乳酸菌快速检测方法的建立(1)

乳酸菌镜检方法及显微镜使用方法-CAL-FENGHAL-(YICAI)-Company One 1乳酸菌精简方法及显微镜使用方法第一部分：乳酸菌镜检可以采用革兰氏染色方法。

第二部分：使用显微镜的油镜进行镜检, 下而是具体的染色方法和镜检方法，请参考。

第一部分=乳酸菌革兰氏染色方法1目的在乳酸菌发放之前，利用标准的革兰氏染色法对即将发放的乳酸菌悬液或乳酸菌样品进行检测，观察乳酸菌乳酸菌在显微镜下的形态。

2原理通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌山于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在墜内，使其仍呈紫色：而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。

3实验用品准备:灭菌玻片、lO-lOOul移液器、lO-lOOul灭菌移液吸头、lOOul- lOOOul移液器、lOOul-lOOOul移液吸头、接种环、酒精灯、打火机、革兰氏染色液、吸水纸、显微镜、香柏油、擦镜纸、计时器4操作:1涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，用移液枪吸取lOul待检样品滴在载玻片的中央，用烧红冷却后的接种环将液滴涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。

2干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。

约需时20-30S,随即水洗。

在涂片薄膜上滴加沙黄染液「2滴，使染色液覆盖涂片，染色约 Imirio10水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。

11干燥、观察：用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观 察，发现U的物后滴一滴浸油在玻片上，用油镜观察细菌的形态 及颜色，紫色的是革兰氏阳性菌，红色的是革兰氏阴性菌。

测试片方法快速检测活性乳酸菌饮料中的乳酸菌总数作者：霍建伟来源：《食品安全导刊·中旬刊》2020年第04期作者简介：霍建伟（1983-），男，工程师，从事食品微生物检测及食品安全质量控制工作。

摘要：国标乳酸菌检测方法中，对于仅含乳杆菌类的检测，需要3天的时间，且需要在厌氧环境中培养，3M乳酸菌测试片方法，测试片自带厌氧环境，可在正常有氧环境下培养，检测时间2天，提高检测效率，本文针对活性乳酸菌饮料（仅含乳杆菌类）在乳酸菌检测时，对2种方法进行了一致性比较，为企业更好的应用该产品提供有效数据。

关键词：测试片方法，乳酸菌检测，提高效率0引言活性乳酸菌饮料（仅包含乳杆菌类）含有大量的乳酸菌，一般出厂时乳酸菌含量大于107 CFU/ml，目前国标的检测方法是GB 4789.35-2016乳酸菌检测，对于乳杆菌类的检测，需要厌氧培养，72小时出具结果，企业多数采用的是厌氧罐加厌氧袋加厌氧指示剂的方式，为厌氧培养提供条件。

3M 乳酸菌测试片是一种即用型培养基系统，测试片含有氧气清除的成分，使其能够自带厌氧环境，可直接在培养箱中培养，无需厌氧罐等辅助设备，且可以在48小时出具结果。

本文对2种方法进行比较，通过大量实验数据表明2种方法的一致性，并且3M 乳酸菌测试片方法能提高效率和快速出具检测结果。

1 实验1.1材料、试剂和仪器活性乳酸菌饮料（仅包含乳杆菌类），市场购买。

恒温培养箱：36 ℃±1 ℃;天平：感量为0.1 g;均质器;无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头;无菌锥形瓶：容量250 mL、500 mL;无菌培养皿：直径90 mm; 3MTM PetrifilmTM乳酸菌测试片;厌氧罐;厌氧剂;厌氧指示剂，MRS琼脂培养基。

1.2方法：1.2.1 样品的处理样品应先将其充分摇匀后，以无菌吸管吸取样品25 mL 放入装有225 mL生理盐水（提前灭菌）的无菌锥形瓶中，充分振摇，制成1：10 的样品匀液。

