胰蛋白酶活性检测试剂盒说明书 紫外分光光度法

糜蛋白酶活性检测试剂盒说明书微量法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

货号：BC2335规格：100T/96S产品内容：提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体10mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存。

临用前溶于1.6mL甲醇中，再用水定容至10mL。

可分装后-20℃保存，避免反复冻融。

试剂三：液体5mL×1瓶，4℃保存。

产品说明：糜蛋白酶，又称胰凝乳蛋白酶，是胰腺分泌的一种蛋白水解酶，能迅速分解变性蛋白质。

糜蛋白酶的功能与胰蛋白酶相似，但是具有分解能力强、毒性低和不良反应小等优点。

临床上糜蛋白酶用于痰液稀化，对脓性和非脓性痰液均有效；也用于创伤或手术后伤口愈合，如白内障摘除。

糜蛋白酶催化BTEE水解，产物在256nm有特征光吸收；通过测定256nm光吸收增加速率，来计算糜蛋白酶活性。

自备仪器和用品：紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、移液器、微量石英比色皿/石英96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：一、粗酶液提取（1）组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）1：5-10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL 试剂一进行冰浴匀浆。

8000g，4℃离心10min，取上清即粗酶液。

（2）血清（浆）：直接检测。

二、测定操作：1.紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到256nm，蒸馏水调零。

2.试剂一置于25℃水浴中保温30min。

3.操作表：试剂名称（μL）测定管试剂一90试剂二90试剂三20样品20将上述试剂分别加入微量石英比色皿/石英96孔板后充分混匀，于256nm处测定初始吸光值A1和3min时的吸光值A2，计算△A=A2-A1。

三、糜蛋白酶活性计算公式：1、按微量石英比色皿计算：(1)按蛋白浓度计算活性单位定义：25℃每毫克蛋白每分钟水解1μmol BTEE为一个酶活单位。

分光光度法测定蛋白酶酶活1适用范围本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活得测定。

2测定原理蛋白酶在一定得温度与pＨ条件下，水解酪素（酪蛋白)底物，产生含有酚基得氨基酸（如:酪氨酸、色氨酸等),在碱性条件下，将福林试剂（Ｆolｉn）还原,生产钼蓝与钨蓝,用分光光度计于波长68０nm下测定溶液吸光度.酶活力与吸光度成正比，由此可以计算产品得酶活力。

酶活单位得定义:每１mL粗酶液，在一定温度与pＨ值条件下,10min水解酪素产生１μｇ酪氨酸为一个酶活力单位，以(u/mL)表示。

3仪器与设备3.1分析天平：精度为0、000１ｇ。

3.2紫外分光光度计.3.3恒温水浴锅:精度±０、2℃。

3.4ＰH计:精度为0、01PH单位.4试剂与溶液除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂与蒸馏水。

4.1福林（Foliｎ）试剂市售分析纯福林试剂。

4.2福林使用溶液一份福林试剂与两份水混合，摇匀。

4.3碳酸钠溶液（42、4g/L）称取无水碳酸钠(Nａ2ＣＯ3）42、4g，用水溶解并定容至１000mｌ。

4.4三氯乙酸ｃ(ＣCl３COOH）=0、4ｍｏl/L称取三氯乙酸65、4g，用水溶解并定容至１000 mL。

4.5氢氧化钠溶液c(NａOH）=０、5mol/L称取氢氧化钠片剂20、0g，加水900ml并搅拌溶解，待溶液到室温后加水定容至10００ml,摇匀。

4.6盐酸溶液c（HCL)=1 mol/L及０、１ mol/L1 ｍol／L ＨCL:取90mL浓盐酸溶解于蒸馏水中,定容至１000ｍL.0、1 mｏl/ＬHCL:取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中,定容至1０00mL。

4.7缓冲溶液4.7.1磷酸缓冲液(pＨ=７、5,适用于中性蛋白酶)称取磷酸氢二钠(Nａ２HPO4•12H2O）6、02g与磷酸二氢钠（NaH2PO４•1２H2O)0、５g，加水溶解并定容至１０00mL。

4.7.2乳酸缓冲液（pH＝３、0,适用于酸性蛋白酶）甲液：称取乳酸(8０％～90％）10、6g，加水溶解并定容至1000 mL。

分光光度法测定蛋白酶酶活1适用范围本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活的测定。

2测定原理蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素（酪蛋白）底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生产钼蓝和钨蓝，用分光光度计于波长680nm下测定溶液吸光度。

