精子冷冻复苏效果的影响因素

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精液冷冻前优化处理方式对精子冷冻复苏效果的影响

精液冷冻前优化处理方式对精子冷冻复苏效果的影响
随着现代生殖医学的发展，精液冷冻已经成为一项重要的技术手段。

然而，精液冷冻
复苏效果的稳定性和可靠性一直是精液冷冻技术研究的热点问题。

精液冷冻前优化处理方
式对精子冷冻复苏效果的影响成为当前研究的一个重要方向。

精液冷冻前的优化处理方式具体包括以下几个方面：收集和处理精液、加工分装、添
加低分子保护剂、添加高分子保护剂、添加复合保护剂等。

首先，收集和处理精液对精子冷冻复苏效果有重要影响。

合理收集和处理精液可使精
子质量得到有效保护，从而提高精液冷冻复苏效果。

同时，要注意避免收集到混合精液、
精液质量差的情况，否则会影响冷冻复苏效果。

其次，加工分装也是影响精液冷冻复苏效果的重要因素之一。

加工分装时可以选择较
小容量的冻管进行分装，这样有利于保护精子，防止精子变形和损伤，从而提高精液冷冻
复苏效果。

除了上述两点，添加低分子保护剂、添加高分子保护剂、添加复合保护剂也是优化处
理方式的重要手段。

添加低分子保护剂可以有效保护精子细胞膜，增加精子的冷冻复苏率；添加高分子保护剂可以改善精液流变学特性，防止精子聚集、粘附和凝聚；添加复合保护
剂可以综合利用低分子和高分子保护剂的优点，进一步提高精液冷冻复苏效果。

不同解冻温度对细管冻精精子活力的影响

研究与探讨Y 1642019年5月·下不同解冻温度对细管冻精精子活力的影响陈玉萌（新疆生产建设兵团第九师团结农场农业发展服务中心 834602）摘要寻找肉牛精子最佳解冻温度的影响。

温度是精子最敏感的外界因素之一。

实践证明，牛精液冷冻效果好坏与解冻温度有很大关系。

牛冷冻精液质量的好坏，直接影响受胎率，影响着养殖户的经济效益。

而冻后精子活力及生存时间（解冻后37℃保存4小时精子活力）又是冷冻精液质量中最重要的两项指标。

为此，可以通过本试验了解不同解冻温度对牛冷冻精子复苏的影响，找出适宜牛细管冷冻精液的最佳解冻温度。

目的是寻找最佳的解冻温度及解冻时间，从而提高精子冻后活力，提高受胎率。

在生产实践中根据具体情况选用适合的解冻温度和解冻时间。

关键词肉牛；冷冻精液；解冻温度；精液质量牛、羊精液冷冻保存技术研究主要开始于20世纪50年代，Polge[1]等用甘油作冷冻保护剂，在-79℃保存牛精液并用于输精，于1951年产下世界上第一头冷冻精液牛犊。

目前，养牛业中已广泛应用冷冻精液人工授精[2]，该技术极大地促进了牛生产性能的改进和新品种的培育。

我国牛的冷冻精液剂型除颗粒冻精外，还有细管冻精。

细管冻精有很多优点，冷冻时受温比较均匀，冷冻效果好，精液利用率高，值得推广，大大提高了受胎率，可以培育出体格健壮、遗传性能优越的犊牛。

优势不受地区、季节、公牛年龄的限制，运输方便，细管冻精有效保存时间长，对进行牛冷冻精液的解冻方法的优化研究具有重要的现实意义。

1 材料与方法1.1 供试冻精的选择购于吉林市繁殖改良站的肉牛细管型冷冻精液提供的0.5毫升。

1.2 解冻用具专用的消毒杯、温度表、自备的凉开水、电炉、温度计试验时这些用具随身携带。

1.3 方法在温水解冻范围内设计五个温度区：38℃、38.5℃、39℃、39.5℃、40℃。

设定解冻时间为10s、20s、30s三个档。

解冻后，通过光学显微镜在400- 600倍条件下，室温20℃情况下，检查解冻后精液的活力。

精液冷冻复苏后精子活动力结果分析

精液冷冻复苏后精子活动力结果分析王　军岳锡宏新疆维吾尔自治区人口和计划生育科研所，新疆乌鲁木齐　830011[摘要] 目的比较不同民族之间精液冷冻复苏后精子活动力有无差异。

