是一个流动反应器，其反应速率式可用（2.7）式来表示 00000(1)(1)-= =-=-=-A A R A A A A A A A A dF r dV F F X Q C X dF Q C dX 故反应速率可表示为： 000 0(/)==A A A A A R R dX dX r Q C C dV d V Q 用X A ～V R /Q 0作图，过V R /Q 0=0.20min 的点作切线，即得该条件下的dX A /d(V R /Q 0)值α。 0.650.04 1.79 0.34 α-== 故CO 的转化速率为 40030.10130.03 6.3810/8.31410573--? ===???A A P C mol l RT
430 0 6.3810 1.79 1.1410/.min (/)--==??=?A A A R dX r C mol l d V Q 2.3已知在Fe-Mg 催化剂上水煤气变换反应的正反应动力学方程为： 20.850.4 /-=?w CO CO r k y y kmol kg h 式中y CO 和y CO2为一氧化碳及二氧化碳的瞬间摩尔分率，0.1MPa 压力及700K 时反应速率常数k W 等于0.0535kmol/kg.h 。如催化剂的比表面积为30m 2/g ，堆密度为1.13g/cm 3，试计算： （1） 以反应体积为基准的速率常数k V 。 （2） 以反应相界面积为基准的速率常数k g 。 （3） 以分压表示反应物系组成时的速率常数k g 。 （4） 以摩尔浓度表示反应物系组成时的速率常数k C 。 解：利用（2.10）式及（2.28）式可求得问题的解。注意题中所给比表面的单位换算成m 2/m 3。 33230.450.45 33 0.45(1) 1.13100.053560.46/.6(2) 1.7810/.3010 11(3)()()0.05350.15080.1013..()8.3110700(4)()(0.05350.333(0.1）ρρρρ-==??=-= = =???==?=??==?=v b w b b g w w v b n p w n c w k k kmol m h k k k kmol m h a kmol k k P kg h MPa m RT k k P km 0.45)().kmol ol kg h 2.4在等温下进行液相反应A+B →C+D ，在该条件下的反应速率方程为： 1.50.5 0.8/min =?A A B r C C mol l 若将A 和B 的初始浓度均为3mol/l 的原料混合进行反应，求反应4min 时A 的 转化率。 解：由题中条件知是个等容反应过程，且A 和B 的初始浓度均相等，即为1.5mol/l ，故可把反应速率式简化，得 1.50.5222 00.80.80.8(1)===-A A B A A A r C C C C X 由（2.6）式可知 00 (1)?? ???? --==-=A A A A A A d C X dC dX r C dt dt dt 代入速率方程式 22 00.8(1)=-A A A A dX C C X dt 化简整理得 00.8(1)=-A A A dX C dt X 积分得 00.81= -A A A X C t X 解得X A =82.76%。
第三章微生物反应动力学习题 1. 微生物反应的特点，其与化学反应的主要区别有那些？ 2．简要回答微生物反应与酶促反应的最主要区别？ 3. 进行微生物反应过程的物量衡算有何意义，请举例说明。 4．Monod 方程建立的几点假设是什么？Monod 方程与米氏方程主要区别是什么？ 5．举例简要说明何为微生物反应的结构模型？ 6. 以葡萄糖为单一碳源，进行某种微生物好氧或厌氧培养。已知此菌的比生长速率μ、葡萄糖的比消耗速率γ、细胞、葡萄糖、二氧化碳和各产物中的碳元素含量α1、α2、α3 和αi，利用这6 个常数给出此菌的与生长相关的物料衡算式。 7. 葡萄糖为碳源的复合培养基进行干酪乳杆菌的厌氧培养，1mol葡萄糖可生成乳酸或乙酸或乙醇或甲酸为0.05mol、1.05mol、0.94mol和1.76mol，试讨论各分解代谢的碳元素的恒算及生成ATP的摩尔数。 8. 荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）好氧培养中，已知：Y x/s=180g/mol,Y x/o=30.4g/mol,每消耗1mol葡萄糖可生成2molATP，氧化磷酸化的P：O比为1，求Y ATP？ 9. 在啤酒酵母的生长试验中，消耗了0.2kg 葡萄糖和0.0672kgO2，生成0.0746kg 酵母菌和 0.121kgCO2，请写出该反应的质量平衡式，计算酵母得率Y X/S 和呼吸商RQ。 10. 微生物物繁殖过程中分裂一次生成两个子细胞，也有4 分裂或8 分裂的，试证明当n 分 裂时，有如下式子：，式中： 为倍增时间， 为世代时间。 11．分别采用含有蛋白胨和牛肉膏的复合培养基、含有20 余种氨基酸的合成培养基和基本培养基进行运动发酵单胞菌厌氧培养，碳源为葡萄糖，获得如下表所示结果。