抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性测定试剂盒说明书

碧云天生物技术/Beyotime Biotechnology 订货热线：400-1683301或800-8283301 订货e-mail ：******************技术咨询：*****************网址：碧云天网站 微信公众号谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒(NADPH 法)产品编号 产品名称包装 S0056谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒(NADPH 法)100次产品简介：谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒(NADPH 法)(Cellular Glutathione Peroxidase Assay Kit with NADPH)是一种简单易行的通过紫外比色来检测细胞、组织或其它样品中谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GPx)活性的试剂盒。

绝大部分细胞内的谷胱甘肽过氧化物酶都是含硒的，且硒为该酶的活性中心组成部分。

细胞内也有很少量的不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶存在。

本试剂盒检测的是最常见的含硒的谷胱甘肽过氧化物酶。

本试剂盒的使用灵活方便，样品用量和检测时间的范围宽，样品用量可以根据样品中GPx 的活力在0.1-50微升之间调整，检测时间可以根据样品中GPx 的活力在5-30分钟内进行调整。

本试剂盒和总谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒(S0058)配合使用，可以定量检测出样品中不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶。

谷胱甘肽过氧化物酶可以清除活细胞内的过氧化物，在保护细胞免受自由基损伤过程中起着关键作用。

细胞内的脂类容易和自由基发生反应，产生脂类过氧化物。

谷胱甘肽过氧化物酶可以利用还原型谷胱甘肽(GSH)还原脂类过氧化物，从而消除自由基的毒害作用。

谷胱甘肽过氧化物酶几乎在所有组织中都有分布。

在一些病理状况下谷胱甘肽过氧化物酶的活力会发生明显上调或下调。

谷胱甘肽过氧化物酶可以利用还原型谷胱甘肽(GSH)催化过氧化氢以及许多有机过氧化物，产生水或有机醇。

但以过氧化氢为底物进行检测会受同样可以分解过氧化氢的过氧化氢酶(Catalase)的影响，因为过氧化氢酶的酶活性会干扰谷胱甘肽过氧化物酶的测定。

货号: QS1008 规格：50管/48样单脱氢抗坏血酸还原酶（monodehydroascorbate reductase,MDHAR）活性测定试剂盒说明书紫外分光光度法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：MDHAR催化MDHA还原生成AsA，在抗坏血酸氧化还原代谢中具有重要作用。

测定原理：MDHAR 催化 NADH 还原MDHA 生成 AsA和NAD+，NADH在340 nm有特征吸收峰，但是NAD+没有。

通过测定340 nm光吸收下降速率，来计算出MDHAR活性。

自备实验用品及仪器：研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计、1mL石英比色皿、可调式移液枪和双蒸水试剂组成和配置：试剂一：液体50mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体50mL×1瓶，室温保存。

试剂三：粉剂×1瓶，4℃避光保存。

临用前加入5mL蒸馏水充分溶解。

试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。

临用前加入5mL蒸馏水充分溶解。

试剂五：液体25μL×1瓶，4℃保存。

临用前加5mL试剂二充分溶解。

粗酶液提取：1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。

8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

2.. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；8000g ，4℃离心20min，取上清液置冰上混匀待测。

3. 血清等液体：直接测定。

MDHAR测定操作：1. 分光光度计预热30 min，调节波长到340 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二在25℃水浴锅中预热30 min。

3. 依次在比色皿中加入100μL试剂三、100μL试剂四、100μL试剂五和600μL试剂二，最后加入100μL上清液，迅速混匀后于340nm比色，记录30s和150s的吸光值A1和A2，△A=A1-A2。

谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px/GPX ）活性检测试剂盒说明书微量法注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC1195规格：100T/48S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

试剂名称规格保存条件提取液液体60 mL×1瓶4℃保存试剂一粉剂×2瓶4℃保存试剂二液体10 μL×1瓶4℃保存试剂三液体30mL×1瓶4℃保存试剂四液体15 mL×1瓶4℃保存试剂五液体5mL×1瓶4℃保存标准品粉剂×1支 4℃保存稀释液液体20 mL×1瓶4℃保存溶液的配制：1、试剂一：临用前加入3.3 mL 稀释液，充分溶解；2、试剂二：临用前按2 μL 试剂二：10 mL 蒸馏水的比例稀释试剂二，现用现配；3、试剂三：瓶底若有结晶可50℃水浴溶解，此溶液为饱和溶液，若底部最终还有结晶，吸取上清使用即可；4、标准品：10 mg 还原型谷胱甘肽。

