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不同脱钙条件对骨组织免疫组织化学染色抗原性的影响浅析摘要目的分析不同脱钙条件对骨组织免疫组织化学（免疫组化）染色抗原性的影响。
方法用8%硝酸分别于微波、光波及光波+微波组合Ⅰ、光波+微波组合Ⅱ的条件下对骨组织进行脱钙，并将室温（20℃）条件下脱钙的骨组织作为对照组，运用链霉菌素卵白素-生物素（LSAB）免疫组化染色技术，并对其染色效果进行分析比较。
结果微波、光波、光波+微波组合Ⅰ及光波+微波组合Ⅱ的脱钙时间显著低于对照组，且免疫组化染色效果显著优于对照组（P＜0.05）；光波+微波组合的免疫组化染色效果显著优于微波、光波（P＜0.05）；但微波与光波之间、光波+微波组合Ⅰ与光波+微波组合Ⅱ之间的免疫组化染色效果比较，差异无统计学意义（P>0.05）。
结论光波+微波组合脱钙时间要明显短于微波、光波及室温脱钙，且具有良好的免疫组化染色效果。
关键词脱钙条件；骨组织；免疫组织化学染色；抗原性【Abstract】Objective To analyze influence by different decalcification conditions on bone tissue antigenicity in immunohistochemical staining. Methods Decalcification was made through 8% nitric acid under microwave，light wave，light wave + microwave Ⅰand light wave + microwave Ⅱin bone tissue. Decalcification under room temperature （20℃）was taken as control group. Labelled streptavidin biotin method （LSAB）immunohistochemical staining was applied to analyze and compare stain effects. Results Decalcification time under microwave，light wave，light wave + microwave Ⅰand light wave + microwave Ⅱwere all shorter than control group，and their immunohistochemical staining effects were all better than control group （P＜0.05）. Light wave + microwave had better immunohistochemical staining effects than single microwave or light wave （P ＜0.05）. There was no statistically significant difference of immunohistochemical staining effects across microwave，light wave，light wave + microwave Ⅰand light wave + microwave Ⅱ（P>0.05）. Conclusion Light wave + microwave provides shorter decalcification time than microwave，light wave and room temperature，and it contains good immunohistochemical staining effect.【Key words】Decalcification condition；Bone tissue；Immunohistochemical staining；Antigenicity目前，免疫組化染色技术是临床病理鉴别及诊断的重要手段，骨组织由于含有丰富的钙盐，因此其免疫组织化学染色自然与常规石蜡切片有所区别，通常需要先去除钙盐后才可制成比较薄的切片，然后再进行常规脱水、透明处理等操作[1]。
不同的脱钙液在骨组织制片中的比较应用
罗灿峤;莫木琼;钟觉民
【期刊名称】《中国实用医药》
【年(卷),期】2011(006)019
【摘要】目的比较不同的脱钙液对骨组织的脱钙能力的差异,探讨其对HE染色的影响.方法选取50例手术切除的新鲜骨标本,运用4种常用的脱钙液(14%硝酸、10%盐酸、20%甲盐酸和EDTA脱钙液)进行脱钙,比较其脱钙效果和对HE染色的影响.结果不同的脱钙液对骨组织的脱钙能力、HE染色效果影响有显著区别.结论14%硝酸脱钙能力最强,用时间最短,染色的效果最差;10%盐酸对骨组织的损伤
小,HE染色的效果最好,但用时较长;20%甲盐酸脱钙能力和HE染色效果都介于10%盐酸和EDTA脱钙液之间;EDTA脱钙液脱钙用时最长,对骨组织的损伤最小.