酶活力与吸光度成正比，由此可以计算产品的酶活力。

酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，10min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。

3仪器和设备3.1分析天平：精度为0.0001g。

3.2紫外分光光度计。

3.3恒温水浴锅：精度±0.2℃。

3.4PH计：精度为0.01PH单位。

4试剂和溶液除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水。

4.1福林（Folin）试剂市售分析纯福林试剂。

4.2福林使用溶液一份福林试剂与两份水混合，摇匀。

4.3碳酸钠溶液（42.4g/L）称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，用水溶解并定容至1000ml。

4.4三氯乙酸c（CCl3COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。

4.5氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L称取氢氧化钠片剂20.0g，加水900ml并搅拌溶解，待溶液到室温后加水定容至1000ml，摇匀。

4.6盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L1 mol/L HCL:取90mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。

0.1 mol/L HCL：取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。

4.7缓冲溶液4.7.1磷酸缓冲液（pH＝7.5，适用于中性蛋白酶）称取磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4•12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。

4.7.2乳酸缓冲液（pH＝3.0，适用于酸性蛋白酶）甲液：称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。

2013/05/13紫外分光光度法测蛋白酶酶活1、原理蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。

根据吸光度计算其酶活力。

酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。

2、试剂和溶液三氯乙酸、氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乳酸、乳酸钠、硼酸钠（硼砂）均为分析纯，酪素、酪氨酸为生化试剂。

2.1 三氯乙酸c（CCL3·COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。

2.2 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L按GB601配制。

2.3 盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L1 mol/L HＣＬ:取90mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。

0.1 mol/L HＣＬ：取9mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。

2.4 缓冲溶液a、磷酸缓冲液（pH＝7.5）适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4·12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。

b、乳酸缓冲液（pH＝3.0）适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。

乙液称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL。

使用溶液取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05moi/L乳酸缓冲溶液。

c、硼酸缓冲溶液（pH＝10.5）适用于碱性蛋白酶甲液称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000 mL。

乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000 mL。

使用溶液取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至1000mL。

分光光度法测定蛋白酶酶活分光光度法测定蛋白酶酶活1适用范围本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活的测定。

2测定原理蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素（酪蛋白）底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生产钼蓝和钨蓝，用分光光度计于波长680nm下测定溶液吸光度。

酶活力与吸光度成正比，由此可以计算产品的酶活力。

酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，10min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。

3仪器和设备3.1分析天平：精度为0.0001g。

3.2紫外分光光度计。

3.3恒温水浴锅：精度±0.2℃。

3.4PH计：精度为0.01PH单位。

4试剂和溶液除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水。

4.1福林（Folin）试剂市售分析纯福林试剂。

4.2福林使用溶液一份福林试剂与两份水混合，摇匀。

4.3碳酸钠溶液（42.4g/L）称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，用水溶解并定容至1000ml。

4.4三氯乙酸c（CCl3COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。

4.5氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L称取氢氧化钠片剂20.0g，加水900ml并搅拌溶解，待溶液到室温后加水定容至1000ml，摇匀。

4.6盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L1 mol/L HCL:取90mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。

0.1 mol/L HCL：取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。

4.7缓冲溶液4.7.1磷酸缓冲液（pH＝7.5，适用于中性蛋白酶）称取磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4•12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。

4.7.2乳酸缓冲液（pH＝3.0，适用于酸性蛋白酶）甲液：称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。

单宁含量检测试剂盒说明书紫外分光光度法货号：BC1390规格：50T/48S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

试剂名称规格保存条件提取液液体75mL×2瓶2-8℃保存试剂一粉剂×1瓶常温保存标准品粉剂×1支2-8℃保存溶液的配制：1、标准品：10mg 单宁酸。

临用前加入1.175mL 提取液溶解为5000nmol/mL 的标准液，2-8℃保存两周。

产品说明：单宁又称植物多酚，是一类广泛存在于植物体内的多元酚化合物。

单宁可作为潜在的生物标记物；与蛋白质结合的能力又称为收敛性或涩性。

其收敛性是多种生理活性的基础，如止血、抗肿瘤、抗衰老等生理活性，也是影响产品口感的因素之一。

根据光谱特性，单宁在275nm 下有较强的紫外吸收，通过利用活性炭能够特异吸附单宁的性质来检测单宁含量。

技术指标：最低检出限：0.385nmol/mL 线性范围：0.39-18nmol/mL注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：紫外分光光度计、1mL 石英比色皿、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、30-50目筛、蒸馏水。