方法将171名正常供精者（汉族74名、哈萨克族51名、维吾尔族46名）标本进行精液常规分析，按精液和冷冻保护剂等比例混匀，用程序降温仪通过三步降温法冻存于-196℃液氮中编号冻储。

取出样本管放置于37℃水浴复苏，再次进行精液常规分析。

结果冷冻复苏后，汉族供精者精子前向运动百分率和总活动率分别为（27.50±4.51）%和（38.53±7.39）%；哈萨克族供精者精子前向运动百分率和总活动率分别为（17.20±3.67）%和（23.82±5.12）%；维吾尔族供精者精子前向运动百分率和总活动率分别为（15.79±6.63）%和（24.60±5.31）%。

经χ2检验，汉族和哈萨克族、维吾尔族供精者精子前向运动百分率和总活动率差异有统计学意义（P＜0.05）。

结论汉族与哈萨克族和维吾尔族精液冷冻复苏后精子活动力结果有差异，其原因有待进一步研究。

[关键词] 精子；冷冻复苏；前向运动百分率；总活动率[中图分类号] R692 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2013）11（b）-0013-021临床资料1.1 精液标本的采集171份精液标本来自2004年2月—2005年5月到新疆维吾尔自治区人口和计划生育科研所捐精的合格志愿者，汉族74例、哈萨克族51例、维吾尔族46例，年龄22～36岁，职业以在校学生为主，禁欲2～7 d，取精前清洗消毒手及外生殖器，手淫取精，射入干燥无菌专用取精器皿中，25～40 mi n室温液化。

1.2 精液的检测和冻存完全液化的精液，按照《W HO人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验室检验手册》（第四版）进行精液分析[1]，对前向运动(ａ+ｂ)级精子>50%、精子密度>60×106/m L，精液量>2 m L的标本纳入供精冻储范围。

动物繁殖学复习题

动物繁殖学复习题 TYYGROUP system office room 【TYYUA16H-TYY-TYYYUA8Q8-《动物繁殖学》复习题名词解释(10个×2分/个=20分)；填空题（10空×1分/空=10分）；单项选择题（10小题×1分/小题=10分）；判断题（10小题×1分/小题=10分）；问答题（5小题×10分/小题=50分）。

一、填空题1. 家畜的睾丸为（）形2. 精子在（）内最后成熟3. 原始卵泡位于卵巢的（）部4. 胎儿的发育场所是（）5. 各种家畜孕酮的含量，在卵泡期都低于（）6. 催产素分泌的调节一般是（）性的7. 在调节家畜繁殖机能方面起重要作用的前列腺素是（）8. 对生殖活动有间接调节作用的激素称（）9. 雄性动物的性成熟一般比雌性动物（）10. 精子蛋白质的分解往往表示精子品质已（）11. 新采出的牛、羊精液偏（）性；12. 大家畜的性成熟时间比小家畜（）；13. 精子最脆弱的部分是（）；14. 生长发育快的个体，性成熟（）；15. 一个卵母细胞最终能形成（）个卵子；16. 绵羊是（）日照发情动物；17. 黄体退化到排卵的时期称（）；18. 精子冰晶化的温度区域是（）；19. 母畜体内（）水平的下降，是卵泡开始生产发育的前提条件；20. 胚胎移植时，提供胚胎的个体称（）；21. 输卵管是卵子进入子宫的通道，管的前1/3段较粗称为（）；其余部分较细，称为（）。

