柑桔组织培养研究

柑橘黄龙病病原培养及分子检测技术研究进展宋晓兵，彭埃天，陈霞，程保平，凌金锋（广东省农业科学院植物保护研究所/广东省植物保护新技术重点实验室，广东广州510640）摘要：柑橘黄龙病（Huanglongbing）由韧皮部杆菌属细菌（Candidatus Liberobacter sp.）侵染引起，是柑橘生产上的毁灭性病害，当前正在世界柑橘产区迅速蔓延，已成为制约柑橘产业健康发展的关键因素之一。

介绍了柑橘黄龙病的症状以及病原的分离培养研究进展，阐述了病原的分子检测技术，包括PCR、双重PCR、实时荧光定量PCR和LAMP快速检测技术，并对病害的防控进行展望。

关键词：柑橘黄龙病；韧皮部杆菌属细菌；病原培养；检测技术中图分类号：S436.6文献标识码：A文章编号：1004-874X（2013）23-0065-05 Research advances of Citrus Huanglongbing pathogenculture and detection technologySONG Xiao-bing，PENG Ai-tian，CHEN Xia，CHENG Bao-ping，LING Jin-feng （Research Institute of Plant Protection,Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection，Guangzhou510640，China）Abstract：Citrus greening disease(Huanglongbing)caused by bacterial(Candidatus Liberobacter sp.),is a devastating disease of citrus production,is currently spreading rapidly in citrus producing areas of the world and has become a key constraint factor of the citrus industry.This article describes the symptoms of citrus Huanglongbing disease and pathogen isolation and culture,a detailed molecular pathogen detection technology,including PCR,double-PCR,real-time PCR and LAMP rapid detection technology,and made the prospect of disease prevention and control.Key words：Huanglongbing；Candidatus Liberobacter sp.；pathogen isolation；detection technology黄龙病是柑橘产业上极具毁灭性的病害，能侵染各种柑橘类植物，尚无有效的治疗性药剂，也没有抗（耐）病品种可供应用。

熟的珠心胚或合子胚培养比较简单， 对培养基和培养 条件没有严格要求， 只要在含有大量营养元素的无机 盐和蔗糖培养基上， 0 一 ℃ 在.2 2 条件下均易萌发生 5
长。目 前柑橘胚培养的研究重点则是幼胚、 败育胚培 养以及幼胚的早期鉴定。
受诸多因素影响。选择适宜的培养基是花药培养诱 导单倍体成功的关键因素之一。常用的基本培养基 有:M Whit 、 S、 e Nitsch 、T、 S 一 等。 M N6、 1 J 诱导小抱子启 动分裂形成花粉胚状体阶段适宜采用 N6 培养基或 者S 一 培养基; 诱导胚状体分化为小植株阶段适宜 J 1 采用改良MS 培养基;诱导生根阶段可以采用 MS 培
2007 年 1月
第 1卷第 1期
柑橘组织培养研究进展
陈 霞， 谢永红， 新 魏召
( 重庆 市农业科学院 研究所， 0 2 娜 果树 江津4
摘 要:重点概述了近年来柑橘花药培养、 胚培养、 胚乳培养、 茎尖培养和原生质体培养的国内外研究概况， 并对柑橘组
织培养的现状、 影响因素和研究中存在问题进行分析、 讨论。
新途径。 花药培养诱导柑橘花粉植株成功率及诱导频率
大多数柑橘品种具有多胚现象， 合子胚(有性胚) 往往只 有一个， 其余为珠心胚(无性胚)。与珠心胚相 比， 合子胚在竞争上处于劣势， 从而导致在杂交育种 中合子胚退化或败育严重， 这对于有性杂交育种是一
个很大的障碍。导致近几十年来注册的柑橘品种通 过杂交育种出的， 所占的比 例不到4 2%。 . 柑橘胚培养包括成熟胚和未成熟胚的培养。成
1.2 胚培养
包括花药培养、 胚培养、 胚乳培养、 茎段培养、 原生质
体培养等。 1.，花药培养 花药培养是近年发展起来的应用现代生物技术

３．１．过氧化物酶（ＰＯＤ）的变化图１和图２分别为愈伤组织诱导和分化阶段的ＰＯＤ电泳凝胶成像图。

由图看出，两个阶段共出现了６条酶带，从上到下依次为ＰＯＤｌ－ＰＯＤ６，迁移率分别为：Ｒｆ，＝０．０５６，Ｒｆ２＝０．０８９，Ｒｆ３＝０．２８９，Ｒｆ，＝０．３６７，Ｒｆｓ＝０．５０，Ｒｆ６＝０．５５６。