操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）将样本烘干至恒重，粉碎，过30-50目筛之后，称取约0.1g ，加入2mL 提取液（封口膜封口防止液体溅出），于70℃水浴，准确提取30min ，期间可摇晃数次。

12000rpm，25℃，离心10min ，取上清，用提取液定容至2mL ，待测。

二、测定步骤1.紫外分光光度计预热30min ，波长调至275nm ，提取液调零。

Beijing Solarbio Science &Technology Co.,LtdTel:400-968-6088Fax:************2.标准液的稀释：将标准液用提取液稀释为25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125nmol/mL标准溶液。

胰蛋白酶比活力测定的实验操作胰蛋白酶（trypsin）是一种重要的消化酶，用于蛋白质的降解。

测定胰蛋白酶的比活力可以评估其酶活性及纯度。

下面是测定胰蛋白酶比活力的实验操作步骤。

实验所需材料：1.胰酶溶液2. Brain Heart Infusion (BHI)培养基3. 丙氨酰-L-苯丙氨酰-L-色氨酸对(L-Tyr-L-Phe)4.0.1M氢氧化钠（NaOH）溶液5.0.1M硫酸（H2SO4）溶液实验步骤：1.准备酶样品：取适量的胰酶溶液，可以是商业制备的纯胰蛋白酶或者胰腺提取物。

2. 酶样品稀释：将胰酶溶液与BHI培养基按照一定比例混合，使得最终浓度在0.5-1.2mg/mL之间。

3.加入底物：向每个试管中加入20μL的丙氨酰-L-苯丙氨酰-L-色氨酸对底物。

4.孵育反应：将试管置于37℃恒温培养箱中，在设定的时间内进行酶催化反应。

5.终止反应：用加入2NNaOH溶液终止酶反应，使底物水解停止。

6.酶解产物的提取：将反应液离心，取上清液转移到新的离心管中。

实验测量方法：1. 分光光度计法：利用胰酶催化底物水解产生的对分光光度计可见吸收的产物进行测定。

用1cm光程的比色皿，将底物水解产物的吸光度读数记录下来。

2. pH差比色法：用pH差比色法测量胰酶反应液中产生的酪氨酸分解产物。

黄色小麦胚芽酪氨酸（Tyr）的醛缩反应，其产物具有红色或紫色，在526nm处吸收峰。

通过比较不同样品的吸收度可以得出胰酶比活力。

数据处理：1.分光光度计法：根据底物水解产物的吸光度，绘制标准吸光度-底物浓度曲线，利用该曲线确定底物浓度，进一步计算胰酶的比活力。

2.pH差比色法：计算样品吸收值，将其与标准吸光度曲线相对应的底物浓度进行比较，计算胰酶的比活力。

注意事项：1.操作要严格遵守无菌技术，以避免细菌或其他污染物对实验结果的干扰。

2.实验过程中可以选择不同的底物和测量方法，以适应实验目的和条件。

3.实验操作需谨慎，避免接触眼睛和口腔，注意个人安全。

胰蛋白酶活性测定在动物胰脏中，胰蛋白酶是以无活性的酶原状态存在的。

在生理条件下，胰蛋白酶原随胰液分泌至十二指肠后，在小肠上腔有Ca2+的环境中，为肠激酶或胰蛋白酶所激活，其肽链 N -端的赖氨酸与异亮氨酸之间的一个肽键被水解，失去一个酸性6肽，其分子构象发生一定的改变后转变为具有催化蛋白质水解活性的胰蛋白酶。