22. 冰晶只有当温度在（）条件下形成；而玻璃体的温度区在（）。

23. 羊的妊娠期为（）天；兔的妊娠期为（）天。

24. 子宫射精型畜种有（）；（）。

25. 按生殖激素的化学特性可分为含氮激素；（）和（）。

26. 牛的输精方法有（）；（）。

27. 发情期没有配种的母畜在休情期后期子宫能分泌（）。

28. 阴道射精型的畜种有（）；（）。

29. 类固醇激素（疏水激素）的受体通常位于（）。

不同规格细管对冷冻猪精复苏质量的比较研究

9441卷第1遗传改良GENETIC IMPROVEMENT不同规格细管对冷冻猪精复苏质量的比较研究周健 1，刘闻一 1，付小青 1，朱琳 1，赵云翔 1，2 *（1.河南秀博科技有限公司，河南许昌 461000；2.广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530000）1 前言当前，人工授精技术在养猪行业中得到普遍使用，优秀个体间的基因交流通过猪精来实现，猪精作为基因的载体，在种猪育种和商品化生产中占据重要的地位。

猪精保存方式共分为三种，常温液态保存、低温液态保存和超低温固态保存。

常温液态保存的猪精行业使用率已达到90%以上，而超低温固态保存的猪精使用率只有1%左右，这主要与猪精对温度的敏感性以及冻精操作方法的复杂性等因素有关。

猪精超低温固态保存通常使用细管进行，以0.25 mL 和0.5 mL 细管居多，小容量细管冻精在批量配种时会暴露出诸多的问题，需要多次解冻数支冻精细管来进行输精，延长输精时间的同时增加了劳动强度，使用大容量细管冷冻猪精是推广冻精配种技术的重要措施之一。

本研究比较了0.5 mL 和5 mL 细管冻精解冻后的冷冻效果，在此基础上对解冻后精子处在38℃环境下的耐受性做进一步比较，为大容量细管冻精研究提供试验依据。

基金项目：财政部和农业农村部：国家现代农业产业技术体系（CARS-PIG-35）；国家现代农业产业技术体系广西创新团队建设专项资金资助（nycytxgxcxtd-2023-15-03）作者简介：周健（1990—），男，河北内丘人，硕士，研究方向：遗传繁育， E-mail ：*通信作者：赵云翔（1981—），男,河南新蔡人，博士，研究方向：动物遗传育种与繁殖， E-mail ： 2 材料与方法2.1 试验动物及精液收集选取身体健壮的杜洛克公猪作为试验动物，在扬翔股份旗下公猪站收集精液样本，均使用自动采精系统采集公猪精液，精液量达到100 mL 以上时作为试验样本并且检测合格后运输到扬翔育种中心北方冻精实验室进行冷冻试验。

冻前预处理对萨福克肉羊精液冷冻效果的影响

将采集的合格精液保存在３７ ℃左右的保温瓶中，分别静置
３０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ和９０ｍｉｎ。
１．３．２离心
分别以５００ｒ／ｍｉｎ、１０００ｒ／ｍｉｎ、１５００ｒ／ｍｉｎ的速度离心７ｍｉｎ、
ｌＯｍｉｎ和１５ｍｉｎ。
１．４冷冻精液制作与解冻３讨论用液氮熏蒸法制作细管冻精，剂量为０，５ｍｌ，解冻时用（１）本研究在稀释前将精液分别静置３０ｍｉｎ，６０ｍｉｎ和４０～４５ ℃温水。９０ｍｉｎ，结果表明，平衡６０ｍｉｎ－￣］＂有效地使精子和精清接触，以增１．５数据处理强精子对冷休克及冷冻损伤的抵抗能力，静置时间太长可引起精应用ｔ检验和方差分析法对实验数据进行统计分析。浆变质而对精子产生影响，同时，精子不运动也容易形成假死状２结果与分析态，该结果与Ｐａｕｌｅｎｚ所采用的猪精液Ｂｅｈｓｖｉｌｌｅ预处理方法所获得２．１离心前静置时间对萨福克肉羊冻精活率及复苏率的影响的结果相同。本研究在稀释前采用３０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ和９０ａｒｉｎ３种不同的静（２）本研究采用不同的离心速度和离心时间，结果表明，以置时间对精液冻后活率的影响见表１。精液离体后静置６０ｍｉｎ再ｌＯ００ｄｍｉｎ的离心速度离Ｌ，ｌＯｍｉｎ较好，解冻后活率达到０．４５。这采取１０００ｒ／ｍｉｎ的速度离心，冻后活率及复苏率明显优于静置３０主要是由于不离心，精液体积过大稀释效果不佳，而过快的离心ｍｉｎ和９０ｍｉｎ（ｐ＜Ｏ．０５），冻后精子活率达０．４７，复苏率达７３．８％。速度则使精子在离心管底部凝结，导致形态异常，活率降低。也２．２离心速度及离心时间对冻后活率及复苏率的影响有报道表明，萨福克精液冻前以１２００ｒ／ｍｉｎ的速度离心１０分钟较对萨福克新鲜精液采用５００ｒ／ｍｉｎ、１０００ｒ／ｍｉｎ和１５００ｒ／ｍｉｎ好，本研究认为，在平凉地区以ｌＯ００ｒ／ｍｉｎ的速度离心较好。的速度分别离心７ｍｉｎ、１０ｍｉｎ和１５ａｒｉｎ，分别制成细管冻精和颗４结论粒冻精，同时，在相同条件下解冻（４５ ℃温水）。结果见表２。（１）精液稀释前的静置时间，以在３７ ℃下静（下转第５７页）

