研究生免疫组织化学染色技术精品PPT课件

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免疫组织化学染色技术PPT课件

• 抗原（antigen）
1. 定义：是一类在适合条件下能激发机体免疫系统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物质（抗体和效应细胞）在体内或体外发生特异性结合反应的物质。抗原具有两种性能：
（1）免疫原性（immunogenicity）指抗原分子具有诱导机体产生免疫应答的特性。
（ 2 ）反应原性（ reactogenicity ）指抗原分子与抗体或效应 T 细胞等免疫应答产物发生特异性反应的特性。
6
2. 抗原的分类
免疫学分类
完全抗原、半抗原胸腺依赖抗原与非依赖抗原
临床分类
外源性抗原：微生物、花粉等内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿
瘤相关抗原等同种异型抗原：人类白细胞抗原、
血型抗原异嗜性抗原：人与其他动物、植物
等之间存在的共同抗原7
• 抗体（antibody）
1. 定义：机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答， B淋巴细胞活化、增殖，分化为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白，称为抗体。
间接法：是将酶标记在第二抗体或与第二抗体具有亲和性的某种分子上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。
间接法中所用的一抗是针对组织或细胞中某种抗原的特
异性抗体，多数抗体是由家兔制备的多克隆抗体或由小鼠
制备的单克隆抗体。
10
第二抗体是第一抗体的抗体，所以只要不同的第一抗体均来自同一种属动物，与标记的第二抗体结合就能用来显示不同特异性抗原的存在。这样可避免直接法中标记每一种第一抗体的麻烦。通过某种技术增加第二抗体上标记酶的含量，可提高免疫组织化学染色的敏感度。
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尸检组织由于取材时一般均已超过死亡后2小时以上，组织有不同

2-1 免疫组织化学技术PPT课件

能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应、又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有反应原性，不具免疫原性，又称不完全抗原。大多数多糖和所有的类脂都属于半抗原。
免疫酶组织化学免疫荧光组织化学免疫胶体金组织化学亲和免疫组织化学（抗原信号放大系统）优点：特异性强，敏感度高，应用广泛。
第一节免疫组织化学基本原理
AP磷酸酯水解酶，溴氯羟吲哚磷酸盐(底物）/硝基蓝四唑 (BCIP/NBT) 溴氯羟吲哚磷酸盐(底物）/硝基四紫唑 (BCIP/INT)
AP
NBT/BCIP
蓝紫色
INT/BCIP AP 棕红色或橘黄色
ABC法的优点：敏感性更高 ABC法的缺点： ①亲和素(鸡蛋白)中含有10%糖类，导致背景着色 ②亲和素的等电点约10左右，带较多的负电荷，导致纤维
1.原理:
生物素 (biotin)为含硫的杂环单羧酸，生物素分子量为 244.31，pI为3.5，咪唑酮环（又称Ureido环）(I环)是与亲合素结合的主要部位；Ⅱ环为噻吩环有一个戊酸侧链，末端羧基是标记抗体和酶的唯一结构。
I II
亲和素 (avidin)又称抗生物素蛋白，是一种糖蛋白。天然 (卵白)亲合素为碱性蛋白，分子量为6.8KD，pI 10～10.5；在pH9～13缓冲液中性质均稳定。由4个相同的亚单位构成 4聚体；每个亲合素亚单位通过其结构中的色氨酸残基与生物素中的Ureido环（I环）结合。因此，1个亲合素分子存在4个与生物素分子结合位点
若DAB显色进行以下操作： 11.苏木精复染（10秒钟），自来水冲洗返蓝，脱水透明，
用中性树胶封片。镜下检查结果若AEC或NBT/BCIP
12.AEC和NBT/BCIP显色可进行甲基绿或核真红复染细胞核，水溶性封片剂封片。