胰蛋白酶原分子量约为24 000，其等电点为pH8.9；胰蛋白酶的分子量约为23 400，其等电点为pH 10.8。

胰蛋白酶在pH3.0时最稳定，其浓溶液可贮存于冰箱（0℃以下）数周而活性无显著丧失。

pH＜3时，胰蛋白酶易变性。

PH＞５时，胰蛋白酶易自溶。

胰蛋白酶催化活性的最适pH为7.6～7.8。

重金属离子、有机磷化合物和反应产物都能抑制胰蛋白酶的活性。

胰脏、卵清和大豆中也含有一些蛋白质对胰蛋白酶活性具有抑制作用。

[原理]胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的肽键具有高度的专一性。

此外，胰蛋白酶也能催化由碱性氨基酸的羧基所形成的酰胺键和酯键，有高度的专一性仍表现为对碱性氨基酸羧基一侧的选择对此等化学键的催化水解活性的敏感度为：酯键＞酰胺键＞肽键。

因此，可以利用含有这些化学键中任一种键型的底物来研究胰蛋白酶的专一催化活性。

本实验方法一采用N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯[（BAEE），N-benzoyl-L-arginine ethyl ester]作为底物.N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）在波长253nm下的紫外光吸收远远弱于N-苯甲酰-L-精氨酸[（BA），benzoyl-L-arginine]的紫外光吸收。

在胰蛋白酶的催化下，BAEE随着酯键的水解，水解产物 BA逐渐增多，反应体系的紫外光吸收亦随之相应增加，以△A253nm计算胰蛋白酶的活性。

胰蛋白酶的BAEE单位定义为：以BAEE为底物，在一定反应条件下，每分钟使△A253nm增加0.001的酶量为一个BAEE单位。

实验一胰蛋白酶活性测定实验目的：掌握测定胰蛋白酶浓度、活性、比活的原理与方法。

实验原理：胰蛋白酶相对分子量23.7 KD，主要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相连接的肽键，此外还能水解碱性氨基酸形成的酯键，如把人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzuyl-L-argine ethyl ester, BAEE）水解为H-苯甲酰-L-精氨酸（BA）。

胰蛋白酶所催化的上述反应中，产物BA对253 nm 的光吸收远大于BAEE，因此可以在实验起始点把253 nm 的消光值调为零，然后记录反应体系对253 nm 的消光值的增量，并把这个增量作为测定胰蛋白酶的活性指标。

酶活单位定义：在底物BAEE浓度1m mol/L，光程1 cm，波长253nm，温度25 0C，测量体积3mL,.条件下吸光值每分钟递增0.001（ A/min=0.001）为1个BAEE酶活单位。

胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度含义：胰蛋白酶含量一般E1%表达。

这个值的含义是：浓度为1% 酶蛋白，在1cm光径下，对紫外280nm 的消光值。

不同厂家、不同产品的E1%值有很大差别。

E1% 值越高，表明酶制剂中酶蛋白含量越高。

由于酶制剂中蛋白质含量各不相同，所以用酶制剂配制E1%的蛋白质溶液时，按照厂家对产品的E1% 的测定值配制溶液。

在本实验中，胰蛋白酶酶蛋白样品采用SIGMA 公司生产的产品,生产公司对展品的描述是对280nm紫外吸收值15.3，配制胰蛋白酶标准溶液可根据厂家的这个说明。

器材以试剂：器材，电子天平，紫外分光光度计，微量加样器。

试剂：标准胰蛋白酶，N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯，HCI, Tris。

1．胰蛋白酶活性测定：1）配制E1%的胰蛋白酶溶液每组取E1%=15.3的胰蛋白酶样品10mg 放到1ml去离子水中，充分溶解后，放入冰中保存。

2)按照表1 的要求配制试验体系所需其它各种溶液.3)按照表1的顺序进行测定标准胰蛋白酶的活性。

胰蛋白酶药典标准
胰蛋白酶是一种由胰腺分泌的消化酶，可用于提高肠道消化功能，改善胃肠道疾病。

胰蛋白酶的药典标准是按照国家药典制定的，以下是胰蛋白酶药典标准的相关参考内容：
【名称】胰蛋白酶
【药典标准】
1. 性状：胰蛋白酶为白色或几乎白色的粉末，无臭。