实验十五精液的冷冻保存

实验十五精液的冷冻保存一.实验特点实验类型：综合型实验实验类别：专业基础课计划学时：2学时每组人数：3～4人二、实验目的要求精子具有受温度变化直接影响本身活动力和代谢能力力的生物学特性。

利用这一特性，将精液特殊处理后，保存在超低温下，精子代谢活动完全受到抑制，停止能量消耗，处于生命静止状态，长期保存下来。

一旦升温精子又能复苏并维持其原来的受精能力。

要求同学们了解精液冷冻保存的技术操作过程和精液冷冻保存原理，初步学会冷冻保存方法。

三．实验原理冰晶化是水在降温过程中的一定温度下，水分子重新按几何图形排列形成冰晶。

冰晶可造成精细胞（精子）内外的溶质浓度和渗透压增高，引起细胞内脱水、原生质变干、酸碱失去平衡、细胞膜和顶体以及整个组织和结构破坏等致死性伤害，最后导致精子发生不可逆的变化而死亡。

一般精液内含85%～95%的水分，精子内也含有及少量的水分，这些水分在降温过程中在-0.6～-60℃温度区内缓慢降温能形成冰晶。

降温速率越慢，所形成的冰晶越大，其中特别以-15～-25℃时冰晶形成最多。

在冷冻精液过程中只有避开这个有害温度区，才能得以长期保存。

快速升降温度的办法，难以达到完全玻璃化冻结条件。

为此，在制作冷冻精液的稀释液内，要加入一定量的甘油等抗冻害物质。

甘油具有极强的亲水性，可限制水分子形成冰晶而处于过冷状态，降低水形成冰晶的温度，即缩小精子的有害温度的上限。

此外甘油容易渗透精子内，可降低渗透压改变的不良影响及营养作用等，增强精子的抗冻害能力和无冻害生存环境。

精液在冷冻过程中不可避免地要形成冰晶，精子能否生存的关键在于冰晶的大小，冰晶越大对精液伤害越大，反之冰晶越小，伤害越小甚至无损伤。

因此，只要避免大冰晶形成，并使精子稳定在微晶的状态下，一旦升温精子又能复苏并维持其原来的受精能力。

四．实验材料和仪器精液、2.9%的柠檬酸钠溶液、50～100ml烧杯、滴管、10 ml试管、低温温度计、20～80目纱网、漏勺、灭菌纱布袋、液氮罐、液氮、载玻片、盖玻片、显微镜、保温箱。

肉种牛冷冻精液生产

2021年第3期吉林畜牧兽医·草食动物·CaoShi DongWu肉种牛冷冻精液生产方焱秋,顾达夫长春市新牧科技有限公司，吉林长春 130000长春市新牧科技有限公司种公牛站，成立于1996年，是集纯种肉种牛冻精生产、科研与教学基地为一体的公司，这里有国内一流的肉用种牛、基础设施和科技队伍。