万方数据（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ）１．２１３５均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心；乳酸乳球菌乳酸亚种／３６ｅ（Ｌ．／ａｃｔ／ｓｓｕｂｓｐ．１ａｔｉｓ／３６ｅ）、德氏乳杆菌乳酸亚种／３６ｅ（￡．ｄｅ／ｂｒｕｅｃｋ／／ｓｕｂｓｐ．１ａｔｉｓ／３６ｅ）和粪肠球菌（Ｅ．ｆａ，瑚ｌｉｓ／３６ｅ）由军事医学科学院十一所全军基因工程重点实验室保存，均含质粒ｐｌＶｌＧ３６ｅ（荷兰Ｇｒｏｒｌｉｎｇｅｎ大学Ｊ．Ｋｏｋ博士惠赠）［２｜。

１．２试剂限制性核酸内切酶为ＴａＫａＲａ公司产品；溶菌酶（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）为Ｓｉｇｍａ公司产品；红霉素为Ｌｖｓｈｅｎｇｙｕａｎ生物工程公司产品；其他主要试剂均为进口或国产分析纯。

１．３培养基ＭＩＬＳ培养基（乳酸菌专用培养基）［１０］：蛋白胨１０ｇ，牛肉膏１０ｇ，酵母粉５ｇ，Ｋ２ＨＰ０４２ｇ，柠檬酸三铵２ｇ，Ｔｗｅｅｎ－８０ｌｍｌ，ＮａＡｃ５ｇ，ＭｇＳ０４０．５ｇ，ＭｎＳ０４０．２５ｇ，葡萄糖２０ｇ，加水至１Ｌ，ｐＨ６．２．６．６，８４０Ｐａ３０ｍｉｎ灭菌。

固体培养基由１００ｍｌ液体培养基中加１．６ｇ琼脂粉配成。

红霉素在Ｌ．／ａｃｔ／ｓｓｕｂｓｐ．１ａｄｓ／３６ｅ和Ｅ．ｆａｅｃａ／／ｓ／３６ｅ使用浓度均为５ｔ唱／ｍｌ，在Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐ．１ａｔｉｓ／３６ｅ使用浓度为２．５∥ＩＩｌｌ。

１．４质粒提取方法１．４．１方法１：乳酸菌的收集和裂解按照０’Ｓｕｌｌｉｖａｎ等［８］８建立的方法进行，但所使用溶液体积减半；质粒的抽提和回收按照大肠杆菌质粒提取方法【９Ｊ９进行。

１．４．２方法２：按０’Ｓｕｌｌｉｖａｎ等［８］建立的方法进行乳酸菌质粒提取，但所使用的溶液体积减半。

１．４．３方法３：按０’Ｓｕｌｌｉｖａｎ等【８］建立的方法进行乳酸菌质粒提取。

１．５不同提取质粒方法的比较将培养的３种含质粒ｐＭＧ３６ｅ的乳酸菌（￡．妇．ｔ／ｓｓｕｂｓｐ．ｈａｆｔｓ／３６ｅ，Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐ．１ａｔｉｓ／３６ｅ，Ｅ．ｆａｅｃａ／／ｓ／３６ｅ）分别离心，收集等体积的培养物（一般为３ｍ１）３管，分别按３种方法进行乳酸菌质粒提取，最后将质粒溶解在等体积的ＲＴＥ中，取相同剂量的质粒进行电泳分析。