【总页数】2页(P27-28)
【作者】罗灿峤;莫木琼;钟觉民
【作者单位】510085,中山大学附属第一医院病理科;510085,中山大学附属第一医院耳鼻喉科;510085,中山大学附属第一医院病理科
【正文语种】中文
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4.一种改良脱钙液在骨组织制片中的临床应用 [J], 何蓉;陈建萍;李艳
5.不同成份脱钙液对骨组织脱钙效果的比较 [J], 祁宏枝; 罗添友; 唐涛
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三种脱钙液对狗牙齿及牙槽骨脱钙效果的比较
于洪藻;李玉林;张丽红;王成坤;蔡家骏
【期刊名称】《口腔医学纵横》
【年(卷),期】1994(10)3
【摘要】作者将１２０颗狗牙骨组织块随机分三组，分别用２５％甲酸－甲醛液加微温、ＥＤＴＡ二钠液及８％硝酸溶液等三种脱钙方法进行脱钙，并比较其优劣．结果甲酸－甲醛液加微温脱钙速度快，组织结构保存良好，酸度适宜，其组织切片行ＨＥ染色时，红蓝反差良好，核染色清晰。
【总页数】2页(P175-176)
【关键词】犬;牙齿;牙槽骨;脱钙;脱钙液;效果
【作者】于洪藻;李玉林;张丽红;王成坤;蔡家骏
【作者单位】白求恩医科大学基础医学院,白求恩医科大学口腔医学院
【正文语种】中文
【中图分类】R780.2
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5.不同成份脱钙液对骨组织脱钙效果的比较 [J], 祁宏枝; 罗添友; 唐涛
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脱钙骨组织的染色方法一、引言脱钙骨组织的染色方法是一项重要的实验技术，广泛应用于生物医学研究领域。
通过染色可以使骨组织的细胞和结构更加清晰可见，有助于研究人员观察和分析骨组织的形态、结构和功能等方面的信息。
本文将介绍几种常用的脱钙骨组织染色方法。
二、酸性染色法酸性染色法是一种常见的脱钙骨组织染色方法，主要利用酸性染料对骨组织中的细胞和结构进行染色。
该方法的步骤如下：1. 取得骨组织样本后，首先进行固定处理，常用的固定剂有甲醛和乙酸乙酯等。
2. 将固定后的骨组织进行脱脂处理，常用的脱脂剂有乙醇和二甲苯等。
3. 将脱脂后的骨组织进行脱钙处理，常用的脱钙剂有盐酸和酸性醇等。
4. 脱钙后的骨组织进行酸性染色处理，常用的酸性染料有伊红和快速绿等。
5. 染色后的骨组织进行脱水处理，常用的脱水剂有乙醇和丙酮等。
6. 最后进行封片处理，使骨组织样本可以长期保存。
三、碱性染色法碱性染色法是另一种常用的脱钙骨组织染色方法，与酸性染色法相比，碱性染色法主要利用碱性染料对骨组织中的细胞和结构进行染色。
该方法的步骤如下：1. 取得骨组织样本后，进行固定处理和脱脂处理，步骤与酸性染色法相同。
2. 将脱钙后的骨组织进行碱性染色处理，常用的碱性染料有甲苯胺蓝和噻唑蓝等。
3. 染色后的骨组织进行脱水处理和封片处理，步骤与酸性染色法相同。
四、免疫染色法免疫染色法是一种基于免疫学原理的脱钙骨组织染色方法，通过特异性抗体与骨组织中的特定分子结合，使这些分子在显微镜下可见。
该方法的步骤如下：1. 取得骨组织样本后，进行固定处理和脱脂处理，步骤与酸性染色法相同。
2. 进行抗原修复处理，以增强抗原的免疫反应性。
3. 将修复后的骨组织进行抗体处理，常用的抗体有一抗和二抗等。