2. 酶活力测定：胰蛋白酶的酶活力以消化明胶法测定。

3. 蛋白含量测定：胰蛋白酶的蛋白含量以紫外吸收光度法测定。

4. 储存条件：胰蛋白酶应密封保存于阴凉干燥处，避免阳光直射。

【净含量】胰蛋白酶的净含量应符合生产商标注，一般以毫克或克为单位。

【适应症】胰蛋白酶广泛用于胃肠道消化功能减退，如慢性胰腺炎、胰腺切除术后，以及胃肠道手术后等。

【用法用量】成人常规剂量为每次口服胰蛋白酶20000-30000
单位，饭前或饭时服用。

具体剂量应根据患者消化功能及病情而定。

【不良反应】胰蛋白酶在正常剂量下一般不会引起不良反应，少数患者可能出现过敏反应如发热、皮疹、荨麻疹等，此时应停药并及时就医。

【注意事项】
1. 对胰蛋白酶过敏者禁用。

2. 胰蛋白酶可能与一些抗酸药物相互作用，如需要联用应在医生指导下进行。

3. 儿童、孕妇、哺乳期妇女及老年患者应在医生指导下使用。

【贮存期限】胰蛋白酶的贮存期限以生产商标注为准，一般为2-3年。

【生产企业】胰蛋白酶的生产企业应符合相关法规要求，具有药品生产许可证。

以上是胰蛋白酶药典标准的一些相关参考内容。

胰蛋白酶在临床上被广泛应用于改善消化功能减退的患者，但使用时应遵循医生的指导，且注意可能的不良反应和禁忌症等。

一、实验目的1. 学习和掌握蛋白酶活性检测的基本原理和方法。

2. 了解蛋白酶的特性和作用。

3. 通过实验，学会使用相关仪器和操作技能。

二、实验原理蛋白酶是一种能够水解蛋白质的酶，其活性是指在一定条件下，蛋白酶催化蛋白质水解的能力。

蛋白酶活性检测通常采用紫外分光光度法，通过测定反应体系中蛋白质的降解程度来评估蛋白酶的活性。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）蛋白酶样品（2）底物：酪蛋白（3）缓冲液：磷酸盐缓冲液（pH 7.0）（4）其他试剂：硫酸铜、碘化钾、氢氧化钠等2. 实验仪器：（1）紫外分光光度计（2）恒温水浴锅（3）电子天平（4）移液器（5）试管（6）烧杯四、实验步骤1. 准备实验试剂和仪器。

2. 配制底物溶液：称取一定量的酪蛋白，加入适量磷酸盐缓冲液，溶解后备用。

3. 设置实验组：（1）取若干个试管，分别加入不同浓度的蛋白酶样品。

（2）在每个试管中加入相同体积的底物溶液。

（3）将试管放入恒温水浴锅中，设定温度为37℃，反应一定时间。

4. 设置对照组：（1）取若干个试管，分别加入相同体积的蛋白酶样品和底物溶液。

（2）将试管放入恒温水浴锅中，设定温度为37℃，反应一定时间。

5. 测定反应体系中蛋白质的降解程度：（1）取一定体积的反应体系，加入硫酸铜和碘化钾溶液。

（2）用紫外分光光度计测定反应体系的吸光度。

（3）根据吸光度计算蛋白质的降解程度。

6. 数据处理和分析：（1）绘制蛋白酶活性与酶浓度、反应时间的关系曲线。

（2）分析蛋白酶的特性和作用。

五、实验结果与分析1. 实验结果：（1）不同浓度的蛋白酶样品对底物溶液的降解程度不同。

（2）随着反应时间的延长，蛋白质的降解程度逐渐增加。

2. 分析：（1）蛋白酶的活性与酶浓度呈正相关，即酶浓度越高，活性越强。

（2）在一定反应时间内，蛋白酶活性随着反应时间的延长而增加，但当反应时间过长时，活性逐渐降低，可能是因为蛋白酶自身发生降解。

六、实验结论1. 通过本实验，掌握了蛋白酶活性检测的基本原理和方法。

分光光度法测定蛋白酶酶活1适用范围本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活得测定。

2测定原理蛋白酶在一定得温度与pH条件下,水解酪素(酪蛋白)底物,产生含有酚基得氨基酸(如:酪氨酸、色氨酸等),在碱性条件下,将福林试剂(Ｆolin)还原,生产钼蓝与钨蓝,用分光光度计于波长680nm下测定溶液吸光度。

酶活力与吸光度成正比,由此可以计算产品得酶活力。

酶活单位得定义:每１mL粗酶液,在一定温度与ｐH值条件下,10min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位,以(u／ｍL)表示。