已知菌体的含碳量（以碳源/细胞计）为0.45g/g，求采用不同培养基时的Y KJ。 12. 葡萄糖为碳源进行酿酒酵母培养，呼吸商为1.04，氨为氮源。消耗100mol 葡萄糖和48mol氨，生成细胞48mol、二氧化碳312mol 和水432mol。求氧的消耗量和酵母细胞的化学组成。 13. 以葡萄糖为唯一碳源的最低培养基进行Candida utilis 培养，Y x/s=91.8g-细胞/mol 葡萄糖，求Y kJ。已知葡萄糖的燃烧热为2830KJ/mol。 15. 以葡萄糖为唯一碳源的基本培养基厌氧培养产气气杆菌, Yx/s= 26.1 g 细胞/mol 葡萄糖,试求分解代谢消耗葡萄糖的量占总消耗量的分率? 已知每克细胞含0.45g 碳,每mol 葡萄糖含72g 碳,且△S=△S 合成 +△S分解。 16.一个新发现的微生物在每一次细胞分裂时，可产生3个新细胞，由下列生长数据求：①此微生物的比生长速率μ(h-1)；②两个细胞分裂的平均间隔时间；③此微生物细胞的平均世代时间。 时间/h 0 0.5 1.0 1.5 2.0 细胞干重/(g/L) 0.10 0.15 0.23 0.34 0.51
代谢工程 科技名词定义 中文名称：代谢工程 英文名称：metabolic engineering 定义：通过基因工程的方法改变细胞的代谢途径。 所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；新陈代谢（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 代谢工程书籍图 代谢工程（Metabolic engineering）是生物工程的一个新的分支。代谢工程把量化代谢流及其控制的工程分析方法和用以精确制订遗传修饰方案并付之实施的分子生物学综合技术结合起来，以上述“分析——综合”反复交替操作、螺旋式逼近目标的方式，在较广范围内改善细胞性能，以满足人类对生物的特定需求的生物工程。 目录
发展前沿 展开 编辑本段发展 为了满足人类对生物的特定需求而对微生物进行代谢途径操作，已有将近半个世纪的历史了。在氨基酸、抗生素、溶剂和维生素的发酵法生产中，都可以找到一些典型实例。操作的主要方法是，用化学诱变剂处理微生物，并用创造性的筛选技术来检出已获得优良性状的突变菌株。尽管这种方法已被广泛地接受并已取得好的效果，但对突变株的遗传和代谢性状的鉴定是很不够的，更何况诱变是随机的，科学不足技巧补！ DNA重组的分子生物学技术的开发把代谢操作引进了一个新的层面。遗传工程使我们有可能对代谢途径的指定酶反应进行精确的修饰，因此，有可能构建精心设计的遗传背景。DNA重组技术刚进入可行阶段不久，就出现了不少可用来说明这种技术在定向的途径修饰方面的潜在应用的术语。如分子育种（1981年），体外进化（1988年），微生物工程或代谢途径工程（1988~1991年），细胞工程（1991年）和代谢工程（1991年）。尽管不同的作者提出不完全相同的定义，这些定义均传达了与代谢工程的总目标和手段相似的含义。 我们曾经把代谢工程定义为，代谢工程就是用DNA重组技术修饰特定的生化反应或引进新的生化反应，直接改善产物的形成和细胞的性能的学科。这样定义代谢工程强调了代谢工程工作目标的确切性。也就是说，先要找到要进行修饰或要引进的目标生化反应，一旦找准了目标，就用已建立的分子生物学技术去扩增、去抑制或删除、去传递相应的基因或酶，或者解除对相应的基因或酶调节，而广义的DNA重组只是常规地应用于不同步骤中，以便于达到这些目标。 编辑本段优势与研究方向 优势 尽管在所有的菌种改良方案中都有某种定向的含义，但与随机诱变育种相比较，在代谢工程中工作计划的定向性更加集中更加有针对性。这定向性在酶的目标的选择，实验的设计，数据的分析上起着支配的作用。不能把细胞改良中的所谓“定向” 解释为合理的途径设计和修饰，因为“定向选择”与随机诱变之间没有直接关系。相反地我们可借助于“逆行的代谢工程”（reverse metabolic engineering）, 从随机诱变而获得的突变株及其性状的实验结果，来提取途径及其控制的判断信息（critical information）。 研究方向
5202 反应 2O 3→ 3O 2的速率方程为 - d[O 3]/d t = k [O 3]2[O 2]-1 ， 或者 d[O 2]/d t = k '[O 3]2[O 2]-1，则速率常数 k 和 k ' 的关系是： ( ) (A) 2k = 3k ' (B) k = k ' (C) 3k = 2k ' (D) -k /2 = k '/3 5203 气相反应 A + 2B ─→ 2C ，A 和 B 的初始压力分别为 p A 和 p B ，反应开始时 并无 C ，若 p 为体系的总压力，当时间为 t 时，A 的分压为： ( ) (A) p A - p B (B) p - 2p A (C) p - p B (D) 2(p - p A ) - p B 5204 对于反应 2NO 2= 