临用前加入0.405 mL 稀释液溶解为80 μmol/mL 的标准溶液备用。

产品说明：谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px 或GPX ）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。

GPX能够催化还原型谷胱甘肽（GSH ）生成氧化型谷胱甘肽（GSSG ），使有毒的过氧化氢还原成无毒的羟基化合物。

GPX 催化H 2O 2氧化GSH ，产生GSSG ，GSH 能与DTNB 生成在412nm 处有特征吸收峰的化合物，412nm 下吸光度的下降即可反应GPX 的活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、天平、台式离心机、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、EP 管。

植物抗坏血酸过氧化物酶的作用机制、酶学及分子特性一、本文概述植物抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate Peroxidase，AP）是一种在植物细胞内广泛存在的关键酶，其在植物抗氧化防御系统中发挥着至关重要的作用。

本文旨在全面探讨植物抗坏血酸过氧化物酶的作用机制、酶学特性以及分子特性，以期为深入理解植物抗氧化防御系统的运行规律，以及提高植物抗逆性和农业生产力提供理论基础。

我们将详细介绍抗坏血酸过氧化物酶的生化功能，包括其催化抗坏血酸清除活性氧的能力及其在细胞氧化还原稳态中的作用。

接着，我们将深入探讨抗坏血酸过氧化物酶的酶学性质，如酶的动力学特性、抑制剂和激活剂的影响等。

我们将对抗坏血酸过氧化物酶的分子特性进行阐述，包括其基因结构、表达调控以及蛋白质结构等方面的研究。

通过本文的综述，我们期望能够为植物生物学、农业生物技术以及植物抗逆性研究等领域提供有益的参考和启示。

二、植物抗坏血酸过氧化物酶的作用机制植物抗坏血酸过氧化物酶（AP）是一种关键的抗氧化酶，主要作用是清除植物细胞中的过氧化氢（H2O2），以防止氧化应激对细胞造成的损伤。

AP的作用机制主要涉及到酶的催化活性以及其与底物的相互作用。

在AP的催化过程中，抗坏血酸（AsA）作为还原剂，将H2O2还原为水（H2O），而自身则被氧化为单脱氢抗坏血酸（DHA）。

这个过程可以表示为：2AsA + H2O2 → 2DHA + 2H2O。

DHA随后通过抗坏血酸再生系统被还原回AsA，从而维持了AP的催化循环。

AP的作用机制还涉及到其在细胞内的定位。

在植物细胞中，AP 主要分布在叶绿体、细胞质和线粒体等细胞器中。

这些细胞器中的AP通过特定的信号肽序列被定位到相应的位置，从而实现了对特定区域H2O2的高效清除。

AP的活性还受到多种因素的调节，包括光照、温度、pH值以及底物和抑制剂的浓度等。

光照和温度可以影响AP的稳定性和活性，而pH值则可以影响AP与底物的结合能力。

组织及血液碱性磷酸酶（AKP/ALP ）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法货号：BC2140规格：50T/24S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

试剂名称规格保存条件提取液液体30 mL×1瓶4℃保存试剂一液体10 mL×1瓶4℃保存试剂二液体10 mL×1瓶4℃保存试剂三液体30 mL×1瓶4℃保存标准液液体1 mL×1支4℃保存溶液的配制：1、标准液：10 μmol/mL 酚标准液，临用前蒸馏水稀释至2.5μmol/mL 备用。

产品说明：AKP/ALP 是一种含锌的糖蛋白酶，在碱性环境中可水解各种天然及人工合成的磷脂单酯化合物。

AKP/ALP 广泛分布于人体各脏器中，以肝脏为主。

在碱性环境中，AKP/ALP 催化磷酸苯二钠生成游离酚；酚与4-氨基安替比林和铁氰化钾反应红色亚醌衍生物，在510nm 有特征光吸收；通过测定510nm 吸光度增加速率，来计算AKP 活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）称取约0.1g 组织，加提取液1mL 充分研磨，4℃，10000rpm 离心10min ，取上清液待测。