现存栏种公牛115头，大部分为纯种加拿大品系的西门塔尔种公牛，是全国加系存栏最多的种公牛站。

2020年生产优质冻精200万剂，冻精除满足本省需求外，还远销全国各地，广泛受到市场欢迎。

对推动肉牛产业化进程起到了积极作用。

冷冻精液的技术，主要用于猪、牛、鹿、马等动物上。

冻精可长期保存于液氮中，按需随用随取。

具有保存成本低、效率高、运输方便的特点，是大规模遗传改良的主要手段。

现在就肉种牛冷冻精液生产技术做以下介绍。

1 实验室要求仪器：相差显微镜、喷墨灌装一体机、冷冻仪、密度仪、平衡柜、电子天平、水浴锅、鼓风干燥箱、培养箱、液氮罐等。

室温:20～24 ℃。

2 精液要求原精要求：原精量≥3 mL，密度≥6亿/ mL，活力≥0.65，畸形率≤0.15，原精颜色气味无异常，方可用于冻精生产。

0.25 mL微管冻后要求：有效精子数≥800万个，畸形率≤0.18，冻后活力≥0.35，剂量≥0.18ml，细菌数≤800个，细管无裂痕，封口严密，字迹清晰，信息齐全（包括单位名称、公牛品种、注册号、生产日期）。

样品中任何一项未达到标准要求，均视为不合格产品，做销毁处理。

3 原精检查将集精杯置于30～34 ℃水浴锅中，对颜色、气味、精液量、活力和密度指标进行检测。

3.1 颜色气味正常的颜色应为乳白色或微黄色，气味略腥；不正常的颜色偏红为血精，颜色偏黄为有炎症，建议兽医治疗；集精杯里如果有粪便或草渣为污染精液，可能存在细菌超标。

以上不正常的原精均弃掉。

3.2 精液量分为称量法和目测法两种方法，称量法比目测法更为精确。

己酮可可碱对冷冻前后精子的影响

己酮可可碱对冷冻前后精子的影响
王荣;宋春英;邢丽俊;王静;李晓蓉;王慧芳
【期刊名称】《中国生育健康杂志》
【年(卷),期】2024(35)1
【摘要】目的分析不同浓度的己酮可可碱对体外精液中精子的活力、活率、运动功能等的影响,为体外受精技术提供依据。

方法将30例精液标本进行分组,添加不同浓度的己酮可可碱,终浓度分别为0、0.6、1.2、2.4、3.6 mmol/L,通过程序降温仪冷冻精子后转移到液氮中保存24 h,然后进行复苏操作。

用计算机辅助精子分析仪检测精子冷冻前和复苏后的各项参数。

结果添加己酮可可碱后不会对精液的浓度产生影响,能够显著提高精子复苏率、精子活力、活率、运动功能,并且各项的增幅随着己酮可可碱浓度的增加而逐渐提高。

这种提高作用在精子冷冻前后均有体现。

结论己酮可可碱的终浓度为3.6 mmol/L时,改善精液各项参数作用效果最好,临床应用时可以此浓度作为参考依据。

【总页数】4页(P75-78)
【作者】王荣;宋春英;邢丽俊;王静;李晓蓉;王慧芳
【作者单位】山西白求恩医院医疗器械临床试验机构办公室、精子库
【正文语种】中文
【中图分类】R71
【相关文献】
1.己酮可可碱对睾丸精子活动力及存活率的影响
2.己酮可可碱对人精子获能和顶体反应的影响
3.己酮可可碱对精子运动能力和受精能力的影响
4.己酮可可碱和血小板激活因子对冷冻保存的大熊猫精子受精能力的影响
5.不同浓度己酮可可碱对精子功能的影响研究
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冷冻精液室温暴露时间对前向运动精子冷冻复苏率的影响

之后按照上述方法将实验组的精液标本重新放回液
成部分.由于场地空间成本限制,大多数冷冻精子
程中,不可避免的会有一些非待发精液标本连同待
发精液标本一起暴露于空气中,导致几秒至几分钟
的短暂冻融.目前有关人精子冷冻保存发放过程中
连带暴露导致短暂冻融对复苏后前向运动精子
收稿日期:
２０２０

０８

０６修回日期:
２０２１

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２２
∗
通信作者:
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中国计划生育学杂志２０２１年６月第２９卷第６期 Ch
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６,June２０２１
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精子冷冻复苏效果的影响因素【摘要】不育症在世界范围内的发生率为l0％～15％，其中约有一半因素来源于男方。