2NO + O 2，当选用不同的反应物和产物来表示反应速率时，其相互关系为：( ) (A) -2d[NO 2]/d t = 2d[NO]/d t = d[O 2]/d t (B) - d[NO 2]/2d t = d[NO]/2d t = d[O 2]/d t = d ξ /d t (C) - d[NO 2]/d t = d[NO]/d t = d[O 2]/d t (D) - d[NO 2]/2d t = d[NO]/2d t = d[O 2]/d t = 1/V d ξ /d t 5207 气相基元反应 2A k 1 B 在一恒容的容器中进行，p 0为 A 的初始压力, p t 为时间 t 时反应 体系总压，此反应速率方程 d p t / d t = 。 - k (2p t - p 0)2 5208 有一反应 mA → nB 是一简单反应，其动力学方程为 -d c A / d t = kc A m ， c A 的单位为 mol ·dm -3， 时间单位为 s ，则： (1) k 的单位为 ___________ mol 1- m ·dm 3( m -1)·s -1 (2) 以d c B /d t 表达的反应速率方程和题中给的速率方程关系为 B A A A 1d 1d 'd d m m c c k c k c n t m t m =-== 5209 反应 2N 2O 5─→ 4NO 2+ O 2 在328 K 时，O 2(g)的生成速率为0.75×10-4 mol ·dm -3·s -1。 如 其间任一中间物浓度极低, 难以测出, 则该反应的总包反应速率为 _______________mol ·dm -3·s -1, N 2O 5 之消耗速率为__________ mol ·dm -3·s -1，NO 2之生成速率为_______________mol ·dm -3·s -1 。0.75×10-4, 1.50×10-4, 3.00×10-4 5210 O 3分解反应为 2O 3─→3O 2 ，在一定温度下, 2.0 dm 3容器中反应。实验测出O 3每秒消耗1.50× 10-2 mol, 则反应速率为_______________mol ·dm -3·s -1氧的生成速率为_______________mol ·dm -3·s -1, d ξ /d t 为_______________ 0.75×10-2, 2.25×10-2, 1.50×10-2.。 5211 2A ＋B ＝2C 已知反应某一瞬间, r A ＝12.72 mol ·dm -3·h -1, 则 r B ＝ , r C ＝_____________r B ＝6.36 mol ·dm -3·h -1, r C ＝12.72mol ·dm -3·h -1 5212分别用反应物和生成物表示反应A ＋3B ＝2C 的反应速率, 并写出它们间关系为： 。 r A ＝13r B ＝12 r C 5222 有关基元反应的描述在下列诸说法中哪一个是不正确的： ( ) (A) 基元反应的级数一定是整数 (B) 基元反应是“态－态”反应的统计平均结果 (C) 基元反应进行时无中间产物，一步完成 (D) 基元反应不一定符合质量作用定律 5223 400 K 时，某气相反应的速率常数k p = 10-3(kPa)-1·s -1，如速率常数用 k C 表示，则 k C 应为： (A) 3.326 (mol ·dm -3)-1·s -1 k C = k p (RT ) (B) 3.0×10-4 (mol ·dm -3)-1·s -1 (C) 3326 (mol ·dm -3)-1·s -1 (D) 3.0×10-7 (mol ·dm -3)-1·s -1 5224 如果反应 2A + B ＝ 2D 的速率可表示为：
我国在微生物代谢领域的研究现状及展望 发表时间：2012-06-18T14:33:59.827Z 来源：《赤子》2012年第8期供稿作者：李夏 [导读] 微生物代谢是指微生物吸收营养物质维持生命和增殖并降解基质的一系列化学反应过程，包括有机物的降解和微生物的增殖。 李夏（四川化工职业技术学院，四川泸州 646005） 摘要：微生物代谢是指微生物吸收营养物质维持生命和增殖并降解基质的一系列化学反应过程，包括有机物的降解和微生物的增殖。在分解代谢中，有机物在微生物作用下，发生氧化、放热和酶降解过程，使结构复杂的大分子降解；合成代谢中，微生物利用营养物及分解代谢中释放的能量，发生还原吸热及酶的合成过程，使微生物生长增殖。文章主要介绍我国在微生物代谢领域的研究现状及对未来的展望，为我们呈现了一个广阔的微生物代谢世界。 关键词：微生物代谢；分解代谢；合成代谢；研究现 前言 微生物在生长过程中机体内的复杂代谢过程是互相协调和高度有序的，并对外界环境的改变能够迅速做出反应。其原则是经济合理地利用和合成所需要的各种物质和能量，使细胞处于平衡生长状态。在实际生产中，往往需要高浓度的积累某一种代谢产物，而这个浓度又常常超过细胞正常生长和代谢所需的范围。