《免疫组织化学技术》PPT课件

PTP课件
24
双桥PAP法原理
• 该法是PAP法的改良法，通过两次连接桥抗体和PAP，在抗原抗体复合物上结合比 PAP法更多的酶分子，形成Ag-Ab1-Ab2PAP-Ab2-PAP复合物，最后通过PAP复合物中的HRP催化底物显色。
PTP课件
25
双桥PAP法技术要点
• （1）、（2）、（3）、（4）和（5）同 PAP法。
PTP课件
21
PAP法的原理
PTP课件
22
PAP法技术要点
• （1）、（2）、（3）和（4）同间接法。 • （5）加PAP复合物，温育，使形成Ag-
Ab1-Ab2-PAP复合物，洗涤. • （6）加底物，光镜下观察显色结果。
PTP课件
23
PAP法的方法评价
• PAP法未经化学交联，故避免了抗体和酶活性的降低，并省去酶标记抗体需纯化的繁琐过程。 PAP是由2个抗酶抗体和3个过氧化物酶分子组成的复合物，稳定性好，酶分子不易在染色冲洗过程中脱落。PAP中不存在游离的免疫球蛋白，不易产生非特异性染色，因而特异性、敏感性和重复性良好，比直接染色法、间接染色法和酶桥法更敏感。缺点是PAP复合物制备过程较复杂。
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3
免疫组化技术要点
• 标本的制作 • 抗体的选择 • 温育 • 改善标本的透过性 • 设立对照试验 • 免疫组化的结果判断
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4
标本的制作
• 标本的类型
1.组织切片：①冷冻切片；②石蜡切片 2.印片 3.涂片
• 标本的固定 • 标本的保存 • 酶消化处理
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设立对照试验
• （6）加Ab2，温育，形成Ag-Ab1-Ab2PAP-Ab2复合物，洗涤。

免疫组织化学技术PPT演示课件

6
实验设备
恒温冰冻切片机、脱水机、石蜡包埋机、切片机、摊片机、烤片机、冰箱、电磁炉、高压锅、染色架以及离心机和免疫组化试剂等
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脱水机、石蜡包埋机
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免疫组化技术分类
1、免疫荧光方法 2、免疫酶标方法 3、免疫胶体金技术 4、免疫铁蛋白法 5、放射免疫自显影法
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酶联免疫组织化学
7、烤片：68℃恒温箱内烤片2h
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二.SP（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结）三步法染色步骤
1、脱蜡、水化
• 60℃×20分钟→二甲苯2 × 10分钟 • 100%的绝对乙醇:2×5分钟; • 95% ethanol 2 minutes；95%的乙醇2分钟 • 80% ethanol 2 minutes； • 70% ethanol 2 minutes； • distilled water:5 min；蒸馏水:5分钟 • PBS洗3次×3 min。
• （A：DAB B：H2O2 C：磷酸缓冲液）
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14、自来水冲洗10分钟终止反应 15、复染：苏木精复染2min，盐酸酒精分化 16、自来水冲洗10-15min 17、常规脱水
50% ethanol 1-2 min， 70% ethanol 1-2 min 95% ethanol 1-2 min； 95% ethanol 1-2 min； 100% absolute ethanol: (1-2) min。透明：Xylene 1×(1-2) min→Xylene 2×(1-2) min 封片（用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上）、镜检
11、滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室温或37℃孵育30min-1h
12、PBS冲洗2-3次，每次5min

