10免疫组织化学检测技术

什么是免疫组化免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。

免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。

（一）免疫组织化学技术的基本原理免疫组织化学技术是用显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技术。

即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。

通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。

组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。

免疫学的基本原理决定了免疫组织化学技术具有高度特异性，因此，免疫组织化学技术从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。

只有当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。

ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，所以免疫组织化学技术又具有敏感性高的特点。

免疫组织化学及HE染色实验步骤免疫组织化学和HE（Hematoxylin and Eosin）染色是常用的组织学研究技术。

免疫组织化学用于检测组织中特定抗原的表达，可以帮助研究者了解细胞和组织的功能和性质。

HE染色则是常用的常规组织染色方法，用于观察组织的形态学特征。

下面将分别介绍免疫组织化学和HE染色的实验步骤。

1.获取组织标本：首先，需要获取要研究的组织标本，可以是活体组织或固定的组织。

固定的组织标本一般使用10%缓冲福尔马林进行固定。

2.制备标本切片：将标本切割成适合光镜观察的薄片。

切片厚度一般为3-5微米。

3.去蜡：将蜡包埋组织切片放入蜡溶液中，加热脱蜡，使组织切片恢复水化。

4.抗原修复处理：将切片放入抗原修复液中，通过高温或酶解方法进行抗原修复处理，使细胞或组织中的抗原保持完整。

修复液的选择和具体实验要求有关。

5.阻断非特异性结合：将切片浸入阻断液中，阻断非特异性结合位点，减少假阳性结果。

6.一抗孵育：将合适浓度的一抗溶液加到切片上，使其孵育一段时间。

根据要检测抗原的性质选择合适的一抗。

7.二抗孵育和信号增强：将与一抗结合的二抗溶液加到切片上，同时可以加入信号增强剂，提高检测灵敏度。

8.反应显色：将切片加入显色液中，使阳性细胞或组织部分显示出颜色反应。

常用的显色方法有原位杂交、过氧化物酶法和碱性磷酸酶法等。

9.脱水和封片：经过显色后，将切片在酒精中进行脱水处理，然后用透明介质嵌片，并保护封片，以便于观察。

HE染色的实验步骤如下：1.获取组织标本：同样，首先需要获取组织标本，可以是活体组织或固定的组织。

2.制备标本切片：将标本切割成适合光镜观察的薄片。

切片厚度一般为3-5微米。

3.去蜡和水化：将蜡包埋组织切片放入蜡溶液中，加热脱蜡，然后用醇和水进行水化，使组织切片恢复水化。

4.酸性染料处理：将标本切片放入染色液中，使用血红素作为酸性染料，将细胞核染成蓝色。

5.碱性染料处理：将标本切片放入染色液中，使用溴化钡和噻唑蓝作为碱性染料，将细胞质和胞浆染成红色。

第十三章免疫组织化学技术免疫组织化学技术又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。

第一节概述免疫组织化学的基本过程包括：①抗原的提取与纯化；②免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；③将标志物与抗体结合形成标记抗体；④标本的处理与制备；⑤抗原抗体免疫学反应以及标志物呈色反应；⑥观察结果。

一、标本的处理（一）标本的主要来源1.活体组织：应取材于病变组织及病变与正常组织交界处，大小适中。

减少对组织标本的损伤与挤压。

2.体液、穿刺液：可直接涂片或经离心后取沉淀物涂片。

3.培养细胞：悬浮培养的细胞经离心沉淀后做细胞涂片，盖玻片上的单层培养细胞直接固定。

（二）标本的固定与保存1.标本固定的目的：使细胞内蛋白质凝固，细胞内分解酶反应终止，以防止细胞自溶，保持细胞形态和结构；保存组织细胞抗原性；防止标本脱落；除去妨碍抗体结合的类脂，便于保存；抑制组织中细菌的繁殖，防止组织腐败和在后续组织制备中的细胞结构和成分的改变。

