羟脯氨酸(HYP)含量检测试剂盒说明书 微量法

辅酶ⅠNAD(H)含量试剂盒说明书微量法100管/48样注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义：辅酶ⅠNAD(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NAD+是糖酵解（EMP）和三羧酸循环（TCA）的主要氢受体，生成的NADH经呼吸电子链（ETC）传递把电子交给氧，在合成ATP的同时，形成大量的ROS，同时NADH再生为NAD+。

糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。

NAD(H)含量和NADH/NAD+比值的高低可用于评价糖酵解和TCA循环的强弱。

较高的NAD(H)及NADH/NAD+比值说明细胞呼吸耗氧量较高，处于过氧化状态。

此外，NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和TCA循环。

另外，NAD+降解产物对细胞信号传导、代谢和基因表达等具有重要的调控作用。

测定原理：分别用酸性和碱性提取液提取样品中NAD+和NADH，NADH通过PMS的递氢作用，还原氧化型噻唑蓝（MTT）为甲瓒，在570nm下检测吸光值；而NAD+可被乙醇脱氢酶还原为NADH，进一步采用MTT还原法检测。

需自备的仪器和用品：酶标仪、台式离心机、移液器、96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：酸性提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存；碱性提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存；试剂一：液体10 mL×1瓶，4℃保存；试剂二：液体3 mL×1瓶，4℃保存；试剂三：粉剂×1瓶，-20 ℃保存，用时加入3mL蒸馏水，混匀，用不完的试剂4℃保存一周；试剂四：粉剂×1瓶，4 ℃保存，用时加入3mL蒸馏水，混匀，用不完的试剂4℃保存一周；试剂五：液体3.6mL×1瓶，4 ℃保存；试剂六：液体30mL×1瓶，4 ℃保存；试剂七：液体50mL×1瓶，4 ℃保存。

NAD+和NADH的提取：1 血清（浆）中NAD+和NADH的提取：NAD+的提取：按照血清（浆）体积（mL）：酸性提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议取约0.1mL血清（浆），加入1mL酸性提取液），95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μL上清液，加入500μL碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。

苏州科铭生物技术有限公司羟自由基清除能力测定试剂盒说明书微量法100T/96S注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：羟自由基作用于体内蛋白质、核酸、脂类等生物分子，造成细胞结构和功能受损，进而导致体内代谢紊乱引起疾病。

羟自由基清除能力是样品抗氧化能力的重要指标之一，在抗氧化类保健品和药品研究中得到广泛应用。

测定原理：H2O2/ Fe2+ 通过Fenton反应产生羟自由基，将邻二氮菲- Fe2+水溶液中Fe2+氧化为Fe3+，导致536nm吸光度下降，样品对536nm吸光度下降速率的抑制程度，反映了样品清除羟自由基的能力。

自备实验用品：恒温水浴锅、酶标仪、96孔板和蒸馏水。

试剂组成和配制:提取液：液体100 mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体12mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂二：液体6mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂三：液体12 mL×1瓶，4℃保存。

试剂四：液体6mL×1瓶，4℃保存。

样品的制备：1.组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2.血清、果汁等液体样品可直接测定。

3.提取物（或者药物）可配制成一定浓度，如5 mg/mL。

操作步骤：1、酶标仪预热30min，调节波长至536nm。

2、工作液配制：使用之前按照每管试剂一：试剂二：试剂三=100:50:100（µL）的比例配制，用多少配多少，混匀。

计算公式:羟自由基清除率D% =（A测-A对）÷（A空-A对）×100%A空、A对、A测：空白管、对照管和测定管的吸光值。

注意事项:为了比较不同样品羟自由基清除能力，对于同一批样品必须加入等量的样品，血清、组织匀浆、果汁等液体样品加入同样体积，提取物（或者药物）配制成同样浓度。

脯氨酸（Pro ）含量检测试剂盒说明书可见分光光度法注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC0290规格：50T/48S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

试剂名称规格保存条件提取液液体60mL×1瓶4℃保存试剂一液体45 mL×1瓶（自备）4℃保存试剂二液体45 mL×1瓶4℃保存标准品粉剂×1支4℃保存溶液的配制：1．试剂一：自备冰乙酸。