其中ＰＯＤ３是表达最强的特征谱带，在任何时期都有，且活性稳定。

在愈伤组织诱导阶段，酶谱的变化主要有：ＰＯＤ，表现出逐渐加强，由弱带变成强带；ＰＯＤ２是在第１２ｄ出现，也是逐渐变成强带；弱带ＰＯＤ４在离体培养１ｄ后消失了，另外两条弱带ＰＯＤｓ开和ＰＯＤ６均是在第１２ｄ出现。

在愈伤组织分化阶段，酶谱的变化主要有：弱带ＰＯＤ４在分化第２４ｄ重新出现；另两条弱带ＰＯＤ４和ＰＯＤ５分化２ｄ后减弱直至消失，但第３０ｄ又有较强的表达。

Ｏｄ１ｄ２ｄ４ｄ６ｄ１２ｄ１８ｄ２４ｄ叫１ｄ２ｄ４ｄ６ｄ１２ｄ１８ｄ２４＜Ｉ图１愈伤组织诱导阶段ＰＯＤ酶谱Ｆｉｇ．１ＰＯＤｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｓｐｅｃｔｒｕｍｏｆｃａｌｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎｌｄ２ｄ４ｄ６ｄ１２ｄ２４ｄ３０ｄ３６ｄ２ｄ４ｄ６ｄ１２ｄ２４ｄ３０ｄ３６ｄ—ｌｄ图２愈伤组织分化阶段ＰＯＤ酶谱Ｆｉｇ．２ＰＯＤｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｃｓｉｓｓｐｅｃｔｒｕｍｏｆｃａｌｌｕｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ３．２超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）的变化图３和图４分别为愈伤组织诱导和分化阶段的ＳＯＤ电泳凝胶扫描图像。

由图看出，两个阶段共出现了７条酶带，从上到下依次为ＳＯＤｌ一ＳＯＤ７，迁移率分别为：Ｒｆｉ＝０．３２，Ｒｆ２＝０．４３，Ｒｆ３＝０．５５，Ｒｆ４＝０．６８，Ｒｆｓ＝０．７５，Ｒｆ６＝０．８０，ＲｆＴ＝０．８５。

其中有两条强带ＳＯＤｌ、ＳＯＤ５和一条弱带ＳＯＤ３是特征性谱带，表达稳定。

在愈伤组织诱导阶段，ＳＯＤ４逐渐减弱，第１２ｄ消失。

在愈伤组织分化阶段，酶谱的变化主要是：ＳＯＤ２在分化第２４ｄ出现；ＳＯＤ６在分化第６ｄ消失，但第２４ｄ又重新出现；ＳＯＤ７在分化第２４ｄ出现。

柑桔组培方案1. 引言柑桔是一种常见的水果，具有丰富的维生素C和纤维素。

随着人们对健康饮食的重视和对有机食品的需求增加，柑桔的种植和生产得到了更多人的关注。

为了满足市场需求，提高柑桔的产量和质量，组培技术成为一种重要的培育方法。

本文将介绍一种柑桔组培方案，以帮助农业技术人员和研究人员更好地了解如何利用组培技术进行柑桔培育。

2. 材料与方法2.1 材料准备•柑桔种子或幼苗•培养基：含有适当浓度的植物生长调节剂•培养瓶或培养皿•光照设备或人工灯光•温控设备或恒温箱•无菌操作器具：如无菌培养室、无菌培养器具等2.2 组培步骤1.选择柑桔种子或幼苗：根据需要，选择宿主柑桔种子或幼苗作为组培材料。

确保材料的健康、无病虫害，并在无菌条件下处理。

2.材料表面消毒：将柑桔种子或幼苗表面用70%的乙醇或浸泡在含有适当浓度消毒液（如漂白粉）的溶液中进行表面消毒处理，随后用无菌蒸馏水或无菌PBS洗涤干净。

3.分离和培养组织：将消毒后的柑桔种子或幼苗切割成小片或小块，然后将其置于含有适当浓度培养基的培养瓶或培养皿中。

4.培养环境调控：根据柑桔的生长和发育要求，设置适当的光照、温度和湿度条件。

对于柑桔组培，一般建议使用光照周期12小时/暗周期12小时，温度保持在25-28°C，相对湿度保持在60-70%。

5.培养基更新：定期更换新鲜的培养基，以提供充足的营养物质和生长调节剂供柑桔细胞生长和分化。

6.培养基组成调整：根据实际需要，可以根据具体实验目的，调整培养基的组成，例如添加激素促进柑桔的生长与分化。

7.接种植株移栽：当柑桔组培苗生长至一定大小时，可以将其移栽到适当的培养基或土壤中，继续培养和生长。

3. 结果与讨论柑桔组培是一种高效、可靠的培育方法，可以大大缩短育种周期、提高种苗质量。

通过对培养基组成、培养条件的调控，可以调控柑桔的生长与分化过程，进一步提高产量和品质。

同时，柑桔组培可以减少病虫害的传播和土壤污染，具有环境友好性。