标本的固定应以不损伤细胞形态，不干扰固定后抗原的识别和结合为原则。

2.固定剂的选择：蛋白质类抗原，可用乙醇或甲醇固定；微生物抗原可用丙酮或三氯化碳固定；如需除去病毒的蛋白质外壳，可使用胰蛋白酶；多糖类抗原用10%福尔马林固定或以微火加热固定；如有黏液物质存在，应用透明质酸酶等处理除去；类脂质丰富的组织进行蛋白、多糖抗原检测时，需用有机溶剂（乙醚、丙酮等）处理除去类脂。

组织标本常规固定液为中性缓冲甲醛。

3.制片方法的评价：冷冻和石蜡切片是免疫组化最常用的制片方法。

首选冷冻切片。

其操作简便，可避免石蜡切片因固定（甲醛）、脱水、浸蜡等对抗原所造成的损失，适用于不稳定的抗原。

石蜡切片是研究形态学的主要制片方法，它不但是观察组织细胞结构的理想方法，而且可用在陈旧石蜡包埋材料免疫组化的回顾性研究。

免疫组化实验步骤免疫组化操作步骤一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。

它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。

（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2. 水浴锅（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L. 2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。

3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph8.0,加水至1000ml.4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris 碱，用1N的HCl调至pH8.0, 加水1000ml。

5. 酶消化液：a.0.1%胰蛋白酶:用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。

b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。

6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7. 风裱剂：a.甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS(PBS)配制8．TBS/PBS PH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。

a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：A 抗原热修复a 高压热修复在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。

免疫组化原理步骤及试剂原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。

众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。

免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来,以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体(第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合,形成抗原—一抗—二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的,因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）.通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分,在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物,从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量.组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。

分类（常用）1、免疫荧光方法最早建立的免疫组织化学技术.它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素,以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原,在荧光显微镜下观察.当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光,从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。

由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。

2、免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。

基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物,生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。

免疫酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。

免疫组化实验步骤实验目的：检测某抗体在某组织中的表达情况。

实验原理：免疫组化是应用免疫学基本原理--抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术。

实验用品：烤箱、微波炉、显微镜、37℃温箱、通风橱、加样器、滴管、玻片、二甲苯、乙醇（100%、85%、75%）、蒸馏水、0.01M柠檬酸盐、3%H2O2 、1×PBS、10%羊血清、DAB、苏木素（中衫金桥）、1%盐酸酒精、淡氨水、中性树胶，一抗，二抗试剂配制：1、1×PBS（PH 7.2~7.4）磷酸二氢钠 1.5g磷酸氢二钠22gNaCl 42.5g1000ml蒸馏水搅拌溶解，定溶至5000ml2、10%羊血清100%羊血清100μlPBS 900μl3、0.01M柠檬酸盐缓冲液柠檬酸0.8g柠檬酸三钠6g1000ml蒸馏水搅拌溶解，定溶至2000ml4、1%盐酸酒精乙醇300ml盐酸4ml蒸馏水至400ml5、淡氨水蒸馏水495ml浓氨水5ml6、3% H2O2（避光保存）30% H2O2 100μl甲醇900μl7、DAB（现用现配）取1mlDAB缓冲液于离心管中，加入1滴DAB显色剂，混匀实验步骤：1、将载玻片放入烤箱中，60℃，1小时。