血液可直接用于测定，或者适当稀释后用于测定。

二、操作步骤1、可见分光光度计预热30min 以上，调节波长到510nm，蒸馏水调零。

2、操作表试剂名称（μL ）测定管对照管空白管标准管蒸馏水--20-标准品---20上清液20---试剂一200200200200试剂二200200200200混匀后置于37℃水浴中保温15min试剂三600600600600上清液-20--混匀后于510nm测定吸光度，分别记为A测定管、A对照管、A空白管、A标准管。

过氧化氢酶过氧化氢酶（（CAT ）测试盒说明书 （可见光法可见光法））说明书修订日期说明书修订日期：：2015.09.24Cat.No ：KGT017 Store at 4℃ for 6 monthsFor Research Use Only （科研专用）一．测定原理测定原理过氧化氢酶（CAT ）分解H 2O 2的反应可通过加入钼酸铵而迅速中止，剩余的H 202与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物，在405nm 处测定其生成量，可计算出CAT 的活力。

二．试剂组成与配制 100T/96样试剂一试剂一：：液体100ml×1瓶，4℃保存6个月； 试剂二试剂二：：底物液体10ml×1瓶，4℃保存6个月；试剂三试剂三：：显色粉剂一瓶，4℃保存6个月。

加双蒸水至100ml 溶解，4℃保存1个月。

（如果底部有不溶粉末沉淀，直接取上清使用，不影响测定结果）试剂四试剂四：：液体10ml×1瓶，4℃保存6个月。

天冷时会凝固，临用前37℃水浴至透明方可使用。

三．操作步骤（一、）、血清血清血清（（浆）的检测的检测：：1、操作表操作表（（如）：对照管 测定管 血清（浆）（ml ） 0.1 试剂一（37℃预温）（ml ） 1.0 1.0 试剂二（37℃预温）（ml ）0.10.1混匀，37℃准确反应1分钟（60秒） 试剂三（ml ） 1.0 1.0 试剂四（ml ） 0.1 0.1 血清（浆）（ml ）0.1混匀，0.5cm 光径，405nm 处，双蒸水调零，测各管吸光度。

注：一般样本没有溶血一般样本没有溶血，，脂血等显著差异情况脂血等显著差异情况，，对照管的样本更换成双蒸水对照管的样本更换成双蒸水，，做1～2管对照即可管对照即可。

如需如需做做样本样本自身自身自身对照对照对照，，则试剂盒试剂盒所所测定测定样本样本样本数量数量数量减减至48样。

2、血清中的CAT 活力的计算活力的计算：：（1、）、定义定义定义：：每毫升血清或血浆每秒钟分解1µmol 的H 2O 2的量为一个活力单位。

一、试剂配置 1、PBS 提取液:每 L 水依次加入 MES(195、2x0. 05=9、76g)、山梨糖醇(0、33x182. 2=60、126g). NaCl(0、010x58、5=0. 585g)、MgCI(0、002x95=0、19g)、EDTA(292. 25x0. 002=0. 5845g). KH2PO4(200x0. 0005=0. Ig)；使用时加入 ASA-Na(!98. 1x0. 002=0. 3962g);2、悬浮液:将 PBS 提取液中得 MES 换为 238、3x0、05=11、915g 得 HEPES(238、3x0、05=1 k 915g);3、80%PercoI;80ml 原液+20ml 水：40%Percol:40ml 原液+60ml 水;实际配制:PBS 提取液20001111（3个处理*2个品种*3个靈复*20m!*3次=1080ml ）.悬浮液1001111（3个处理*2个品种*3个重复次=54n 】l ）;80%Percol 200ml; 40%Percol 200nik (3 个处理*2 个品种*3 个重复*3ml*3 次=162ml)二、提取步骤 1、lOg 鮮样加 20ml 提取 PBS(50mM MES PH6、1,含O 、33M 山梨糖醇JOmM NaCL2mM MgCkfmM EDTA.O 、5 mMKH2POj ・2mM ASA ・Na ・ASA ・Na 使用前现配现加) 2、快速研曆，使叶片碎成绿豆粒大小4层纱布过滤，去除残渣（注意过滤时不可用力挤压，以免叶绿体膜破碎） 3、滤液2000g 3min •小心倒出上淸液，将离心管放入离心机后,使离心机得加速很快上升到预崔值（水平转头.加速度调到9）,约经30s 后很快使加下降停止，整个离心持续大约2・3min 左右完成;4、沉淀用1ml 提取液漂洗表面悬浮物;5、用 1ml 悬浮液（50mMHEPES pH7. 6•含0. 33 mM 山梨糖醇」0NaCl ・2mM MgCb2mM EDTA.O 、5 niMKH2PO4-2mM ASA-Na.ASA-Na 使用前现配现加）将沉淀悬浮，在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷，或者用手 握住离心管在冰块之间搅动，便叶绿体由于震动分散开来，不要用棉球吸滤，以防被膜压破。