2．标准品：脯氨酸10 mg ，临用前加入1 mL 蒸馏水，配成10 mg/mL 标准品。

产品说明：脯氨酸（Pro ）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，逆境条件下，植物体内Pro 含量显著增加。

Pro 增加量在一定程度上反映了抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。

因此，脯氨酸增加量可以作为抗逆育种的生理指标之一。

用磺基水杨酸（SA ）提取Pro ，加热处理后，Pro 与酸性茚三酮溶液反应生成红色，在520nm 测定吸光度。

技术指标：最低检出限：0.1791 μg/mL 线性范围：0.5-40 μg/mL注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器及用品：可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、冰乙酸、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1、细胞、细菌或组织样本的制备：细菌或细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3秒，间隔10秒，重复30次），之后置沸水浴振荡提取10min ；10000g ，常温离心10min ，取上清，冷却后待测。

组织：称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆；之后置沸水浴振荡提取10min，10000g，常温离心10min，取上清，冷却后待测。

CellBiolabs羟脯氨酸检测试剂盒分析原理羟脯氨酸是一种由不可逆的翻译后酶合成的氨基酸脯氨酸经脯氨酰羟化酶羟化。

羟脯氨酸几乎只存在于细胞中蛋白质胶原蛋白，位于重复三肽Gly-X-Y的Y位置。

通过允许胶原蛋白螺旋，羟脯氨酸有助于稳定胶原蛋白的结构。

除了胶原蛋白，在转录因子缺氧诱导因子（HIF1）上观察到脯氨酸的羟基化。

在正常氧气条件下，蛋白质EGLN1在脯氨酸564处羟基化HIF-1α，允许von Hippel-Lindau肿瘤抑制因子（pVHL）泛素化并导致靶向性通过蛋白酶体降解HIF-1。

由于羟脯氨酸仅存在于胶原蛋白以外的少数蛋白质中，因此羟脯氨酸已被用作量化胶原蛋白和/或明胶水平的标志物（部分胶原蛋白水解产生蛋白质和肽的混合物）。

据估计羟脯氨酸占胶原蛋白的13.5%。

此外，还使用了羟脯氨酸测量确定某些涉及胶原蛋白分解的疾病。

例如，增加了在佩吉特骨病患者的血清中测定了胶原蛋白。

此外，羟脯氨酸增加该水平与前列腺癌、骨转移、肝纤维化以及前列腺癌相关三聚氰胺和三聚氰酸引起肾毒性。

Cell Biolabs/羟脯氨酸检测试剂盒为检测提供了一种方便的比色方法从组织、血浆、血清或尿液酸水解物中提取总羟脯氨酸。

首先是未知将样品或羟脯氨酸标准加入96孔板中。

然后，加入氯胺T混合物添加以将羟脯氨酸转化为吡咯。

最后，4-（二甲氨基）苯甲醛（DMAB）将混合物（也被称为埃利希试剂）添加到与吡咯反应的孔中，以使其反应产生生色团（下图），并在540-560 nm处读取板的吸光度。

内容通过与预定值进行比较，确定未知样品中羟脯氨酸的含量羟脯氨酸标准曲线。

提供的试剂足以评估96次分析包括标准品和未知样品。

（分析原理）1. STA-670: Homocysteine ELISA Kit2. STA-671: S-Adenosylhomocysteine (SAH) ELISA Kit3. STA-672: S-Adenosylmethionine (SAM) ELISA Kit4. STA-674: Glutamate Assay Kit。