2、室温冷却载玻片。

3、脱蜡二甲苯浸洗3次，每次10分钟。

4、水化梯度乙醇水化，100%→85%→75%，每次3分钟。

5、蒸馏水浸洗3次，每次3分钟。

6、抗原修复将玻片浸入盛有500ml 0.01M柠檬酸盐溶液的烧杯中，保鲜膜覆盖，微波高火加热至沸腾，调至解冻温度，12分钟。

7、室温冷却。

8、蒸馏水浸洗3次，每次3分钟。

9、3%H2O2浸洗10分钟，消除内源性过氧化物酶。

10、蒸馏水浸洗一次，3分钟，PBS浸洗2次，每次3分钟。

11、封闭100μι 10%羊血清室温封闭10分钟。

免疫组织化学技术制片的规范和质量控制随着免疫组织化学技术的不断发展，该技术在组织学研究和病理诊断尤其是在肿瘤鉴别诊断的应用越来越广泛。

科学地规范免疫组化技术的操作对保证免疫组化制片质量，提高临床病理诊断水平，促进病理学研究工作的发展有着重要的意义。

影响免疫组化染色结果的因素很多，除了免疫组化染色操作因素外，还包括组织切片制备各个环节的因素。

因此，免疫组化技术的操作规范也要包括组织切片技术的规范。

一、免疫组织化学技术对组织切片的要求免疫组织化学技术适用于冰冻切片和石蜡切片，部分抗体只能用于冰冻切片，大部分抗体可用于石蜡切片，适用于石蜡切片的抗体也适用于冰冻切片。

冰冻切片能很好地保存组织抗原，抗原丢失少，但形态结构差，定位不很清晰；石蜡切片组织形态结构好，定位清晰，但在组织的固定、脱水、包埋等过程中容易破坏组织抗原，使抗原的免疫活性有所降低。

因此在检测石蜡切片组织抗原时，尽可能保存组织抗原的免疫活性十分重要。

二、组织的固定组织离体以后应及时取材固定，组织经过固定后可保存组织原有的形态结构，防止组织抗原弥散。

常用的固定液为10％福尔马林液(4%甲醛液)，最好选用10％中性福尔马林液，固定时间为4-6小时，一般不超过24小时。

固定时间不足，组织结构不佳，组织抗原弥散；固定时间过长，可封闭或破坏组织抗原。

冰冻切片常用的固定液为无水丙酮或4%多聚甲醛，固定时间为10-20min。

三、载玻片的处理组织切片贴在载玻片上进行免疫组织化学染色，由于染色过程操作步骤及冲洗次数较多，容易出现脱片现象，因此将载玻片涂胶或硅化是必要的。

较常用效果较好的是硅化玻片。

硅化玻片的制备：1. 载玻片经酸洗，冲洗干净后烤干。

2. 2％APES丙酮溶液浸1-2min。

3. 无水丙酮液浸1-2min。

3. 蒸馏水浸洗1-2min。

4. 烤干备用。

可用无水酒精代替无水丙酮，也可以直接配成APES水溶液使用。

＊ APES(3-AMINOPROPYLTRIETHOXY-SILANE) 氨丙基三乙氧基硅烷SIGMA产品。

免疫组织化学技术应⽤：细胞表⾯成份的研究胶体⾦技术与冷冻蚀刻技术结合-细胞膜蛋⽩颗粒或其它膜成份进⾏精细定位电镜原位杂交技术，能够在超微⽔平上精确定出基因位点免疫胶体铁细胞化学染⾊法胶体铁是⼀种阳离⼦胶体，将抗体分⼦标记上胶体铁，通过普鲁蓝反应呈⾊，胶体铁颗粒有⼀定⼤⼩，还具有⼀定电⼦密度，可⽤在电镜和光镜⽔平的抗原定位研究。

酶免疫电镜技术酶免疫电镜技术是利⽤酶的⾼效率的催化作⽤对其底物的反应形成不同的电⼦密度，借助于电⼦显微镜观察，证明酶的存在，从⽽对抗原进⾏定位。

第六节免疫组化技术的应⽤⼀、免疫组织化学技术的临床应⽤荧光免疫组织化学技术的应⽤⾃⾝抗体的检测游离在外周⾎中的抗体固定在组织中的的抗体HEP-2细胞抗着丝粒抗体的阳性显⾊肾⼩球抗基底膜抗体的阳性显⾊细菌、病毒的快速鉴定藤黄微球菌绿⾊-活菌红⾊-死菌寄⽣⾍的检测与研究猴胚肾细胞内⼸形⾍繁殖吖啶橙染⾊绿⾊-DNA红⾊-RNA恶变组织中肿瘤抗原的检测⼈肝癌细胞吖啶橙染⾊其他：免疫荧光技术也应⽤于⾎液中B细胞和T细胞及其亚群的鉴定、特殊染⾊体的鉴定、激素和酶的局部组织定位等⽅⾯。