3仪器与设备3.1分析天平:精度为0。

0０01g。

3.2紫外分光光度计。

3.3恒温水浴锅:精度±0。

2℃。

3.4PＨ计:精度为0.0１PＨ单位。

4试剂与溶液除非另有说明,在分析中仅使用分析纯试剂与蒸馏水。

4.1福林(Foｌin)试剂市售分析纯福林试剂、4.2福林使用溶液一份福林试剂与两份水混合,摇匀。

4.3碳酸钠溶液(42、4ｇ／L)称取无水碳酸钠(Na2CＯ3)4２.4ｇ,用水溶解并定容至1０0０ml。

4.4三氯乙酸c(ＣCl3COOH)=0、4mｏｌ/Ｌ称取三氯乙酸６５、4g,用水溶解并定容至１000 mL、4.5氢氧化钠溶液ｃ(NaOH)＝0.5ｍol／L称取氢氧化钠片剂２0。

0g,加水90０ml并搅拌溶解,待溶液到室温后加水定容至1000ml,摇匀。

4.6盐酸溶液c(HCL)=1 mol/L及0。

１mol/L1 ｍol/L HＣL:取９０mL浓盐酸溶解于蒸馏水中,定容至1000mＬ。

０、1 ｍol/Ｌ HCL:取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中,定容至100０ｍＬ、4.7缓冲溶液4.7.1磷酸缓冲液(pH＝７。

5,适用于中性蛋白酶)称取磷酸氢二钠(Na２ＨPO4•12Ｈ2Ｏ)6、02ｇ与磷酸二氢钠(NaＨ2ＰO4•1２Ｈ2O)0、5ｇ,加水溶解并定容至1000mL。

4.7.2乳酸缓冲液(ｐH=3。

0,适用于酸性蛋白酶)甲液:称取乳酸(80％～９0％)10、6g,加水溶解并定容至1000 ｍL。

胰蛋白酶效价测定标准
一、实验原理
胰蛋白酶是一种常见的酶，它具有分解蛋白质的能力。

通过在特定底物溶液中添加不同浓度的胰蛋白酶，并测量反应后的吸光度值，可以确定胰蛋白酶的效价。

本实验将采用这种方法来测定胰蛋白酶的效价。

二、实验步骤
制作标准曲线：选取一系列已知浓度的胰蛋白酶溶液，分别加入底物溶液中，测量反应后的吸光度值。

制作吸光度值与胰蛋白酶浓度的标准曲线。

配置反应液：将底物溶液与酶溶液按比例混合，得到反应液。

加样反应：将不同浓度的胰蛋白酶溶液加入反应液中，并设置空白对照组。

测定光密度值：在特定波长下，测量反应液的光密度值。

记录各个浓度下的吸光度值。

根据标准曲线计算胰蛋白酶效价：将测得的吸光度值代入标准曲线，计算出对应的胰蛋白酶浓度。

根据胰蛋白酶浓度计算胰蛋白酶效价。

三、实验结果
根据实验数据，得出以下结论：在浓度为XX mg/mL时，胰蛋白酶的吸光度值为 1.480。

根据标准曲线，可以计算出
该浓度下的胰蛋白酶效价为XXX U/mg。

四、结论
通过本实验，我们成功地测得了胰蛋白酶的效价为XXX U/mg。

实验结果表明，该胰蛋白酶具有较高的活性，能够有效地分解底物溶液中的蛋白质。

本实验结果可为相关领域的研究提供参考。

胰蛋⽩酶（Trypsin）试剂盒说明书（分光光度法）正式测定前务必取2-3个预期差异较⼤的样本做预测定测定意义：胰蛋⽩酶选择性⽔解变性蛋⽩质中由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，是⼀种重要的消化酶。

此外，胰蛋⽩酶还⼴泛应⽤于脓胸、⾎胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤等所产⽣的局部⽔肿、⾎肿及脓肿等的辅助治疗。

测定原理：胰蛋⽩酶催化⽔解TAME的酯键，释放出的游离羧基与反应体系中的氢氧化钠发⽣中和反应，导致溶液的pH值降低，以**红为指⽰剂，测定溶液在555nm处吸收值的变化，可以快速测得胰蛋⽩酶活性数据。

胰蛋⽩酶在⼀定范围内与555nm处吸收值的降低呈良好的线性关系。

组成：产品名称PI007-50T/48S Storage提取液：液体60ml4试剂⼀：液体10ml4试剂⼆：液体10ml4避光试剂三：液体4ml4说明书⼀份⾃备仪器和⽤品：紫外可见分光光度计、1ml玻璃⽐⾊⽫、台式离⼼机、⽔浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏⽔。