羟自由基测定试剂盒使用说明货号：LA1950规格：50管/48样产品内容：试剂一：3%H2O2标准品贮备液0.5mL×1支，4℃保存3个月。

0.03%标准品应用液的配置：3%H2O2标准品贮备液：双蒸水=1：99稀释，现用现配。

试剂二：底物贮备液1mL×1支，4℃保存3个月。

底物应用液的配制：如果您的样本为抑制羟自由基，即测定管吸光度比对照管吸光度低，则底物反应液的配制：底物贮备液：双蒸水=1：99稀释，现用现配。

如果您的样本为产生羟自由基，即测定管吸光度比对照管吸光度高，则底物反应液的配制：底物贮备液：双蒸水=1：299稀释，现用现配。

试剂三：甲液贮备液2mL×1支，4℃保存3个月。

用时用双蒸水稀释至1：9稀释成应用液。

乙液7mL×2支，4℃保存3个月。

试剂三应用液的配制：甲液应用液与乙液等比列混合，按需配置，剩余的4℃保存。

试剂四：液体10mL×1瓶，4℃保存3个月。

用时加双蒸水稀释至100mL制备应用液，4℃保存。

若有结晶，则放置37℃水浴至全部溶解后再稀释。

试剂五：液体30mL×1瓶，避光4℃保存3个月。

试剂六：液体30mL×1瓶，避光4℃保存3个月。

试剂七：分析纯的冰乙酸自备。

显色剂的配制：试剂四应用液：试剂五：试剂六：冰乙酸=8:3:3:2，现用现配。

抑制羟自由基的物质如：血清（浆）、各种组织匀浆液、口服液等产生羟自由基的物质如：中性白细胞、某些药物、部分植物等。

产品简介：Fenton反应是最常见的产生羟自由基的化学反应，H2O2的量和Fenton反应产生的OH·量成正比，当给予电子受体后，用griess试剂显色，形成红色物质，其呈色与OH·的多少成正比列关系。

操作步骤：以上配制好的应用液，先在37℃水浴中温育3min，一下操作在37℃水浴中进行。

空白管标准管对照管测定管双蒸水（mL）0.40.20.20.03%H2O2标准应用液（mL）0.2底物应用液（mL）0.20.2样本（mL）0.2试剂三应用液（mL）0.40.40.40.4混匀，37℃反应1min（准确以秒表计时），从加完试剂三开始到1min结束，立即加入显色剂终止反应，一次只能做一个管子。

原料中羟脯氨酸含量的测定1.材料和试剂1.1材料秦宝雪花牛牛蹄筋：陕西秦宝牧业有限责任公司。

秦宝普通育肥牛、雪花牛肺：陕西秦宝牧业有限责任公司。

秦宝雪花牛棒骨：陕西秦宝牧业有限责任公司。

1.2试剂所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或去离子水，或相同浓度的水。

1.2.1硫酸溶液[c(H2SO4)≈3mol/L]量取750mL水于2L的容量瓶中，在搅拌下缓慢加入320mL浓硫酸（ρ20=1.84g/mL）。

冷却至室温后用水定容。

1.2.3缓冲溶液（PH=6.8）包括下列组分：a）26.0g一水柠檬酸（C6H8O7·H2O）；b）14.0g氢氧化钠；c）78.0g无水乙酸钠[Na(CH3CO2)]。

用500mL水溶解上述试剂并转入1L的容量瓶中，加入250mL 正丙醇，用水定容。

该溶液于4℃暗处可稳定保存几周。

1.2.4氯胺T溶液称取1.41g三水·N-氯-对甲苯磺酰胺钠盐（氯胺T），用100mL 缓冲溶液溶解。

临用前配制。

1.2.5显色剂称取10.0g对甲氨基苯甲醛，用30mL高氯酸溶液[70%（质量分数）]溶解，缓慢加入65mL异丙醇。

临用前配制。

1.3羟脯氨酸标准溶液1.3.1标准储备液称取50mg4-羟基-α-吡咯甲酸（羟脯氨酸）于100mL容量瓶中，用水溶解，加一滴硫酸溶液（1.2.1），用水定容。

该溶液于4℃下可稳定存放1个月。

1.3.2标准工作液移取5.00mL上述标准储备液至500mL容量瓶中，用水定容。

分别吸取该溶液10.00mL、20.00mL、30.00mL、40.00mL于100mL容量瓶中，用水定容，所得标准工作液浓度一次为0.5µg/mL、1.0µg/mL、1.5µg/mL、2.0µg/mL。