因此要达到超量积累这种产物，提高生产效率，必须打破微生物原有的代谢调控系统，在适当的条件下，让微生物建立新的代谢方式，高浓度的积累人们所期望的产物[1]。 1 我国微生物代谢的研究现状 1.1 利用微生物代谢生产酶 工业上，曾由植物、动物和微生物生产酶。微生物的酶可以用发酵技术大量生产，是其最大的优点。而且与植物或动物相比，改进微生物的生产能力也方便得多。微生物的酶主要应用于食品及其有关工业中。酶的生产是受到微生物本身严格控制。为改进酶的生产能力可以改变这些控制，如在培养基中加入诱导物和采用菌株的诱变和筛选技术，以消除反馈阻遏作用。 1.2 利用微生物代谢产生的代谢产物生产目的物 在微生物对数生长期中，所产生的产物，主要是供给细胞生长的物质，入氨基酸、核苷酸、蛋白质、核酸、脂类和碳水化合物等。这些产物称为初级代谢产物。利用发酵生产的许多初级代谢产物，具有重大的经济意义，我国现已可以根据微生物代谢调控的理论，通过改变发酵工艺条件如pH、温度、通气量、培养基组成和微生物遗传特性等，达到改变菌体代谢平衡，过量生产所需要产物的目的。 1.3 利用微生物代谢理论发展产生了代谢工程 代谢工程是指利用基因工程技术，定向的对细胞代谢途径进行修饰、改造，以改变微生物的代谢特征，并于微生物基因调控、代谢调控及生化工程相结合，构建新的代谢途径，生产新的代谢产物的工程技术领域。 1.4 改变微生物代谢途径生产目的物 改变代谢途径是指改变分支代谢的流向，阻断其他代谢产物的合成，以达到提高目的产物的目的。改变代谢途径有各种方法，如加速限速反应，改变分支代谢途径流向、构建代谢旁路、改变能量代谢途径等不同方法[1]。 1.5 利用微生物代谢进行发酵 数千年来由于科学技术进步缓慢，各种微生物工业也未能充分发展。直到20世纪中期才建立了一系列新的微生物工业。近几年来，由于微生物代谢工程的应用，发酵工业开始进入新的发展时期。发酵产品增长快、质量明显提高，在国民经济中起重要作用。 1.6 微生物代谢在环境方面的应用 微生物降解是环境中去除污染物的主要途径。深人了解污染物在微生物内的代谢途径，将有助于人们优化生物降解的条件，从而实现快速的生物修复。这些代谢中间体大都通过萃取、分析方法进行逐个研究，并借助专家经验拟合出代谢途径，其动力学过程亦很少触及。代谢组学方法的采用有可能改变这一现状[2]。 1.7 利用微生物代谢进行赖氨酸的生产 在许多微生物中，可用天冬氨酸作原料，通过分支代谢途径合成出赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸。赖氨酸在人类和动物营养上是一种十分重要的必须氨基酸，因此，在食品、医药和畜牧业上需求量很大。但在代谢过程中，一方面由于赖氨酸对天冬氨酸激酶有反馈抑制作用，另一方面，由于天冬氨酸除用于合成赖氨酸外，还要作为合成甲硫氨酸和苏氨酸的原料，因此，在正常细胞内，就难以累积较高浓度的赖氨酸。 为了解除正常的代谢调节以获得赖氨酸的高产菌株，工业上选育了谷氨酸棒杆菌的高丝氨酸缺陷型菌株作为赖氨酸的发酵菌种。由于它不能合成高丝氨酸脱氢酶，故不能合成高丝氨酸，也不能产生苏氨酸和甲硫氨酸，在补给适量高丝氨酸的条件下，可在含较高糖浓度和铵盐的培养基上，产生大量的赖氨酸[3]。 1.8 微生物代谢与分子生物学方法的结合 随着遗传学、分子生物学等方法的不断发展，人们越来越多地将这些方法运用到微生物的研究工作中。一些野生菌的合成能力或分泌能力有限，目前可通过人工诱变或构建高效的基因工程菌株等方法对其进行改造以扩大应用范围此外，现在许多细菌合成拮抗物质的基因已被克隆测序，为使植物获得微生物所具有的特殊功能，一种可能的方法是通过基因工程将目的基因导入植物体内，使植物直接表达活性物质[4]。 2 展望 2.1 微生物代谢在医药行业的展望 微生物在代谢过程中可分泌蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等几十种胞外酶进入培养基，这些酶有的可以将药物成分分解转化，形成新的化合物，有的可水解植物细胞壁的纤维素、半纤维素、果胶质等，使细胞破裂，利于有效成分溶出。特别是采用一些酶作用于药用植物材料，使细胞壁及细胞间质中的纤维素、半纤维素等物质降解，使细胞破裂，细胞间隙增加，减小细胞壁、细胞间物质传递屏障、对有效成分从胞内向胞外扩散的阻力减少，可促进有效成分的吸收提高。 2.2 微生物代谢在生理生化、微生物遗传育种方面的展望 随着分子生物学理论与技术的飞速发展，尤其是基因组和后基因组时代的到来，传统上的生理学与遗传学的交叉融合越来越多，许多