研究生课程细胞免疫组织化学特殊染色方法及ppt图片演示

细胞免疫组织化学特殊染色方法
特殊染色用于显示标本中的一些结构，使其在显微镜下与其它组织或细胞区别.
特殊染色单一特殊染色一种染料对一种组织结构或细胞进行染色复合特殊染色多种染料对多种组织结构或细胞进行染色
糖原染色方法：
糖原为细胞内的多糖或粘多糖，肝细胞和肌细胞内的糖原最多。糖原的多少，可以反映机体糖代谢的情况。例如：先天性糖代谢紊乱-葡萄糖-6-磷酸酶缺乏、淋巴肉瘤、间皮瘤、肾上腺瘤，肝细胞内都可聚集过多的糖原。
（1）切片脱蜡至水；（2）入0.5%碘乙醇5-10min，自来水洗，蒸馏水洗；（3）入0.5%硫代硫酸钠3-5min；（4）Weigert 铁苏木精10-20min，自来水洗；（5）1%盐酸乙醇分化，自来水洗蓝化；
（6）入丽春红酸性品红液3-5min，蒸馏水速洗；（7）入1%磷酸钼水溶液5min；（8）倾去磷酸钼，直接用2%亮绿液染3-5min；
Masson ′ s三色染色法显示胶原纤维
1、取材：皮下组织或肠系膜铺片 2、固定：Zenker\Bouin\ 10%中性福尔马林缓冲液
3、染液配制
（1）Weigert铁苏木精
A液：苏木精 10g, 95%乙醇100ml B液：29%三氯化铁水溶液 4ml 25%盐酸 1ml 蒸馏水 95ml 用时甲乙两液等份混合，只能用数天。
疏松结缔组织各种成分显示方法：
疏松结缔组织中含有：
胶原纤维、弹性纤维、网状纤维；巨噬细胞、肥大细胞。
一、网状纤维
分布：肝、肾、脾、淋巴结等器官内。
纤维直径0.2-2.0µ m，分支多，交织成网。网状纤维主要由Ⅲ型胶原蛋白组成，表面被覆糖蛋白，在镀银切片呈黑色称为嗜银纤维。
Gomoris镀银法显示网状纤维 1、取材：淋巴结 2、试剂配制（1）硝酸银溶液：硝酸银 10.2g，溶于100ml蒸馏水。（2）氢氧化钠溶液：氢氧化钠 3.1g，溶于100ml蒸馏水。

免疫组化技术课件课件精选课件

色
色
阳性细胞的染色特征：
①阳性细胞的染色分布有三种：胞浆；细胞核；细胞膜表面
②阳性细胞分布：灶性；弥漫性
③染色强度不一
④切片边缘，刀痕or组织折叠，坏死，挤压区，胶原结缔组织等常表现为相同的阳性染色强度。
对于阳性结果的定量判断： -，+，++，+++等分级和计数统计
第二十六页，本课件共有45页
第三十七页，本课件共有45页
免疫组化用于病理诊断及鉴别诊断原则： ①免疫组化用于病理诊断及鉴别诊断，必须以HE染色的
形态学为基础，免疫组化只能作为辅助手段。不能把免疫组化染色作为诊断的“金标准”。
②免疫组化对良、恶性的判断仅供参考。
③免疫组化用于判断组织起源，分型，预后的估计。
④免疫组化染色不好或出现相互矛盾的结果时，以形态学为准。
第四页，本课件共有45页
显示物： ➢酶标反应：
①碱性磷酸酶（Alkatine phasphotase,AP）
AP与不同的底物（萘酚As-Mx、快蓝、快红）作用，可形成不同颜色的终产物。用新品红（New fuchsine）显色，可形成不溶于有机溶剂的红色沉淀，不褪色。
②辣根过氧化酶(Horseradise peroaidase,) HRP：底物为DAB－四盐酸二氨基联苯胺，产生棕色沉淀，不溶于有机溶剂，不褪色。
前列腺特异性抗原（PSA）：甲胎蛋白（AFP）：
甲状腺球蛋白（Tg）：
第三十页，本课件共有45页
软组织标记
软组织：全身各处的纤维结缔组织，脂肪组织，
肌肉组织，滑膜组织及血管淋巴组织。
肌动蛋白（Actin）：分布于所有的肌型细胞中
肌红蛋白（Myoglobin）：是骨骼肌肌浆中的一种