4. 进行染色反应，通过显色剂使抗原与抗体结合的部位显色可见。
5. 最后进行脱水处理和封片处理，步骤与酸性染色法相同。
五、其他方法除了上述常用的酸性染色法、碱性染色法和免疫染色法外，还有一些其他方法也可以用于脱钙骨组织的染色。
10％ EDTA、5％硝酸用于大鼠颞骨脱钙处理的效果对比观察卓洋;王巧;杨聪颖;陈昊;李爱民【摘要】目的观察并比较10％乙二胺四乙酸二钠(EDTA)和5％硝酸脱钙处理大鼠颞骨的效果.方法 SD大鼠10只,随机分为EDTA组和硝酸组,取出大鼠颞骨后分别置于10％ EDTA、5％硝酸脱钙液中进行脱钙处理.观察两组脱钙效果,记录脱钙时间,采用甲苯胺蓝染色进行颞骨组织形态学观察,采用免疫荧光双标染色检测α-tubulin蛋白、水通道蛋白1(AQPl).结果两组取材过程中,颅骨硬度适当,颞骨可轻松切下,无砂砾感,切下的颞骨无松散及组织脱落.硝酸组脱钙所需时间分别为(11.20±0.83)d、(26.20 ±2.38) min,两组相比,P＜0.05.EDTA组颞骨整体形态保持完好,蜗管、镫骨肌、岩动脉、神经元、雪旺细胞、郎飞结、神经干可清晰辨识;硝酸组颞骨整体结构保存较理想,神经元形态保持尚可,但存在骨质染色不均、雪旺细胞崩解、轴突肿胀、郎飞结消失现象.EDTA组颞骨脱钙后AQP1、α-tubulin蛋白定位准确,组织区分度高;硝酸组由于细胞膜中AQP1遭受破坏、位于微管内的α-tubulin蛋白漏出细胞,荧光消减明显,组织形态保持较差.结论 10％ EDTA和5％硝酸用于大鼠颞骨脱钙处理效果均较好,两种脱钙液均适用于普通病理及结构观察,若用于蛋白定量及定性方面研究,应首选10％ EDTA.【期刊名称】《山东医药》【年(卷),期】2016(056)031【总页数】3页(P43-45)【关键词】骨脱钙技术;乙二胺四乙酸二钠;硝酸;颞骨【作者】卓洋;王巧;杨聪颖;陈昊;李爱民【作者单位】徐州医学院附属连云港医院,江苏连云港222000;徐州医学院附属连云港医院,江苏连云港222000;徐州医学院附属连云港医院,江苏连云港222000;徐州医学院附属连云港医院,江苏连云港222000;徐州医学院附属连云港医院,江苏连云港222000【正文语种】中文【中图分类】R446.6颞骨参与构成头颅的侧部与颅底，其中穿行面神经、脑膜中动脉及分支，颞骨同时容纳听觉器官及其附属结构，颞骨骨折可造成上述结构损伤，引起相应并发症[1]。
三种脱钙液对骨组织免疫组化染色的影响目的探讨三种脱钙液对骨组织免疫组化染色的影响。
方法选择12例骨组织，随机分为3组。
A组用14%硝酸脱钙液进行处理，B、C组分别用EDTA 脱钙液、PLANK脱钙液进行处理，同时对CD3、CD68、Ki—67 和TTF—1染色。
结果室温条件下，硝酸脱钙液的脱钙时间最短，但对组织损伤最大。
PLANK 脱钙液和EDTA脱钙液脱钙效果较好，组织结构完整，形态清晰，免疫组化染色较好。
结论室温条件下，三种脱钙液中PLANK脱钙液和EDTA脱钙液对骨组织脱钙及免疫组化染色效果较好。
但由于EDTA脱钙液脱钙时间过长，PLANK 脱钙液脱钙均匀，速度快，更适合用于临床病理检查。
硝酸脱钙液脱钙最快，但是免疫组化染色效果较差。
标签：脱钙液；骨组织；免疫组化染色骨组织内含有大量无机钙盐，结缔组织坚硬，难以直接制片[1]。
如果强制切片，在蓝色钙盐背景下，往往无法看清细胞结构，所以需要选择一种能保持骨组织形态结构和染色后有利于保持细胞结构清晰度和对比度的脱钙液。