临用前配制。

2.仪器和设备3.试样制备用刀将原料在冷冻时（0℃以下）切成小块（约0.5cm3，边长约为8mm）。

将切好的试样装入密封样品盒中，或用耐热塑料袋真空包装，70℃以上保温30min后，冷却。

羟脯氨酸含量国标明胶含量一、引言羟脯氨酸和明胶是食品中常见的成分之一，其含量对于产品的质量和营养价值具有重要的影响。

本文将深入探讨羟脯氨酸含量国标和明胶含量的相关内容。

二、羟脯氨酸含量国标羟脯氨酸是一种非必需氨基酸，它在人体内具有重要的生理功能。

羟脯氨酸广泛存在于食物中，尤其是富含蛋白质的食物。

为了保证食品质量和消费者的健康，国家制定了羟脯氨酸含量的标准。

2.1 国标的制定羟脯氨酸含量国标是由相关的食品安全和标准化机构制定的。

制定国标的过程包括以下几个步骤： - 收集和分析相关的科学研究成果，了解羟脯氨酸在食品中的含量分布情况； - 根据营养需求和人体对羟脯氨酸的摄入量建立相应的指标； - 结合国内外相关标准，制定适用于国内食品的羟脯氨酸含量国标； - 定期进行检测和修订，以适应食品市场的发展和消费者需求的变化。

2.2 国标的重要性羟脯氨酸含量国标的制定对于食品行业具有重要的意义： 1. 保护消费者权益：国标可以确保食品中羟脯氨酸的合理含量，避免因过多或过少的摄入对消费者健康造成潜在风险。

2. 维护市场秩序：国标的制定可以规范食品行业的竞争环境，减少虚假宣传和欺诈行为，促进行业的健康发展。

3. 促进科学研究：国标的制定需要依据科学研究成果，推动相关领域的发展和创新，促进食品科学的进步。

三、明胶含量明胶是一种常见的食品添加剂，广泛应用于食品加工和制备过程中。

其含量对于制品的质地和口感具有重要影响。

3.1 明胶的来源明胶主要来源于动物的骨骼、皮肤、软组织等部位。

常见的明胶原料包括猪皮、牛骨、鱼鳞等。

在制备过程中，明胶会经过酸碱水解、脱色、过滤等步骤，得到纯净的明胶。

3.2 明胶的含量确定确定明胶含量的方法包括化学分析和物理测定两种。

化学分析方法主要是通过测定明胶中特定的成分含量来计算明胶的含量。

物理测定方法则是利用光散射、胶凝特性等原理进行测定。

3.3 明胶含量的影响因素明胶含量受多种因素的影响，包括原料的品质、加工工艺的不同等。

HYP 测定法1.原理试样在6M的盐酸溶液中水解,释放出羟脯氨酸。

经氯胺T氧化,生成含有吡咯环的氧化物。

用高氯酸破坏过量的氯胺T。

羟脯氨酸氧化物与对二甲氨基苯甲醛反应生成红色化合物,在波长558nm处进行比色测定。

2.试剂配制(1).醋酸/柠檬酸缓冲液(pH6)醋酸钠57g柠檬酸钠37.5g柠檬酸 5.5g异丙醇385ml 定容至1L称取醋酸钠、柠檬酸钠、柠檬酸，溶解于蒸馏水中，再加入异丙醇，混合均匀，用精密pH计调pH=6.0，定容至1L(2).氯胺T溶液7% 50ml(3).Ehriche 试剂P-二甲胺-笨甲醛100g60%高氯酸150ml称取对二甲氨基苯甲醛，将其溶解于高氯酸中，贮存于棕色瓶中(4). A液：氯胺T 7% 1mlbuffer 4mlB液：Ehriche试剂 6ml异丙醇 26ml3.样品处理以1：5的比例将鱼鳞胶原（浓度约3-4mg/ml）用6M HCl稀释，混合均匀后，用针筒取3ml稀释液于安剖瓶中，将安剖瓶用酒精喷灯封口，在110℃下处理24h左右。

待水解完全后，将水解液全部转移到旋转蒸发瓶中，用旋转蒸发器抽真空蒸馏，水浴温度设为60℃。

蒸发后瓶内固体完全转移到25ml容量瓶中，用缓冲液（pH=6.0）定容，待用。

4.操作步骤取试样液300μl，加入600μl异丙醇，搅拌均匀后加入300μl A液，搅拌均匀静置4min，然后加入4ml B液，搅拌均匀。

在60℃水浴中显色25min，冷却2min，用紫外可见分光光度计在558nm处测吸光度。

5.数据处理分别测定吸光度并按标准曲线方程计算羟脯氨酸质量浓度，乘以稀释倍数和体积后得到样品中的羟脯氨酸含量，最后再乘以胶原与羟脯氨酸之间的换算系数（依据氨基酸分析结果），得到样品中的胶原含量。