Advances in Microbial Metabolic Engineering to Increase L-Threonine Production DONG Xunyan 1，2， WANG Xiaoyuan *1，2 （1.State Key Laboratory of Food Science and Technology ，Jiangnan University ，Wuxi 214122，China ；2.School of Biotechnology ，Jiangnan University ，Wuxi 214122，China ） Abstract ：As an essential amino acid for mammals ，L-threonine has a wide application in the food ，feeds ，pharmaceutical and cosmetics industries.To date ，L-threonine is almost exclusively produced through microbial fermentation.Metabolic engineering provides an effective means to strain development and thus to enhancing the L-threonine production.In this article ，the pathway and regulation of L-threonine in the major industrial strains ，Corynebacterium glutamicum and Escherichia coli are summarized ，and advances on metabolic engineering to increase L-threonine production are reviewed. Keywords ：L-threonine ，Corynebacterium glutamicum ，Escherichia coli ，metabolic engineering ，fermentation 摘要：L-苏氨酸作为一种必需氨基酸被广泛用于食品、饲料、医药及化妆品行业。目前L-苏氨酸主要通过微生物发酵法生产。代谢工程技术的应用为菌种选育开辟了有效途径，使在现有高产基础上进一步提高氨基酸的产量成为可能。作者对两大氨基酸生产菌——— 大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中的L-苏氨酸生物合成相关途径、代谢调控机理以及运用代谢工程技术提高L-苏氨酸产量所取得的成果进行了系统综述。 关键词：L-苏氨酸；谷氨酸棒杆菌；大肠杆菌；代谢工程；发酵中图分类号：Q 933 文献标志码：A 文章编号：1673—1689（2016）12—1233—08 微生物生产L-苏氨酸的代谢工程研究进展 董迅衍1，2，王小元*1，2 （1.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏无锡214122；2.江南大学生物工程学院，江苏无锡 214122） 收稿日期：2016-07-08 基金项目：国家973计划项目（2012CB725202）；国家自然科学基金项目（NSFC31370131）；江南大学博士科研基金项目（JUDCF11025）。作者简介：董迅衍（1986—），女，江苏无锡人，发酵工程博士研究生，主要从事氨基酸生产菌株代谢工程方面的研究。 Email ：xunyandong@https://www.doczj.com/doc/aa14608342.html, *通信作者：王小元（1965—），男，山西垣曲人，工学博士，教授，博士研究生导师，主要从事工业微生物代谢工程方面的研究。 E-mail ：xwang@https://www.doczj.com/doc/aa14608342.html,
5202 反应 2O 3→ 3O 2的速率方程为 - d[O 3]/d t = k [O 3]2[O 2]-1 ， 或者 d[O 2]/d t = k '[O 3]2[O 2]-1，则速率常数 k 和 k ' 的关系是： ( ) (A) 2k = 3k ' (B) k = k ' (C) 3k = 2k ' (D) -k /2 = k '/3 5203 气相反应 A + 2B ─→ 2C ，A 和 B 的初始压力分别为 p A 和 p B ，反应开始时 并无 C ，若 p 为体系的总压力，当时间为 t 时，A 的分压为： ( ) (A) p A - p B (B) p - 2p A (C) p - p B (D) 2(p - p A ) - p B 5204 对于反应 2NO 2= 2NO + O 2，当选用不同的反应物和产物来表示反应速率时，其相互关系为：( ) (A) -2d[NO 2]/d t = 2d[NO]/d t = d[O 2]/d t (B) - d[NO 2]/2d t = d[NO]/2d t = d[O 2]/d t = d ξ /d t (C) - d[NO 2]/d t = d[NO]/d t = d[O 2]/d t (D) - d[NO 2]/2d t = d[NO]/2d t = d[O 2]/d t = 1/V d ξ /d t 5207 气相基元反应 2A k 1 B 在一恒容的容器中进行，p 0为 A 的初始压力, p t 为时间 t 时反应 体系总压，此反应速率方程 d p t / d t = 。 - k (2p t - p 0)2 5208 有一反应 mA → nB 是一简单反应，其动力学方程为 -d c A / d t = kc A m ， c A 的单位为 mol ·dm -3， 时间单位为 s ，则： (1) k 的单位为 ___________ mol 1- m ·dm 3( m -1)·s -1 (2) 以d c B /d t 表达的反应速率方程和题中给的速率方程关系为 B A A A 1d 1d 'd d m m c c k c k c n t m t m =-== 5209 反应 2N 2O 5─→ 4NO 2+ O 2 在328 K 时，O 2(g)的生成速率为0.75×10-4 mol ·dm -3·s -1。 如其间任一中间物浓度极低, 难以测出, 则该反应的总包反应速率为 _______________mol ·dm -3·s -1, N 2O 5之消耗速率为__________ mol ·dm -3·s -1，NO 2之生成速率为_______________mol ·dm -3·s -1 。0.75×10-4, 1.50×10-4, 3.00×10-4 5210 O 3分解反应为 2O 3─→3O 2 ，在一定温度下, 2.0 dm 3容器中反应。实验测出O 3每秒消耗1.50×10-2 mol, 则反应速率为_______________mol ·dm -3·s -1氧的生成速率为_______________mol ·dm -3·s -1, d ξ /d t 为_______________ 0.75×10-2, 2.25×10-2, 1.50×10-2.。 5211 2A ＋B ＝2C 已知反应某一瞬间, r A ＝12.72 mol ·dm -3·h -1, 则 r B ＝ , r C ＝_____________r B ＝6.36 mol ·dm -3·h -1, r C ＝12.72mol ·dm -3·h -1 5212分别用反应物和生成物表示反应A ＋3B ＝2C 的反应速率, 并写出它们间关系为： 。r A ＝ 13r B ＝1 2 r C 5222 有关基元反应的描述在下列诸说法中哪一个是不正确的： ( ) (A) 基元反应的级数一定是整数 (B) 基元反应是“态－态”反应的统计平均结果 (C) 基元反应进行时无中间产物，一步完成 (D) 基元反应不一定符合质量作用定律 5223 400 K 时，某气相反应的速率常数k p = 10-3(kPa)-1·s -1，如速率常数用 k C 表示，则 k C 应为： (A) 3.326 (mol ·dm -3)-1·s -1 k C = k p (RT ) (B) 3.0×10-4 (mol ·dm -3)-1·s -1 (C) 3326 (mol ·dm -3)-1·s -1 (D) 3.0×10-7 (mol ·dm -3)-1·s -1 5224 如果反应 2A + B ＝ 2D 的速率可表示为：
微生物代谢工程 1.代谢控制发酵 代谢控制发酵就是利用遗传学的方法或生物化学方法，人为地在DNA分子水平上改变和控制微生物的代谢，使得目的产物大量的生成、积累的发酵。 代谢控制发酵的核心：解除微生物代谢控制机制，打破微生物正常的代谢调节，人为地控制微生物的代谢。 2.微生物代谢工程定义、研究内容和研究手段 定义：应用重组DNA技术和应用分析生物学相关的遗传学手段进行有精确目标的遗传操作，改变酶的功能或输送体系的功能，甚至产能系统的功能，以改进细胞某些方面的代谢活性的整套操作工作（包括代谢分析、代谢设计、遗传操作、目的代谢活性的实现）。简而言之，代谢工程是生物化学反应代谢网络有目的的修饰。 研究内容： (1)代谢流的定量和定向 (2)细胞对底物的吸收和产品的释放模型及分析 (3)研究胞内代谢物浓度的反应工程方法 (4)用13C标记实验进行胞内稳态流分析 研究手段 (1)采用遗传学手段的遗传操作 ①基因工程技术的应用。②常规诱变技术的应用。 (2)生物合成途径的代谢调控 ①生物合成中间产物的定量生物测定。②共合成法在生物合成中的应用。③酶的诱导合成和分解代谢产物阻遏。④无机磷对生物合成的调节。 (3)研究生物合成机制的常用方法 ①刺激实验法。②同位素示踪法。③洗涤菌丝悬浮法。④无细胞抽提法。⑤遗传特性诱变法。 3. 工业发酵的五字策略（图示加文字说明） ①进，在育种和发酵控制方面都要促进细胞对碳源营养物质的吸收； ②通，在育种方面解除对某些酶的反馈调节，在发酵控制方面，诱导这些酶的合成或激活这些酶，从而使来自各代谢物流（除碳架物流外海包括其他支持生物合成的物流）能够畅通的注入载流途径，汇入代谢主流，流向目的产物，特别是当发酵进入目的产物合成阶段后，必需确保载流路径通畅，代谢主流优势明显 ③节，采用育种或发酵控制手段，节制与目的产物的形成无关或关系不大的代谢支流，使碳架物质相对集中地流向目的产物。这里所谓的“节制”是指封闭或削弱以目的产物合成途径的起始底物或以中间产物为起始底物的分支途径； ④堵，采用育种或发酵手段消除或削弱目的产物进一步代谢的途径，包括目的产物参与的分解代谢和合成代谢，为了消除或削弱目的产物的进一步分解代谢，就必须降解目的产物进一步代谢的酶活力或酶量，甚至使这些酶不再合成或不起作用； ⑤出，促进目的产物向胞外空间分泌。在育种和发酵控制发面可通过调节细胞对目的产物的通透性，增加输送目的产物的载体蛋白的量，为目的产物输送代谢能的方法，使目的产物尽快转移出细胞。 4. 酶的阻遏机制，以大肠杆菌色氨酸或组氨酸操纵子为例来说明（图示加文字说明） 终端产物对其自身合成途径的酶的合成的反馈阻遏和弱化的机制反馈阻遏：