流行病学研究早已证实，近50年以来，男性精液的质量持续下降．男性精子几乎减少了一半并且每年还以2.1％的速度在减少。

男性不育人数的增多甚至出现精子危机。

为了应对精子质量的下滑，保存技术显得尤为重要。

本文即对精子冷冻复苏保存的影响因素进行探讨与总结。

【关键词】精子；冷冻复苏；精浆；精子危机；储存环顾四周，男性不育人群日渐增加，精子库也成为越来越多不育家庭求助的借精之地。

实际上，“精子危机”是否存在在学术界也有争论。

2013年欧洲人类生殖与胚胎学会伦敦年会上关于男性的精子危机仍争论不一[1]。

中华医学会男科分会候任主任委员姜辉说，他所在的北京大学第三医院接诊的不育患者中，无精症男性比例从2004年的6%上升到2008年的10%。

同时，世界卫生组织颁布的“精子质量合格线”一直在下降，至2010年为1500万个，已是30年前的四分之一。

为了应对精子质量的下降，人类精子的冷冻保存则逐渐成为人类精子库及生殖中心工作的重要组成部分。

其用途主要体现在：供精者精液保存、男性生育力保存、男性不育症的治疗及最大限度降低传染性疾病的传播。

因此，精子冷冻复苏的效果也越来越受到重视。

虽然我国人类精子库的数量较多，至2011年12月我国共批准建立了15家人类精子库。

但需要的夫妇数量也很多，至今仍存在供不应求的情况，使得精子的储存越来越受到重视。

影响精子冷冻复苏率的因素比较多，主要分为自身因素和非自身因素。

本文通过查阅最近国内外文献，将影响精子冷冻复苏效果的因素分为实验室因素（冷冻保护剂、冷冻方法、复苏方法等）、精液自身因素（精浆因素、精子因素）及其他因素（季节、禁欲时间）等并作如下综述：1. 实验室因素对精子冷冻复苏效果的影响近年来，有大量文献研究如何提高人类精子的冷冻复苏率，影响人精子冻贮后效果的实验室因素主要有：冷冻保护剂、冷冻方法、精液与保护剂的比例、精液处理后冷冻、精液复苏方法、冻存时间等。

1.1 冷冻保护剂研究表明，未添加冷冻保护剂的精子在冷冻贮存并复温后，仅有0.1%的精子具有一定程度的运动能力。

在精子冷冻之前，为了减轻精子冷冻及复温过程中细胞的损伤，须加入一些具有保护作用的物质，这些物质统称冷冻保护剂。

而精子细胞里的活性氧（ROS）具有很强的氧化活性，其浓度过高可以诱导细胞的脂类、蛋白及细胞内的DNA氧化损伤，从而引起一系列的病理变化。

有些不育男性精液中缺乏与这些氧化物抗衡的物质，从而引起不育。

有研究认为精浆中过多的ROS会导致精子的氧化损伤，以至于精子的功能受损以及精子核和精子DNA受损[2]。

因此，ROS导致人精子的损伤，也可能降低精子对冷冻复温的抵抗能力[3]。

有许多研究认为在冷冻保护剂中添加一些抗氧化物质（如：维生素E、抗坏血酸葡糖苷、谷光甘肽、抗坏血酸和过氧化氢酶等）可以保护精子功能，明显提高精子的冷冻复苏率。

在冷冻保护剂中添加维生素E可以提高冷冻后精子的活动力及精子DNA的完整性[4、5]；在冷冻保护剂中添加抗坏血酸等物质可以提高精子冷冻复苏率，LI等研究发现，在精子冷冻保护剂中添加抗坏血酸和过氧化氢酶可以抑制ROS的活性，从而可以提高精子冷冻复苏率[6]。