乳酸菌鉴定方法嘿，你问乳酸菌的鉴定方法哈。

那我们得先从形态学方面入手。

把含有乳酸菌的样本放在显微镜下观察。

乳酸菌的形状有点特别，大多数是杆状或者球状的。

就像一个个小卫士，在微观世界里排着队。

你可以看看它们的大小，一般都比较小，得仔细观察才能看清它们的模样。

有的乳酸菌还会连在一起，像一串串小珠子似的。

再说说菌落特征。

把乳酸菌接种到固体培养基上，让它们生长繁殖。

过一段时间后，你会看到培养基上长出了一个个小菌落。

乳酸菌的菌落通常比较小，而且表面光滑、湿润。

有点像小小的露珠落在培养基上。

颜色一般是白色或者乳白色的，看起来很干净。

接着讲讲生化反应鉴定。

乳酸菌能发酵一些糖类，比如葡萄糖、乳糖等。

我们可以通过检测它们发酵糖类产生的产物来鉴定。

比如检测有没有产生乳酸，因为乳酸菌的名字可不是白叫的，它们可是产乳酸的能手。

可以用一些化学试剂来检测，要是试剂变色了，那就说明产生了乳酸。

还有一个方法是通过分子生物学技术来鉴定。

这就有点像用高科技手段来识别乳酸菌。

提取乳酸菌的DNA，然后用特定的引物进行PCR 扩增。

就像给乳酸菌的DNA 做个标记，这样就能准确地知道是不是乳酸菌了。

我给你讲个事儿哈。

在一家做酸奶的工厂里，他们很关心酸奶里的乳酸菌。

有一次，他们怀疑酸奶里的乳酸菌有点问题，就开始进行鉴定。

先把酸奶样品放在显微镜下看，发现有很多球状的小东西，看着像是乳酸菌。

然后把样品接种到培养基上，长出了好多小菌落，菌落的特征和乳酸菌的很像。

接着他们又做了生化反应测试，发现这些菌确实能发酵乳糖产生乳酸。

最后还不放心，又用分子生物学技术验证了一下，确定就是乳酸菌。

这样他们就放心了，知道自己的酸奶里有足够的、正宗的乳酸菌。

在鉴定乳酸菌的时候，每一个方法都很重要。

就像我们认识一个人，要从不同的方面去了解。

不能只看外表，还得看看他的行为、习惯等。

鉴定乳酸菌也是一样，综合运用这些方法，才能准确地鉴定出乳酸菌。

而且操作过程要仔细，不能马虎，不然就可能得出错误的结论。

一、乳酸菌检测方法植物乳杆菌的检验1原理植物乳杆菌能在相应的厌氧培养条件下，于MRS培养基表面生长成白色、细密、圆形光滑突起的菌落，根据长出的菌落数和稀释倍数，计算出活菌数。

2仪器与试药2.1 仪器超净工作台、高压蒸汽灭菌器、恒温干燥箱、电冰箱、恒温培养箱（60℃±1℃）、恒温水浴锅、显微镜（10x—100x）、架盘天平（0—500g，精确至0.5g）、250ml锥形瓶、250ml 盐水瓶、灭菌吸管：1ml(具0.01ml刻度）、10ml(具0.1ml刻度）、灭菌平皿（直径90mm）、灭菌试管（15mm×160mm）、灭菌L型玻璃棒等。

2.2 试药酪蛋白胨、牛肉浸膏、酵母提取物、琼脂等均为生化试剂；无水乙酸钠、柠檬酸三胺、硫酸镁、硫酸锰、葡萄糖、磷酸氢二钾、碳酸钙、吐温-80、氯化钠等均为分析纯；水为双蒸馏水，其他化学试剂均为分析纯。

2.3 MRS琼脂培养基的组成与制备2.3.1培养基的组成酪蛋白胨10g、牛肉浸膏10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、无水乙酸钠5g、柠檬酸三胺3g、硫酸镁0.5g、硫酸锰0.2g、磷酸氢二钾2.0g、碳酸钙20g、吐温-801ml、琼脂15g、蒸馏水1000ml。

2.3.2培养基制备将上述的各组分在80～90℃加热使溶解，校正pH6.2，加蒸馏水至1000ml中，摇匀，分装于盐水瓶，每瓶100ml。

在121℃高压灭菌20分钟，冷却后备用。

2.4营养琼脂平板的制备取冷至45℃左右的MCA琼脂培养基，在无菌的条件下倒入无菌的培养皿中，每平皿各约15ml，待冷却凝固后，备用。

2.5无菌生理盐水的制备称取氯化钠9.0g，用蒸馏水溶解并定容于1000ml量瓶中，摇匀，分装于250ml三角瓶中，每瓶装90ml. 在121℃高压灭菌20分钟，冷却后备用。