6.羟脯氨酸标准曲线。

1羟脯氨酸含量测定2羟脯氨酸标准曲线绘制3试剂的配制【6-7】[6] 李秋营,姚汝琳.细胞中羟脯氨酸的测定.山西医科大学学报.2001,32(6):558-559[7] David J Etherington, Trevor J Sims. Detection and Estimation of Collagen[J]. J Sci Food Agric, 1981,32:539-546柠檬酸缓冲液：柠檬酸钠120g、冰醋酸12mL、柠檬酸46g、氢氧化钠34g 溶解于蒸馏水中，调整pH 值至6.0，然后定容至1000mL。

0.05mol/L 氯胺T 溶液：称取氯胺T 7.05g，溶解于100mL 蒸馏水中，然后加入乙二醇独甲醚150mL，再加入250mL 柠檬酸缓冲液混合均匀。

对二甲基氨基苯甲醛: 试剂 A：取无水乙醇20mL，慢慢加入浓硫酸2.74mL；试剂B：取对二甲基氨基苯甲醛12.0g，慢慢加入无水乙醇40mL，水浴加热使其完全溶解并冷却至室温，然后将A 液慢慢加入B，混合均匀。

3.5mol/L 高氯酸溶液：取27mL 高氯酸，以蒸馏水定容到100mL。

羟脯氨酸标准曲线的绘制羟脯氨酸标准储存液：准确称取L-羟基脯氨酸标准品50mg，加入0.01mol/L 盐酸中溶解，稀释并定容到100mL，在冰箱中保存。

羟脯氨酸标准工作液：吸取羟脯氨酸标准储存液10mL到50mL 容量瓶中，用蒸馏水定容到50mL(临用前配)，浓度为100μg/mL。

4标准曲线绘制分别吸取羟脯氨酸标准工作液1.0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5mL，用蒸馏水定容到50mL容量瓶中。

以蒸馏水为空白，分别吸取上述标准液1mL，加入1mL 柠檬酸缓冲液和1mL 0.05mol/L 氯胺T 溶液，室温(25 ℃) 氧化10min 后，加入高氯酸1mL(3.5mol/L)，放置10min，加入对二甲基氨基苯甲醛试剂1mL，在65℃水浴显色10min，冷却后在560nm处测吸光度。

羟基脯氨酸说明书一、产品概述羟基脯氨酸是一种重要的氨基酸补充剂，能够帮助促进身体的蛋白质合成和细胞再生，提高肌肉恢复和生长能力。

本说明书将详细介绍羟基脯氨酸的成分、用途、剂型、剂量和注意事项，以帮助用户正确使用本产品。

二、产品成分羟基脯氨酸主要成分包括羟基脯氨酸粉末、辅料（如胶囊、溶剂等），其中羟基脯氨酸粉末含量符合产品标签上所示。

三、产品用途羟基脯氨酸是一种重要的营养补充品，适用于以下情况：1. 体育锻炼者：可促进肌肉恢复，提高训练效果；2. 肌肉疲劳者：可缓解肌肉酸痛和疲劳感；3. 需要增加蛋白质摄入量的人群：可帮助补充蛋白质，促进身体健康；4. 需要维持肌肉质量的老年人：可减少肌肉流失，提高肌肉功能。

四、产品剂型及规格羟基脯氨酸目前主要有片剂、胶囊和粉剂等剂型。

不同剂型的羟基脯氨酸含量、包装规格和用法用量各有差异，请用户按照产品标签和说明书上的指导服用。

五、产品剂量羟基脯氨酸的剂量应根据个人情况而定，建议在医师或专业营养师的指导下使用。

一般情况下，推荐的剂量为每天1-3次，每次剂量为500-2000毫克。

具体剂量应根据个体身体状况、饮食习惯和运动强度等因素进行调整。

六、产品禁忌1. 对羟基脯氨酸过敏者禁用本产品；2. 未满18周岁的儿童禁用本产品；3. 孕妇、哺乳期妇女和正在怀孕计划的女性慎用；4. 有严重肾脏疾病的患者慎用或遵医嘱使用。