第三章 微生物反应动力学习题答案 1. 微生物反应的特点，其与化学反应的主要区别有那些？ 答：微生物反应与化学反应相比，具有以下特点： 1）微生物反应属于生化反应，通常是在常温常压下进行；2）反应原料来源相对丰富；3）易于生产复杂的高分子化合物和光学活性物质；4）通过菌种改良，可大大提高设备的生产能力；5）副产物多，提取有一定难度；6）生产微生物受外界环境影响比较大；7）开发成本较大；8）废水BOD较大 2．简要回答微生物反应与酶促反应的最主要区别？ 答：微生物反应与酶促反应的最主要区别在于，微生物反应是自催化反应，而酶促反应不是。此外，二者还有以下区别： （1）酶促反应由于其专一性，没有或少有副产物，有利于提取操作，对于微生物反应而言，基质不可能全部转化为目的产物，副产物的产生不可避免，给后期的提取和精制带来困难，这正是造成目前发酵行业下游操作复杂的原因之一。 （2）对于微生物反应，除产生产物外，菌体自身也可是一种产物，如果其富含维生素或蛋白质或酶等有用产物时，可用于提取这些物质。 （3）与微生物反应相比，酶促反应体系较简单，反应过程的最适条件易于控制。 微生物反应是利用活的生物体进行目的产物的生产，因此，产物的获得除受环境因素影响外，也受细胞因素的影响，并且微生物会发生遗传变异，因此，实际控制有一定难度。 （4）酶促反应多限于一步或几步较简单的生化反应过程，与微生物反应相比，在经济上有时并不理想。 4. 答：Monod 方程建立的基本假设：微生物生长中，生长培养基中只有一种物质的浓度（其他组分过量）会影响其生长速率，这种物质被称为限制性基质，并且认为微生物为均衡生长且为简单的单一反应。Monod 方程与米氏方程的主要区别如下表所示： Monod 方程：S K S S += max μμ 米氏方程：S K S r r m += max 方程中各项含义： μ：生长比速 μmax ：最大生长比速 S: 单一限制性基质浓度 K S : 半饱和常数 方程中各项含义： r：反应速率 r max ：最大反应速率 S：底物浓度 K m ：米氏常数 微生物生长动力学方程 酶促反应动力学方程
1.微生物代谢工程定义、研究内容和研究手段。 定义：通过某些特定生化反应的修饰来定向改善细胞的特性功能，运用重组DNA技术来创造新的化合物。 研究内容：生物合成相关代谢调控和代谢网络理论；代谢流的定量分析；代谢网络的重新设计；中心代谢作用机理及相关代谢分析；基因操作。 研究手段：代谢工程综合了基因工程、微生物学、生化工程等领域的最新成果。因此，在研究方法和技术方面主要有下列三大常用手段： (1)检测技术：常规的化学和生物化学检测手段都可用于代谢工程的研究，如物料平衡、同位素标记示踪法、酶促反应动力学分析法、光谱学法、生物传感器技术。 (2)分析技术：采用化学计量学、分子反应动力学和化学工程学的研究方法并结计算机技术，阐明细胞代谢网络的动态特征与控制机理，如稳态法、扰动法、组合法和代谢网络优化等。 (3) 基因操作技术：在代谢工程中，代谢网络的操作实质上可以归结为基因水平上的操作：涉及几乎所有的分子生物学和分子遗传学实验技术，如基因和基因簇的克隆、表达、调控，DNA 的杂交检测与序列分析，外源DNA的转化，基因的体内同源重组与敲除，整合型重组DNA 在细胞内的稳定维持等。 2. 2.代谢改造思路和代谢设计原理。 代谢改造思路： 根据微生物的不同代谢特性，常采用改变代谢流、扩展代谢途径和构建新的代谢途径三种方法。 (1)改变代谢途径的方法：加速限速反应，增加限速酶的表达量，来提高产物产率。改变分支代谢途径流向，提高代谢分支点某一分支代谢途径酶活力，使其在与其它的分支代谢途径的竞争中占据优势，从而提高目的代谢产物的产量。 (2)扩展代谢途径的方法：在宿主菌中克隆和表达特定外源基因，从而延伸代谢途径，以生产新的代谢产物和提高产率。扩展代谢途径还可使宿主菌能够利用自身的酶或酶系消耗原来不消耗的底物。 (3)转移或构建新的代谢途径：通过转移代谢途径、构建新的代谢途径等方法来实现。 代谢设计原理： 现存代谢途径中改变增加目的产物代谢流：增加限速酶编码基因的拷贝数；强化关键基因的表达系统；提高目标途径激活因子的合成速率；灭活目标途径抑制因子的编码基因；阻断与目标途径相竟争的代谢途径；改变分支代谢途径流向；构建代谢旁路；改变能量代谢途径； 在现存途径中改变物流的性质：利用酶对前体库分子结构的宽容性；通过修饰酶分子以拓展底物识别范围； 在现存途径基础上扩展代谢途径：在宿主菌中克隆、表达特定外源基因可以延伸代谢途径，从而生产新的代谢产物、提高产率。 