酶免疫组织化学技术的应⽤提⾼病理诊断准确性（HE可观察到炎性细胞浸润，ED1染⾊可观察到巨噬细胞浸润）Survivin在肝癌细胞核的表达癌基因蛋⽩的临床应⽤对肿瘤细胞增⽣程度的评价Ki67在⼩肝癌组织中的表达肿瘤转移分期判断肿瘤的靶向治疗辅助诊断免疫性疾病和感染性疾病，观察免疫复合物沉积状况⼆、免疫组织化学技术的拓展荧光激活细胞分类仪（FACS）FACS是将免疫荧光与细胞⽣物学、流体⼒学、激光和微机信息处理系统等多学科的⾼新技术融为⼀体，进⾏细胞和分⼦⽔平的基础理论与应⽤研究的⼀种先进仪器FACS原理⽰意图488nmlaser+-FluorescenceActivatedCellSortingChargedPlatesSin glecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector共聚焦显微镜技术的应⽤“细胞CT”！激光扫描共聚焦显微镜(LaserScanningConfocalMic roscope，简称LSCM)⼯作原理共轭光路使⾮焦平⾯的光线被抑制，减少了⼲扰，以及使⽤光⾊较纯的激光，所以成像分辨率更⾼增加了激光扫描部分，可连续、固定范围内⼩功率扫描，记录动态变化光学结构为共轭聚焦结构，此结构可使样品中间固定层⾯被激光扫描，通过调节参数可实现样品的多层扫描，俗称“细胞CT”⼀般荧光显微镜（左）与激光共聚焦显微镜（右）的区别LSCM应⽤⼴泛罗丹明123染细胞线粒体细胞器研究-籍特异性荧光探针。

免疫组织学化学染色步骤
免疫组织学化学染色是一种广泛应用于生物医学领域的技术，它可以用于检测细胞和组织中的特定蛋白质或其他分子。

这种技术主要基于抗体与抗原之间的特异性结合，通过标记抗体或抗原来实现染色。

下面是免疫组织学化学染色的步骤：
1. 取样：首先需要从组织或细胞中取得样品。

这可以通过活体组织切片、细胞培养等方法来实现。

2. 固定：将样品进行固定处理，以保持其形态和结构不变。

常用的固定剂包括甲醛、乙醛、乙酸等。

3. 脱水：将样品逐渐浸泡在不同浓度的乙醇中，以去除水分，使其逐渐变得透明。

4. 渗透：将样品逐渐浸泡在不同浓度的蜡中，使其逐渐渗透并浸润其中。

5. 切片：将样品切成非常薄的切片，通常为3-5微米。

6. 抗原修复：对切片进行抗原修复处理，以恢复抗原的免疫原性。

常用的抗原修复方法包括加热、酶解、酸解等。

7. 阻断：将切片浸泡在蛋白质阻断剂中，以防止非特异性结合发生。

8. 一抗：将特异性的一抗加入到切片中，使其与目标抗原结合。

9. 二抗：加入与一抗结合的标记二抗，以形成一抗-二抗复合物。

10. 染色：加入染色剂，使标记二抗发生染色反应，从而可视化目标抗原的分布和定位。

11. 脱色：将多余的染色剂去除，使切片变得清晰可见。

12. 封片：将切片用透明胶封装，以保护其结构和形态。

以上就是免疫组织学化学染色的步骤，这种技术可以用于研究细胞和组织中的蛋白质、细胞因子、核酸等分子，为生物医学领域的研究和诊断提供了重要的工具。