另外，添加谷胱甘肽（GSH）对精子冷冻损伤也有一定的保护作用[7]。

但也有研究认为不添加保护剂直接冻存和添加保护剂对精子DNA完整性的影响无显著差异[8]。

1.2 冷冻方法根据降温速率不同将冷冻方法分为三种类型: 快速冷冻法（液氮蒸汽法）、慢速冷冻法（程序冷冻法）和玻璃化冷冻法。

目前，国内外许多研究认为采用快速冷冻法和慢速冷冻法两种方法冷冻后，人类精子冷冻复苏率无统计学差异，两种方法冷冻方法均可适用于常规的精子冷冻[9、10、11、12]。

另外，通过玻璃化冷冻方法对精子进行冷冻也取得很好的效果。

Isachenko V等通过对上游法处理好的精液，用无冷冻保护剂与常规甘油保护剂的慢速冷冻方法比较，发现大体积的玻璃化冷冻方法对精子复苏后精子活力、精子膜完整性均高于普通的冷冻方法[13]。

冷冻过程中与冷冻保护剂接触的时间和温度也会对精子冷冻复苏效果产生影响。

冷冻保护剂在温度较高的情况下随着温度上升，毒性也随之增加。

因此，在精子冷冻前，一定要注意温度不要过高，室温应该保持在20～30℃。

同时，要注意平衡时间不宜太长。

1.3 复温方法与精子冷冻过程一样，复苏过程同样会对精子产生损伤。

但精子复苏过程到目前为止，还没有得到一个最佳的精液复苏方法。

一般认为水浴比在空气中复温速率更快，并且外界温度越高，复温速率越大。

现有的复温方法大致包括37℃水浴、15℃水浴、冰水及室温空气中自然复温4种。

有些研究认为4种复温方法效果大致相同，也有研究并不认同。

有研究认为冷冻精子在40℃条件下复苏比在20℃与37℃之间复苏有更高的精子冷冻复苏率，但两种温度复苏后精子的顶体完整率、DNA一致性，ATP酶含量差异并没有统计学意义[14]。

1.4 精浆比例人类的精浆成份比较复杂，它的许多功能目前也没完全研究清楚。

有研究认为精浆中的前列腺素E可以增加精子内的cAMP浓度[15]，以此来提高精子的运动能力；此外，Henricks等认为胰岛素样生长因子I及其在精子上的受体可以提高精子运动能力，尤其可以提高直线运动速率[16]。

但也有研究认为精浆不利于精子受精。

通常情况下，在进行宫腔人工授精时，精液常常洗涤以后使用以去除精浆对受精的影响[17]。

对于精浆，不同配比的保护剂，保护效力也会不同。

有研究显示，与精浆浓度50%相比，75%精浆可能具有更好的保护效果[18]。

王学本等通过对含精浆浓度为0%,25%,50%,75%和100%的精子冷冻复苏率进行比较得出结论：一定的精浆浓度可以提高精子的冷冻复苏效果。

即对某些不育患者的异常精液进行冷冻处理同时利用高冷冻复苏率的供者精浆置换不育患者精液的精浆可能获得较好的复苏效果[19]。

1.5 优选处理正常的精子可以耐受一定范围内的冷冻和解冻速率。

然而，冷冻保存确实对人精子功能有不良效应，特别是降低精子活力。

一般而言，冷冻和解冻后仅约50%的活动精子存活。

优化冷冻保存程序可使冷冻损伤降到最低，并且可以由此增加妊娠率[20]。

并且，冷冻前精液质量越好（精子浓度、精子活力、形态正常精子百分率），冷冻复苏后精子的活力就越高。

因此，为了得到更高比例的活动精子，常常会在冷冻前进行精子的优选处理。

这样的精子对冷冻复苏损伤的耐受性更强，精子的冷冻复苏率更高。

1.6 反复冻融这种影响主要表现在精子活力的影响。

人类精液经过多次冷冻复苏过程，仍有一定比例的活动精子，但是，冷冻复温的循环次数越多，精子的活力和存活率就会越低。

因此，必须应该尽量减少这种冷冻复苏的循环过程。

有研究认为每经历一次冷冻复苏循环，精子DNA损伤率明显增加，精子活动力及存活率明显下降[21]。

1.7 储存时限从理论上讲，保存在-196℃的精子细胞，其代谢已基本停止，目前较为一致的观点是：如果储存的方式恰当，在很长的一段时间内精子的存活率不会有很大的变化，可以无限期地保存下去[22]。