3. 微生物的基因操作技术有哪些？（举两例说明） 微生物的基因操作技术有：核酸的凝胶电泳、核酸的分子杂交技术、DNA序列分析、基因的定点诱变、细菌的转化、利用DNA与蛋白质的相互作用进行核酸研究、PCR技术等。 基因定点突变(site-directed mutagenesis)：通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，用于研究氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。主要采用两种PCR方法，包括重叠延伸技术和大引物诱变法。在硫化细菌核苷水解酶对底物专一性的研究中，采用定点突变技术，对编码221位和228位氨基酸的DNA序列进行突变，改变两
生工学院 课程编号：020101 课程名称：分子生物学（Molecular Biology） 总学时：41 学分：2.0 主讲教师：王正祥（教授） 主要内容：前言、分子生物学方法、转录和转录后加工、翻译、DNA复制重组和转座、基因组、实验。通过学习掌握分子生物学的基本知识，了解分子生物学的最新进展，掌握分子生物学中常用专业英文词汇，基本掌握分子生物学研究中的核心技术。 课程编号：020102 课程名称：基因操作实验技术（Laboratory Techniques for Gene Manipulation） 总学时：56 学分：2.0 主讲教师：王正祥（教授） 主要内容： 课程编号：020201 课程名称：工业微生物资源（Sources and Application of Industrial Microorganisms） 总学时：46 学分：2.0 主讲教师：诸葛健(教授) 主要内容: 工业微生物资源、目的菌株筛选、模拟放大、工业微生物的初步鉴定与保藏、专利保护。通过学习，可以帮助同学掌握工业微生物资源的获得方法和应用工业微生物生产的技术；为学位研究课题奠定应用工业微生物的技术基础。 课程编号：020202 课程名称：工业微生物育种学（Genentic Improvement of Industrial Microorganisms） 总学时：46 学分：2.0 主讲教师：诸葛健(教授) 主要内容:绪论、诱变育种、原生质体育种技术、基因工程育种技术。通过本课程的学习，将进一步规范微生物操作，完成单元实验和组合实验，为进入研究课题奠定有关的基础理论和实验技能。 课程编号：020203 课程名称:现代微生物实验技术(Modern Microbiology Laboratory Manual) 总学时：46 学分：2.0 主讲教师：诸葛健(教授) 主要内容：显微技术、微生物细胞特殊结构的观察、噬菌体、工业菌种的标记获得、核酸的测定、固定化技术等。通过本课程的学习使学生进一步了解和初步掌握一些现代微生物学上应用的实验技术，有利于学位论文中更多采用现代微生物学实验技术。 课程编号：020204
习题与答案2．简要回答微生物反应与酶促反应的最主要区别？答：微生物反应与酶促反应的最主要区别在于，微生物反应是自催化反应，而酶促反应不是。此外，二者还有以下区别： （1）酶促反应由于其专一性，没有或少有副产物，有利于提取操作，对于微生物反应而言，基质不可能全部转化为目的产物，副产物的产生不可避免，给后期的提取和精制带来困难，这正是造成目前发酵行业下游操作复杂的原因之一。（2）对于微生物反应，除产生产物外，菌体自身也可是一种产物，如果其富含维生素或蛋白质或酶等有用产物时，可用于提取这些物质。（3）与微生物反应相比，酶促反应体系较简单，反应过程的最适条件易于控制。微生物反应是利用活的生物体进行目的产物的生产，因此，产物的获得除受环境因素影响外，也受细胞因素的影响，并且微生物会发生遗传变异，因此，实际控制有一定难度。 （4）酶促反应多限于一步或几步较简单的生化反应过程，与微生物反应相比，在经济上有时并不理想。4．Monod 方程建立的几点假设是什么？Monod 方程与米氏方程主要区别是什么？答：Monod 方程建立的基本假设：微生物生长中，生长培养基中只有一种物质的浓度（其他组分过量）会影响其生长速率，这种物质被称为限制性基质，并且认为微生物为均衡生长且为简单的单一反应。Monod 方程与米氏方程的主要区别如下表所示： Monod 方程与米氏方程的区别Monod 方程：S K S S +=max μμ米氏方程：S K S r r m +=max 经验方程理论推导的机理方程方程中各项含义：μ：生长比速(h -1)μmax ：最大生长比速(h -1)S: 单一限制性底物浓度(mol/L) K S :半饱和常数(mol/L)方程中各项含义：r ：反应速率(mol/L.h)r max ：最大反应速率(mol/L.h)S ：底物浓度(mol/L)K m ：米氏常数(mol/L)适用于单一限制性基质、无抑制的微生物反应。适用于单底物、无抑制的酶促反应。 5．举例简要说明何为微生物反应的结构模型？而且高中资中资料料试卷置时