免疫组织化学与组织学相关技术课件(研究生)第二章(1) 免疫组织化学技术

相应试剂
免疫反应
（特异性灵敏性）（颜色直观）
IHC科研应用：研究目标基因/蛋白在细胞中的表达分布与功能
例如：
A. 表达于细胞核；
B、表达于胞浆
IHC科研应用：研究目标基因/蛋白在组织中的表达分布、功能…
IHC临床应用：肿瘤鉴定、分型等
1. “未分化”恶性肿瘤的确定
Ki-67：增殖
相关核抗原，与有丝分裂密切相关
ALP + BCIP——水解产物 + NBT—— NBT formation沉淀
（四）切片的附贴：特别加强
1.载玻片及盖玻片的处理：干净，避免抗原干扰 2.切片的附贴：避免染色过程中切片脱落。
免疫组化染色过程较长含表面活性剂的缓冲液PBS多次浸泡冲洗切片有的石蜡切片染色前要抗原修复（热、高压）
常用附贴剂： 1)甘油-明胶 2)多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine)：最常用 3）APES：现配现用，垂直烤片（气泡） 4）APES和多聚赖氨酸联合：特别易脱落的组织切片
例如：乳腺癌——特定分型、靶向药物
Luminal A型（ER/PR+, Her2-）,预后最好,内分泌治疗(±化疗) Luminal B 型（ER /PR +，Her2 +）,预后较好,化疗+内分泌治疗+靶向治疗
…….
《免疫组织化学技术》主要内容
免疫组化相关的组织学/细胞学技术免疫酶组织化学技术亲和免疫组织化学技术免疫荧光组织化学技术
人子宫颈Ki67 IHC染色 ——宫颈癌
IHC临床应用：肿瘤鉴定、分型等
2. 转移肿瘤的原发部位
例如：角质蛋白丝Keratin——上皮性肿瘤波形蛋白丝Vimentin——间充质分化而来结蛋白丝Desmin——肌肉肿瘤神经丝NF——神经元神经胶质丝GFAP——神经胶质瘤

免疫组织化学技术-精品医学课件 (2)

SA是一种从链酶菌Streptomyces Avidinii 培养物
中提取的蛋白质。也有四个生物素结合位点，是一种亲和力更高的生物素结合蛋白。 SABC复合物：链酶亲和素同一定浓度的生物素化酶混合后形成链酶亲和素－生物素－酶复合物（SABC）。这种复合物至少存在一个尚未被生物素占据的亲和素结合位点，可以和各种生物素标记的抗体结合。
ABC法显示小鼠胸腺IL-6阳性细胞
（Question：胸腺的结构？功能？细胞？）
阳性细胞（巨噬细胞）胞质棕黄色，细胞核绿色（甲基绿）
5.注意事项
（1）内源性生物素活性及其消除：
内源性生物素活性: 某些组织和细胞(肾小管上皮细胞，肝细胞、唾液腺的纹状管上皮细胞、白细胞、乳腺等)具有较强生物素活性，使用本法染色时，会与抗生物素结合而产生非特异性染色.
特点：亲和素作为“桥”，将生物素化的抗体与生物素化的酶(HRP)连接起来。与PAP法相似，共有三个抗体：
原理： + 第一抗体（未标记的相关抗原特异性抗体） + 第二抗体（生物素化的桥抗体，能与第一抗体结合） + 生物素-亲和素-过氧化物酶复合物ABC （剩余的亲和素结合位点可与二抗的生物素结合） + 底物，显色反应
CSA 法原理图
CSA法优缺点
优点：
比EnVision法敏感20～100倍。适合于实验病理学和第一抗体昂贵（敏感，可稀释相当
高）、抗原性较弱的IHC检测以及抗原破坏严重、抗原量较少的组织细胞抗原的检测方法。核内抗原的检测（原为杂交）。
缺点：
操作步骤多、孵育时间长。存在严重的内源性干扰（内源性生物素、过氧化物酶、
剩余的亲和素结合位点可与二抗的生物素结 + 底物，显色反应