过氧化氢酶（Catalase，CAT）试剂盒使用说明测定意义：CAT 是最主要的H 2O 2清除酶，在活性氧清除系统中具有重要作用。

测定原理：H 2O 2在240nm 下有特征吸收峰，CAT 能够分解H 2O 2，使反应溶液240nm 下的吸光度随反应时间而下降，根据吸光度的变化率可计算出CAT 活性。

需自备的仪器和用品：紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水试剂组成和配制：提取液：60mL×1瓶，4℃保存；试剂一：60mL×1瓶，4℃保存；试剂二：100uL×3瓶，4℃保存。

粗酶液提取：1、细菌、细胞或组织样品的制备收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每200万细菌或细胞加入400μL 提取液的比例充分匀浆以破碎并裂解细胞；8000g4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。

称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液进行冰浴匀浆。

8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：1、CAT 检测工作液的配制：用时在每瓶试剂二（100uL）中加入20mL 试剂一，充分混匀，作为工作液。

2、测定前将CAT 检测工作液室温放置，使之温度不低于室温。

3、取1mLCAT 检测工作液于1mL 石英比色皿中，再加入35μL 粗酶液，混匀；室温下立即测定240nm 下的初始吸光值A1和1min 后的吸光值A2。

CAT 活性计算：1、血清（浆）CAT 活力的计算:单位的定义：每升血清（浆）在反应体系中每分钟催化1umol H 2O 2降解定义为一个酶活力单位。

CAT（U/L）＝750×（A1－A2）2、组织CAT 活力计算：（1）按样本蛋白浓度计算：单位的定义：每mg 组织蛋白在反应体系中每分钟催化1nmol H 2O 2降解定义为一个酶活力单位。

CAT（U/mg prot）＝750×（A1－A2）÷蛋白质浓度（mg/mL）（2）按样本鲜重计算：单位的定义：每g 组织在反应体系中每分钟催化1nmol H 2O 2降解定义为一个酶活力单位。

植物抗坏血酸过氧化物酶的概况摘要：抗坏血酸过氧化物酶（aseorbateperoxidase，APX)是植物活性氧代谢中重要的抗氧化酶之一，本文以植物抗坏血酸过氧化物酶的机理，应用等方面对其进行阐述。

关键字：植物抗坏血酸过氧化物酶；机理；应用1 APX的简介抗坏血酸过氧化物酶（aseorbateperoxidase，APX)是植物活性氧代谢中重要的抗氧化酶之一，尤其是叶绿体中清除H2O2的关键酶，又是维生素C代谢的主要酶类。

H2O2是植物叶绿体中光合电子传递链和某些酶反应的天然产物，是具有毒害作用的活性氧[4]。

2 植物中的APXAPX是一种亚铁血红素蛋白，植物的APX存在着多种同工酶，且位于细胞中不同区域。

一种为位于叶绿体中并分解叶绿体中的H2O2的叶绿体型同工酶;另一种为位于叶绿体之外的其它细胞组分的细胞质型同工酶[1]。

这两种同工酶具有共同的特点，但也有不同的方面:①胞质型同工酶APX 占总APX的40%以上；②叶绿体型APX对AsA的专一性比胞质型APX更强；③在不含AsA的介质中，叶绿体型同工酶比细胞质型同工酶更快丧失活性；④叶绿体型同工酶对琉基试剂和经基脉、对氨基苯酚等抑制剂较胞质型同工酶更为敏感；⑤二者的分子量不同[2]。