3供试品溶液的制备以无菌操作法取检品10.0g，加入盛有90ml无菌生理盐的三角瓶中，充分振荡10分钟，制成1﹕10样品悬液。

乳酸细菌分类鉴定及实验方法乳酸细菌是一类可以发酵果糖或蔗糖产生乳酸的革兰氏阳性细菌。

它们广泛存在于自然界中的土壤、水体、动物肠道、植物表面等环境中，并且在食品加工、乳制品、膳食补充剂等领域具有重要的应用价值。

分类鉴定乳酸细菌的方法主要包括传统分离鉴定和分子生物学方法，而实验方法主要包括培养、生理生化鉴定和分子鉴定等。

1.传统分离鉴定传统分离鉴定是通过培养、生理生化特性的观察和细菌形态学特征的分析来进行分类鉴定的方法。

一般的步骤包括：1.2分离：采用适当的培养基，如MRS培养基等，在适当条件下进行分离培养。

可以采用不同的稀释度和培养温度来增加分离率和适应性。

1.3纯化：从培养出的菌落中选择纯净的菌落进行纯化。

1.4形态学观察：观察细菌的形态学特征，如菌落形态、细胞形态、孢子形态等。

1.5生理生化特性鉴定：通过生理生化实验，如氧需氧性、产气、产酸、碱性产蛋白酶等特性的鉴定来进一步确定细菌的分类。

1.6比较分析：将鉴定结果与已知的乳酸菌进行比较分析，以确定菌株的分类。

2.分子生物学方法分子生物学方法是一种快速、准确的分类鉴定方法，可以通过检测细菌的DNA序列来进行鉴定。

常用的分子生物学方法包括PCR、16SrRNA测序和随机扩增多态性DNA(RAPD)等。

2.1PCR：PCR是通过扩增细菌DNA的特定区域来进行鉴定的方法。

首先，从培养的细菌中提取DNA。

然后，使用特定引物扩增目标区域的DNA，并通过凝胶电泳分析PCR产物的大小。

比较PCR产物的片段大小和带型模式，可以确定乳酸菌的分类。

2.216SrRNA测序：细菌的16SrRNA序列是一个高度保守的基因序列，可以用来进行细菌分类鉴定。

通过提取DNA，扩增16SrRNA基因片段，并进行测序，然后将测序结果与已知的乳酸菌序列比对，可以确定细菌的分类。

2.3RAPD：RAPD是一种无须事先了解目标序列的技术，它利用随机引物扩增细菌DNA的多态位点，通过凝胶电泳分析不同样品间的DNA带型模式，来进行菌株分类。

引言概述：乳酸菌饮料是一种富含乳酸菌的食品，乳酸菌在食品工业中广泛应用于酸奶、乳饮料等产品中。

本文将详细介绍乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物检验方法。

正文内容：一、样品采集和制备1.确定样品采集时机：乳酸菌饮料中的乳酸菌数量会随着储存时间的增加而增加或减少，因此需要在存储时间稳定的情况下进行采集。

2.采集样品方法：使用无菌技术采集样品，避免外部微生物的污染。

3.样品制备：将采集到的样品进行均匀搅拌，以保证样品的均匀性。

二、总菌数检验方法1.琼脂平板法：将样品制备成一定稀释倍数的悬浮液，在琼脂平板上涂布，经过一定孵育时间后，根据菌落的数量计算总菌数。

2.膜过滤法：将样品通过膜过滤器过滤，将过滤后的膜放置在琼脂平板上孵育，根据菌落的数量计算总菌数。

三、乳酸菌检验方法1.培养基选择：根据乳酸菌的生长特性选择适合的培养基，常见的培养基有MRS培养基、LBS培养基等。

2.乳酸菌的分离：将样品制备成一定稀释倍数的悬浮液，均匀涂布在选定的培养基上。

经过一定孵育时间后，可以观察到乳酸菌形成的菌落。

3.鉴定乳酸菌：使用形态学观察、生理生化试验和分子生物学方法等进行乳酸菌的鉴定。

四、活菌数检验方法1.孵育培养基法：将样品制备成一定稀释倍数的悬浮液，均匀涂布在含有乳酸菌生长所需营养物质的培养基上。

经过一定孵育时间后，观察活菌的生长情况，计算活菌数。

2.阻碍培养基法：将样品制备成一定稀释倍数的悬浮液，与含有抑制剂的培养基混合。

通过观察生长情况，计算活菌数。

五、质量指标评价方法1.pH值测定：使用pH计或试纸对乳酸菌饮料中的pH值进行测定，根据标准范围评价产品的质量。

2.乳酸浓度测定：使用乳酸测定仪器或化学试剂对乳酸菌饮料中的乳酸浓度进行测定，根据标准范围评价产品的质量。

3.品尝评价：通过专业的品尝人员进行品尝评价，评估乳酸菌饮料的口感和风味。

总结：乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物检验方法包括样品采集和制备、总菌数检验、乳酸菌检验、活菌数检验和质量指标评价方法。