本文研究14%（体积分数）硝酸脱钙液、EDTA脱钙液、PLANK脱钙液对骨组织免疫组化染色的影响，以期寻找一种效果比较理想的脱钙液，对病理诊断工作提供帮助。
1 材料与方法1.1 标本选择12例骨组织标本均来源于我院，切成1 cm×1 cm×0.3 cm的骨块，在福尔马林中性液内固定24 h，用于脱钙及免疫组化染色实验。
1.2 三种脱钙液①脱钙液Ⅰ：14%（体积分数）硝酸脱钙液，配制方法为14 mL浓硝酸加入86 mL蒸馏水；②脱钙液Ⅱ：EDTA脱钙液，配制方法为EDTA10 g，蒸馏水100 mL，加NaOH充分搅拌溶解，在用10 mol/L的HCl调pH为8.0，最后加入4%甲醛15 mL。
③脱钙液Ⅲ：PLANK脱钙液，配制方法为氯化铝10 g，甲酸50 mL，10%福尔马林10 mL，冰乙酸1.5 mL，加蒸馏水至总体积100 mL。
骨组织脱钙液介绍骨组织脱钙液概述在病理实验制作切片时，我们会经常碰到一些含钙组织，而且钙十分坚硬。
由于组织中的钙和石蜡之间的密度不同，含钙的组织一般不能直接制作切片。
骨组织含钙量最多。
除了骨组织之外其它组织也可发生钙化，在组织中形成钙化区，所以需要经过脱钙过程。
脱钙是制作骨组织切片的重要环节，尤其是要进行免疫组织化学染色的骨组织。
为达到骨组织既充分脱钙，又保护骨组织的抗原不受破坏，需要对含钙的织固定之后再进行脱钙或采用固定兼有脱钙的液体处理，固定并脱钙。
然后再行常规制片。
用于脱钙的试剂很多，脱钙剂包括有机酸、无机酸、乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid EDTA）除此之外还有电解脱钙法。
强有机酸，如硝酸和盐酸可用于密皮质骨的脱钙，在短时间内可除去大量的钙。
令人遗憾的是这些强酸对组织形态会产生不良影响，脱钙作用强对组织破坏性大。
细小的组织，例如，骨髓组织不推荐用强酸脱钙。
虽然可以使用各种附加剂，如缓冲液具有保护组织的作用，但也降低了脱钙速度。
因此，各种脱钙液的配方都围绕着脱钙速度和消除对组织的不良影响而设计。
在酸类脱钙液中醋酸和甲酸比较适合于骨髓组织脱钙。
甲酸是一种使用范围较广的脱钙剂。
甲酸脱钙 10% 浓度比较合适。
醋酸和甲酸的作用比较弱，脱钙速度比较慢，它们不适合密皮质骨的脱钙。
EDTA 是一种比较温和的脱钙剂（EDTA 不是酸）。
对组织的渗透性差，作用慢。
大剂量使用价格较贵。
电解脱钙对组织损害最小，因为它的脱钙速度太慢，所以，不适合常规使用。
不同的脱钙液对骨组织的脱钙作用不同，脱钙效果也不完全相同。
为了达到良好的脱钙效果，建议使用EDTA脱钙液，该脱钙液对组织损伤较小，缺点就是脱钙时间会比较长些，但脱钙时间也要根据组织块大小而定。
目前国内生产EDTA脱钙液的公司也很少，个人感觉上海舜百生物的EDTA脱钙液使用效果还不错，脱钙脱的比较彻底，而且对组织损伤很小，就是周期长了些。
骨及钙化组织切片的复方脱钙液的配制及脱钙方法作者：温娜唐泽波王爽朱辛为来源：《中国医药导报》2008年第27期[关键词] 骨及钙化组织；复方脱钙液；脱钙方法；改良除酸[中图分类号]R816.8 [文献标识码]B [文章编号]1673-7210（2008）09（c）-116-01骨及钙化组织非常坚硬，将其制成几微米薄切片难度较大。
常用的方法是先脱钙，使组织变软后再切片，所以脱钙是非常关键的技术。
目前使用的脱钙剂多为无机强酸类制剂，虽脱钙效果较好，但常造成组织形态，特别是细胞结构的破坏，影响骨组织形态观察和研究。