众多的研究结果也表明，精液在液氮中保存数日与数月乃至数年，复温后精子存活率相同[23]。

Yogev L 等对储存了0.5-14.4年的共2525份精液标本研究发现，长时间的精液保存不会影响复苏后前向运动精子的浓度[24]。

但有些研究也认为长期保存对精子会有一定程度的不利影响[25]。

1.8 保存条件用液氮蒸气代替液氮保存能够减少交叉污染的机会。

因此有研究者建议将气相技术用于艾滋病病毒、乙肝病毒、丙肝病毒等携带者或患者的精子保存上。

然而，在液氮气相贮存罐中，温度的梯度变化大，具体取决于容器的形状、容量和材料类型。

并且应用气相贮存，需确保标本温度不低于-130℃否则易造成精子损伤。

然而有研究关于精子在液氮及气态氮中保存对精子冻存效果的影响进行了比较，发现两种保存方式对冷冻精液的质量没有显著影响[26]。

2. 精液自身因素对冷冻复苏效果的影响精子冷冻复苏率的个体差异很大，而且同一个人不同批次的精液其冷冻复苏率也不尽相同。

一般情况下，冷冻前精子质量越高，解冻后精子的活力会越好，因此精液常规参数可以作为预测精子冷冻复苏效果的重要指标。

精液的自身因素包括：精子因素（精液常规参数、精子基因及蛋白）、精浆成分（还原型谷胱甘肽含量、ROS浓度、胆固醇及Ca离子的浓度）等等。

2.1 精子因素2.1.1 精液常规参数评估精液质量的常规参数主要包括精子浓度、精子活力及形态正常精子百分率等等。

使用冷冻前精液参数作为冷冻复苏后精子活力的预测指标的可靠性意见仍不一致，一些研究表明，冷冻前的精子活力与精子冷冻复苏率相关[27]；另有一些研究表明使用冷冻前参数很难预测精子复苏率。

但大多数支持前者，尤其是精子正常形态与冷冻复苏率具有更高的相关性。

Yogev L等研究发现射精后1h及4h精子活动力是预测精子耐冻性最好的指标[28]。

此外，形态异常的精子与正常形态的精子相比，在经过冷冻后更容易引起DNA损伤[29]。

2.1.2 精子细胞凋亡关于精子细胞的凋亡对冷冻复苏效果的影响，Said等对10例健康志愿者的精液通过磁性分离（MACS）技术进行处理，从而筛选到凋亡率低的精子，通过MACS 技术筛选后的精子进行冷冻复苏后，冷冻复苏率明显高于未经MACS技术筛选的精子,因此，他们认为筛选过的细胞凋亡率低的精子更易在冷冻复苏技术中保存更久且获得更大的受精率。

[30]。

2.1.3 精子的基因人类精液冷冻技术在有些精液标本中应用得很成功，但在有些精液标本中却存在一些问题，冷冻复苏后精子活力低。

现在，有越来越多的证据表明精子对冷冻复苏过程的耐受性存在着个体差异，如：有些人或者动物的精液在冷冻前各项参数都很好，但冷冻复苏后精子的活力及存活率却很低。

而且无精症及弱精症患者的精子基因调研显示有基因异常。

因此寻找个体的基因差异能给精液冷冻保存提供基因基础指导。

2.1.4 精子的蛋白热休克蛋白(HSP)又称应激蛋白，是细胞应激反应的生物标志，也是细胞的内源性保护蛋白，发挥着分子伴侣的作用。

研究发现，在精子冷冻复苏过程中，精子受到有害因素的刺激，HSP将对精子的冷冻损伤有一定的保护作用。

HSP90在公羊精子冷冻复苏过程中，就对精子冷冻损伤具有保护作用，HSP90含量也因此可用于预测公羊精子的耐冻能力[31]。

2.2 精浆因素2.2.1 活性氧精子获能及精子的顶体反应都需要活性氧（ROS）的存在，有研究表明缺乏ROS的冷冻精液的精子活力比含有ROS的冷冻精液的精子活力低，精子形态异常率更高，即认为精子冷冻复苏后的活动力与精液中SOD含量呈正相关。