粗酶液提取：提取：粗酶液1、组织样品：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的⽐例（建议称取约0.1g组织，加⼊1ml提取液）冰浴匀浆，10000g，4离⼼10min，取上清，即粗酶液。

测定步骤：1、分光光度计预热30min以上，调节波长⾄555nm，蒸馏⽔调零。

⼯作液的配制：临⽤前根据⽤量按照试剂⼀（V）：试剂⼆（V）：蒸馏⽔（V）：试剂三（V）=1ml：1ml：5.4ml：0.4ml的⽐例充（注意：现⽤现配，⽤多少配多少，在空瓶中配制，试剂盒中带有4个空瓶）分混合。

（注意：现⽤现配，⽤多少配多少，在空瓶中配制，试剂盒中带有3. 吸取25µl样本，加⼊975µl⼯作液，混匀后⽴即测定，记录555nm下1min时的吸光值A1和2min时的吸光值A2。

计算A=A1-A2注意：如果A⼩于0.005，可将反应时间延长到5min。

如果A⼤于0.5，体系迅速变⾊，可将样本⽤提取液稀释后测定（建议稀释10倍），计算公式中乘以相应稀释倍数。

人抗胰蛋白酶(AT)elisa试剂盒使用说明书Elisa kit规格：48孔配置/96孔配置标准品稀释液：1.5ml×1瓶酶标试剂：3 ml×1瓶（48）/6 ml×1瓶（96）【人抗胰蛋白酶(AT)试剂盒】本试剂仅供研究使用计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

试剂盒组成：封板膜:2片（48）/2片（96）说明书:1份密封袋:1个标准品：2700ng/L 0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存酶标包被板: 1×48 1×96 2-8℃保存样品稀释液: 3ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液: 3ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液: 3ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存终止液: 3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液:（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人抗胰蛋白酶(AT)水平。

用纯化的人抗胰蛋白酶(AT)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入抗胰蛋白酶(AT)，再与HRP标记的抗胰蛋白酶(AT)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的抗胰蛋白酶(AT)呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中人抗胰蛋白酶(AT)浓度。

小鼠胰蛋白酶原激活肽（TAP）酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用预期应用ELISA法定量测定小鼠血清、血浆或其它相关液体中胰蛋白酶原激活肽（TAP）含量。

实验原理本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中MBP水平。

用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入TAP抗原、生物素化的抗小鼠TAP抗体、HRP 标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。

TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的TAP呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

试剂盒组成及试剂配制1.酶联板：一块（96孔）标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为50nmol/ml，做系列倍比稀释后，分别稀释成50 nmol/ml，25nmol/ml，12.5nmol/ml，6.25nmol/ml，3.12nmol/ml，1.56nmol/ml，0.78nmol/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0nmol/ml，临用前15分钟内配制。

如配制25nmol/ml标准品：取0.5ml50nmol/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。

2.样品稀释液：1×20ml/瓶。

3.检测稀释液A：1×10ml/瓶。

4.检测稀释液B：1×10ml/瓶。

5.检测溶液A：1×120ul/瓶（1：100）临用前以检测稀释液A1：100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100ul），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。

如1ul 检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。

6.检测溶液B：1×120ul/瓶（1：100）临用前以检测稀释液B1：100稀释。

2013/05/13紫外分光光度法测蛋白酶酶活1、原理蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。

根据吸光度计算其酶活力。

酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。

2、试剂和溶液三氯乙酸、氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乳酸、乳酸钠、硼酸钠（硼砂）均为分析纯，酪素、酪氨酸为生化试剂。

2.1 三氯乙酸c（CCL3·COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。

2.2 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L按GB601配制。

2.3 盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L1 mol/L HＣＬ:取90mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。

0.1 mol/L HＣＬ：取9mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。

2.4 缓冲溶液a、磷酸缓冲液（pH＝7.5）适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4·12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。

b、乳酸缓冲液（pH＝3.0）适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。

乙液称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL。

使用溶液取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05moi/L乳酸缓冲溶液。

c、硼酸缓冲溶液（pH＝10.5）适用于碱性蛋白酶甲液称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000 mL。

乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000 mL。

使用溶液取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至1000mL。