3 植物APX的机理植物因在光合作用时会释放大量的氧气，故植物会受到被严重氧化的危险。

提高植物体内氧自由基代谢途径中的酶活力,可以增强植物抵御氧化的能力,从而增强植物耐逆能力。

AsA可直接与活性氧反应而将其还原，又可作为酶的底物在活性氧的清除过程中起作用，即在叶绿体类囊体表面作为还原剂参与APX介导的H2O2的清除。

在这一过程中，AsA氧化成MDA。

叶绿体中APX发挥正常的催化作用[6]。

APX是以抗坏血酸(AsA)为电子供体的一种过氧化物酶，是植物体内尤其是叶绿体中清除H2O2的关键酶[1]。

APX催化H2O2还原的化学反应如下:2抗坏血酸(AsA）+H2O2→2单脱氢抗坏血酸(MAD)+H2O产生的单脱氢抗坏血酸可通过不同的途径被还原。

植物的抗氧化防御机制抗氧化防御是植物生长发育和适应环境的重要保护机制。

在光合作用和呼吸过程中，植物会产生大量活性氧自由基，它们具有高度活性、强氧化性和毒性，容易造成细胞膜的脂质过氧化、DNA和蛋白质的损伤，危害植物的生命活动。

为了应对活性氧自由基的挑战，植物演化出了一系列的抗氧化防御机制，以确保细胞的正常功能。

一、酶系统1. 抗坏血酸过氧化物酶（APX）APX是植物中最重要的抗氧化酶之一，它能够将过氧化氢（H2O2）转化为无害的水（H2O）。

当氧化胁迫增加时，植物会提高APX的合成，增强对过氧化氢的清除能力，保护细胞免受氧化损伤。

2. 超氧化物歧化酶（SOD）SOD是植物细胞中另一种重要的抗氧化酶，能够催化超氧自由基（O2-）的歧化反应，将其转化为次氧化氮（H2O2）。

SOD的活性与植物的抗氧化能力密切相关，通过调节SOD的合成和活性，植物能够有效清除细胞内的超氧自由基，减少细胞损伤。

二、非酶系统1. 抗坏血酸（维生素C）抗坏血酸是重要的抗氧化剂，能够捕捉和中和自由基，同时还能够再生其他抗氧化物质的活性，如生育酚和谷胱甘肽。

植物绿叶中富含抗坏血酸，能够稳定叶绿素和光合色素体，在光合作用过程中起到保护作用。

2. 生育酚（维生素E）生育酚是脂溶性的抗氧化物质，主要存在于植物的细胞膜中。

它能够与自由基发生反应，防止脂质过氧化反应的发生。

植物通过调节生育酚合成酶的活性和基因表达水平，来提高细胞膜的抗氧化能力。

3. 谷胱甘肽（GSH）谷胱甘肽是植物体内含量最高的非酶抗氧化物质，它具有与抗坏血酸和生育酚相似的功能。

谷胱甘肽能够与自由基反应，同时还能够与其他抗氧化物质相互作用，形成抗氧化物质网络，提高细胞的抗氧化能力。

三、信号转导通路除了上述的抗氧化物质和酶系统之外，植物还通过信号转导通路来调控抗氧化防御机制。

例如，植物在遭受氧化胁迫时，会激活特定的转录因子和信号分子，进而启动相关的抗氧化基因的表达，增强抗氧化酶的合成和活性。

植物组织抗氧化酶活的测定方法（修订版2020年5月7日）一、待测样品预处理称取鲜样0.5g于预冷的研钵（提前放冰箱）中，加1mL预冷的磷酸缓冲液（0.05mol/L，pH=7.8），冰浴研磨后再加1mL缓冲液，倒入离心管中，再用2mL缓冲液清洗研钵，倒入离心管中，平衡，低温（0-4℃）离心20min（10500rpm），收集上清液，冷藏保存。

磷酸缓冲液配制：A液（0.2mol/L磷酸氢二钠溶液）的配制：称取Na2HPO4·2H2O 35.61g 或Na2HPO4·7H2O 53.65g 或Na2HPO4·12H2O 71.64g 用蒸馏水定容至1000mL。

B液（0.2mol/L磷酸二氢钠溶液）的配制：称取NaH2PO4·H2O 27.6g 或NaH2PO4·2H2O 31.21g 用蒸馏水定容至1000mL。

磷酸缓冲液（0.05mol/L，pH=7.8）配制：45.75mL A+ 4.25mL B定容至200mL。

磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH=7.0）配制：61mL A+39mL B定容至200mL。

磷酸缓冲液（100 mmol/L、pH 7.5）配制：84mL A+16mL B定容至200mL。

磷酸缓冲液（50 mmol/L、pH7.5 ）配制：42mL A+8mL B定容至200mL。

二、SOD（超氧化物歧化酶）活力测定——氮蓝四唑（NBT）法1.1原理超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)普遍存在于动､植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶，它催化下列反应：。

本反应产物H2O2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。

本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。

在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。