《免疫学》免疫组织化学的应用ppt课件

05
免疫组织化学的优缺点与展望
优点
高特异性
免疫组织化学技术能够针对特定的抗原进行高特异性识别，
减少非特异性染色。
高灵敏度
通过使用酶或其他标记物，可以检测到极低浓度的抗原，提高检测灵敏度。
定位准确
通过标记特定抗体，可以精确定位抗原在组织中的位置，有助于疾病的诊断和病理研究。
多参数同时检测
《免疫学》免疫组织化学的应用ppt课件
contents
目录
• 免疫组织化学概述 • 免疫组织化学的基本原理 • 免疫组织化学在病理诊断中的应用 • 免疫组织化学在研究中的应用 • 免疫组织化学的优缺点与展望
01
免疫组织化学概述
定义与特点
定义
免疫组织化学是一种利用抗原-抗体反应原理，通过标记抗体来检测和定位组织或细胞内特定抗原物质的技术。
成本较高
需要针对不同的抗原制备特定的抗体，因此成本较高。
展望与未来发展方向
优化技术流程
多技术联合应用
通过改进实验流程和缩短实验时间，提高实验效率和准确性。
将免疫组织化学与其他技术如基因测序、蛋白质组学等相结合，以更全面地了解组织样本中的分子表达情况。
自动化与标准化
临床应用拓展
开发自动化免疫组织化学分析系统，实现标准化操作，减少人为误差。
20世纪80年代
建立了免疫酶标技术，提高了检测的灵敏度和特异性。
20世纪70年代
建立了免疫荧光技术，成为最早的免疫组织化学技术。
20世纪90年代至今
免疫组织化学技术不断改进和完善，应用范围不断扩大。
02
免疫组织化学的基本原理
抗原-抗体反应
抗原和抗体结合的特异性