食品微生物学检测乳酸菌检测方法设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：1.1恒温培养箱：36℃±1℃1.2冰箱：2℃~5℃1.3均质器及无菌均值袋、均质杯或灭菌乳钵1.4天平：感量0.1g1.5无菌试管：18mm⨯180mm、15mm⨯100mm1.6菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.01mL刻度）或微量移无液器及吸头1.7无菌锥形瓶：500mL、250mL1.样品制备2.1样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。

2.2冷冻样品可先使其在2℃~5℃条件下解冻，时间不超过8h，也可在温度不超过45℃的条件下解冻，时间不超过15min。

2.3固体和半固体食品：以无菌操作称取25g样品，置于装有225mL生理盐水的无菌均质杯内，于8000r/min~10000r/min均质1min~2min，制成1:10样品匀液；或置于225mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min~2min制成1:10样品匀液。

2.4液体样品：液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分振摇，制成1:10的样品匀液。

操作步骤3.1用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水的无菌试管中（注意吸头尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用1支无菌试管反复吹打使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。

3.2另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。

2.乳酸菌总数：根据待检样品活菌总数的估计，选择2个~3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1mL样品匀液分别置于2个MRS琼脂平板，使用L形棒进行表面涂布。

36℃±1℃，厌氧培养48h±2h后计数平板上所有菌落数。

乳酸菌检验方法乳酸菌是指一群能分解葡萄糖或乳糖产生乳酸，需氧和兼性厌氧，多数无动力，过氧化氢酶阴性，革兰氏阳性的无芽胞杆菌和球菌。

这类细菌在自然界分布广泛，可栖居在人和各种动物的口腔、肠道等器官内，在土壤、食品、饲料、水及一些临床标本中都有乳酸菌的存在。

乳酸菌在工业、农业和医药等与人类生活密切相关的领域应用价值很高，相当多的乳酸菌对人、畜的健康起着有益的作用，但个别菌种能对人畜致病，乳酸菌主要包括23个属的细菌。

二样本采集检样主要为含乳酸菌活菌的饮料和微生态制剂，样本应放入冰箱保存，心快检验。

三检验方法（中华人民共和国国家标准乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物学检验GB／T 16347-1996）乳酸菌菌总数的测定：乳酸菌菌落总数是指标样在一定条件下培养后，所得1ml检样中所含乳酸菌菌落的总数。

（一）检验程序乳酸菌菌落总数检验程序如下：（二）培养基和试剂改良TJA培养基（改良番茄汁琼脂培养基）；改良MC培养基（modified Chalmers培养基）；0.1％亚甲蓝牛乳培养基；6.5％氯化钠肉汤参照；pH9.6葡萄糖肉汤；40％胆汁肉汤；淀粉水解培养基；精氨酸水解培养基；乳酸杆菌糖发酵管；七叶苷培养基；革兰氏染色液；3％过氧化氢溶液；蛋白胨水、靛基质试剂；明胶培养基；硝酸盐培养基、硝酸盐试剂；生理盐水：定量分装于三角瓶和试管内灭菌。

（三）操作步骤1．以无菌操作将经过充分摇匀的检样25ml（或25g）放入含有225ml灭菌生理盐水的来菌广口瓶内做成1：10的均匀稀释液。

2．用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1m，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液）。

3．另取1ml灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍增稀释液，如此每递增一次，即换用1支1ml灭菌吸管。

4．选择2～3个以上适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。