为此，我们使用复方脱钙液脱钙，不仅能够保持组织形态良好，亦能用于特殊染色及切片，现介绍如下：1 材料临床医学生对狗行外科手术后，取胫骨分别锯成1 cm长，再沿胫骨纵向劈成四段。
用生理盐水或0.1 mol/L的PBS(pH7.2~7.4)缓冲液洗2次，然后入3%戊二醛和4%多聚甲醛1:1混合液固定4 h；SHARP3A65型微波炉(日本，最大功率850 W，分5档可调)。
复方脱钙液：盐酸8 ml，醋酸5 ml和水杨酸10 g；依次加入蒸馏水87 ml中混合，配制成复方脱钙液。
2 方法2.1 脱钙方法将装标本的塑料提篮放在中型平底烧杯内加入复方脱钙液，再将其放入装有冰水的大平底烧杯或微波炉专用的塑料容器内，入微波炉2档10 min，取出更换经冰水制冷的脱钙液及吸热用的冷水，置炉内继续重复进行。
判断脱钙情况，决定是否再次重复，操作致脱钙完成。
脱钙过程中要随时检测脱钙液温度以不超过40℃为宜，并视情况更换脱钙液和检查脱钙程度。
该法是众多加速脱钙法中效果最显著，应用最多的方法[1]。
2.2 脱钙终点判定脱钙完成即应终止，以免脱钙过度，造成不应有的损伤。
脱钙未完成即终止，脱钙不净在切片时标本破碎，影响切片质量。
因此，如何判定脱钙终点很重要。
从理论上讲，脱钙终点的测定方法有物理、化学及X线照相技术等。
在实际工作中我们常采用针刺法，该法简单方便，易于掌握，唯其用于刺戳之针应采用针灸用体针为宜。
脱钙方法和步骤固定：10%缓冲中性福尔马林固定5天。
所有固定的标本用流水缓慢冲洗30分钟，较大的标本冲洗大约1小时。
避免用水快速冲洗。
液体和试剂A．8%盐酸储存液盐酸，浓40ml蒸馏水460mlB．8%甲酸储存液甲酸40ml蒸馏水460mlC．盐酸/甲酸工作液8%盐酸液和8%甲酸液等量混合。
*替换液：D．5%硝酸硝酸5ml蒸馏水95mlE．氨水：氨水，浓5滴蒸馏水100ml脱钙步骤1．标本放入盐酸/甲酸工作液（或5%硝酸液）20倍与它们容积。
2．每天更换新脱钙液直到脱钙完成，根据标本大小脱钙时间可能需要24小时到几天或几个月。
见下面的实验步骤（钙步骤用兔的脊椎骨进行脱钙实验，大约20小时，脱钙效果很好）。
3．一旦脱钙完成，标本短时间用水冲洗并移到氨水中30分钟中和残留在标本中的剩余的酸。
4．标本用自来水彻底冲洗24小时。
5．常规石蜡包埋。
标本不要聚集在一起并不要紧贴瓶底以便于彻底脱钙。
标本脱钙过度对组织是一种永久性的损害，无法挽救。
下面步骤可以帮助正确判断脱钙终点。
脱钙终点：X-ray(最准确的方法)化学测试法（准确）物理测试（相对准确并标本会有潜在的损害）化学测试法下面是化学检测脱钙终点需要的液体F．5%氢氧化铵储存液氢氧化铵28% 5ml蒸馏水95mlG．5%草酸铵储存液草酸铵5ml蒸馏水95mlH．氢氧化铵/草酸铵工作液：5%氢氧化铵储存液和5%草酸铵储存液等份使用。
检测步骤1.吸管插入正在进行脱钙含有样品的脱钙液中。
2.从底部抽取5ml盐酸/甲酸脱钙工作液，装入一个试管中。
3.加入大约10ml氢氧化铵/草酸铵工作液，充分混合室温放置过夜。
4.每天测试一次，连续测试两个工作日，也以2天或3天重复测试一次，骨组织完全脱钙之后液体不出现沉淀。
物理测试：物理测试包括弯曲样品或用针插入样品中，用刀片切割脱钙的组织。
缺点是插入针或刀片切入点或留下人为针孔和裂开的刀痕。
稍微弯曲标本后组织会有较小破裂，但是，如果所有钙盐去除后不能确定损伤情况。