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3.颗粒性显色
DAB显色在高倍镜下呈颗粒状而非均匀着色。
武汉大学病理教研室
写在最后
成功的基础在于好的学习习惯
The foundation of success lies in good habits
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谢谢聆听
·学习就是为了达到一定目的而努力去干, 是为一个目标去战胜各种困难的过程,这个过程会充满压力、痛苦和挫折
检测及显色系统
一般采用以生物素标记的辣根过氧化物酶为基础的
检测方法。如SP、LSABC、ABC等
显色方法：经常采用辣根过氧化物酶系统检测
武汉大学病理教研室
显色系统
常用的酶 1.辣根过氧化物酶(HRP) A:显色底物DAB-----棕黄色敏感度高、定位清晰、易于观察、保存 B:显色底物AEC-----砖红色 2.碱性磷酸酶(AP) 显色底物:BCIP/NBT----蓝紫色
武性过氧化物酶的灭活血清封闭冲洗抗体选择及一抗孵育时间检测及显色系统复染
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染色前处理－取材、脱水、浸蜡
组织及时固定
固定剂选择：10%中性缓冲福尔马林 4%多聚甲醛
常规下固定8-24小时取材厚度：2mm
武汉大学病理教研室
抗原修复
滴加二抗
滴加特异性一抗
阻断内源性过氧化物酶
正常血清封闭
滴加三抗
显色
复染
封片武汉大学病理教研室
具体步骤如下： 1．石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，以0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 2．所有组织均采用微波修复抗原； 3．室温冷却后，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 4．滴加50μl过氧化物酶阻断液（试剂A），37℃湿盒孵育 10min； 5．0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 6．滴加非免疫性动物血清（试剂B），37℃湿盒孵育 10min；
IHC通过检测细胞内、细胞表面或细胞间的正常或异常的物质，以研究组织细胞的正常生理、代谢及疾病的病因、发病机理，广泛用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的检测，细胞属性的判定、淋巴细胞的免疫表型分析、细胞增殖和凋亡的研究，以及细胞周期和信号转导的研究等。
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实验名称
链霉菌亲和素-过氧化物酶连结法
染色前处理－预防脱片
常选用多聚耐氨酸（poly-L-lysine）注意：1）应严格控制使用次数 2）玻片洁净度
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染色前处理－包埋与切片
包埋：选择低熔点石蜡，温度不超过62℃ 切片：厚度 3-4μm 烤片：温度60℃，时间1小时；或60℃2小时
（迈新）；或60℃过夜
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(Streptavidin-Peroxidase Conjugated Method, 简称S-P法)
检测胃癌组织CK／Vimentin的蛋白表达
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S-P法原理示意图
链酶亲和素生物素化二抗
过氧化物酶生物素
待测抗原
特异性一抗
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免疫组织化学基本实验流程
组织、细胞标本
染色前处理－切片保存
切片不宜长时间在常温下保存
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染色前处理－脱腊
原则：免疫组化的脱蜡试剂应与常规HE 脱蜡分开
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实验操作中的应用
抗原修复实验操作中的注意事项
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抗原修复
影响染色结果的最关键因素抗原修复方法分类
1）酶消化法 2）加热法（高压法›水煮法›微波法）
免疫组织化学技术的定义
免疫组织化学技术 (Immunohistochemistry, IHC)是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内的抗原（或抗体）的分布进行定位、定性、定量检测，经过组织化学呈色反应在组织原位显示抗原（或抗体），如各种蛋白质、多肽、磷脂和多糖等成分的一门新技术。
免疫组织化学的应用
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冲洗
一般采用PBS（PH 7.4-7.6）充分冲洗增加效果可加入Tween20
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一抗孵育时间及抗体选择
应选择信誉高、质量好的试剂公司抗体切忌反复冻融一抗为浓缩液时，需选择最佳稀释浓度按说明书可采用 37℃ 1-2 小时或 4℃ 冰箱过夜
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结果分析
1.特定的定位
胞膜型、胞浆型、全浆型或胞核型，局限性或弥散性。
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CK10
免疫组化标准化照片
ER
CD44v6
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2.染色的不均一性
阳性切片的染色应分布不均，片状或点状散在分布；染色强弱也不等，颜色深浅反映抗原量的多少。
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人肝癌中EGFR的表武达汉大学病理教研室
武汉大学病理教研室
7．甩去多余血清，分别滴加２种抗体，4℃湿盒孵育过夜， 0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 8．滴加生物素标记的二抗（试剂C），37℃湿盒孵育 15min，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 9．滴加链亲和素-过氧化物酶溶液（试剂D），37℃湿盒孵育 15min， 0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min ； 10．每片滴加新鲜配制的二甲基联苯胺（DAB）显色液，光镜下控制反应时间（约为1-5min），自来水充分冲洗，苏木素复染； 11．常规脱水、透明、中性树胶封片并镜检分析； 12．阳性对照采用已知阳性片为标准，阴性对照采用PBS取代第一抗体，其余步骤相同。
抗原修复液的选择
1）柠檬酸盐缓冲液（PH 7.2-7.4） 2）Tris（PH 7-8） 3） EDTA（PH 8.0）
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内源性过氧化物酶的灭活
存在部位：红细胞、横纹肌细胞、粒细胞、单核细胞、肝细胞及肾细胞
消除方法：3% H2O2 浸泡10分钟
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血清封闭
目的：减少非特异性着色时间：一般在加载一抗之前使用
武汉大学病理教研室
复染
原则：注意两者之间对比，突出阳性信号
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实验对照设计
原则：所有检测指标均设阳性对照、阴性对照
编号阳性片待检片阴性对照
结论
1
－
－
－操作失误，抗体失效
2
＋
＋
＋
非特异性着色
3
－
＋
－
阳性片不含靶抗原
4
＋
－
－待检片不含定位抗原
5
＋
＋
－
待检片含定位抗原
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