七、产品储存1. 请将羟基脯氨酸产品放置于阴凉干燥处，避免阳光直射；2. 请保持原包装完好，避免受潮；3. 请将产品放置于儿童难以触及的地方。

八、产品注意事项1. 请严格按照产品标签和说明书上的剂量和使用方法使用本产品；2. 请咨询专业医生或营养师的指导以了解个人适宜的剂量和使用频率；3. 本产品不能替代正常饮食，不可过量使用或长期使用；4. 使用过程中如有不适，请及时停用并就医；5. 请勿将本产品与其他保健品或药物混合使用，以免产生不良反应。

九、产品效果及副作用羟基脯氨酸作为氨基酸补充剂，能够帮助促进身体的蛋白质合成，提高肌肉恢复和生长能力，但效果因个人差异而异。

人5羟色胺（5-HT）酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明书本试剂盒仅供体外研究使用、不用于临床诊断!预期应用ELISA法定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体中催乳素含量。

实验原理用纯化的催乳素抗体包被微孔板，制成固相载体，往微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的催乳素抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物（TMB）显色。

TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的催乳素呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（值），计算样品浓度。

试剂盒组成及试剂配制1、酶标板：一块（96孔）2、标准品（冻干品）：2瓶，请临用前15分钟内配制。

每瓶以样品稀释液稀释至1ml，盖好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为6,000pg/ml，然后做系列倍比稀释（注：不要直接在板中进行倍比稀释），分别配制成6,000pg/ml，3,000pg/ml，1,500pg/ml，750pg/ml，375pg/ml，187.5pg/ml，93.75pg/ml，样品稀释液直接作为空白孔0pg/ml。

如配制3,000pg/ml标准品：取0.5ml （不要少于0.5ml）6,000pg/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。

3、样品稀释液：1×20ml。

4、检测稀释液A：1×10ml。

5、检测稀释液B：1×10ml。

6、检测溶液A：1×120/瓶（1:100）。

临用前以检测稀释液A1:100稀释（如：10检测溶液A/990检测稀释液A），充分混匀，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（100/孔），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。

7、检测溶液B：1×120/瓶（1:100）。

临用前以检测稀释液B1:100稀释。

稀释方法同检测溶液A。

8、底物溶液：1×10ml/瓶。

一种新型优化的肝组织羟脯氨酸含量测定方法的建立修贺明郭争荣徐铮【摘要】目的：建立一种可信度、敏感度高，适合于微量组织羟脯氨酸含量的测定方法―胃酶酸解法。

方法：在组织、重量、氧化时间、显色温度、样品中盐浓度及对二氨基苯甲醛（PDAB）一定的条件下，对胃酶法和传统盐酸水解法进行了比较。

结果：在相同条件下，传统方法测得HYP含量为0.045ug/ml－1.547ug/ml，平均0.7789ug/ml；胃酶酸解法测得羟脯氨酸含量为2.955ug/ml－4.500ug/ml，平均为3.921ug/ml，两者比较有显著性差异（P＜0.01）。

结论：胃酶酸解法的可信度、敏感度均优于传统方法，其更适合于微量组织羟脯氨酸的测定。

关键词：羟脯氨酸胃酶酸解法【abstract】objective：羟脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）是一种非必需氨基酸，是机体胶原蛋白的主要成份之一，几乎所有的HYP都存在于胶原中，被认为是胶原中的特征性氨基酸。

因此，HYP含量的测定已成为衡量机体胶原含量的一个重要指标，寻求一种合理、优化的HYP含量的测定方法已成为众多学者关注的焦点。

目前，人们对传统的HYP含量的测定方法－盐酸水解法已达成了共识，但是传统方法对组织要求量比较大，水解不够彻底等缺点限制了其广泛应用。

近年来大批的学者对HYP的测定条件进行了多方面、多层次、多途径的研究，同时也深入的探讨了不同测定方法，虽然在时间、试剂用量、所需器材等方面有了很大的改进，但对其测定方法的研究欠少，仍未能找到一种方便、快捷、可靠性高的测定方法。

笔者对HYP含量测定方法进行了仔细的研究，针对传统方法的缺点对传统方法进行了改进，在组织、重量、氧化时间、显色温度、样品中盐浓度及对二氨基苯甲醛（PDAB）一定的条件下，对两种方法进行了比较，探索出一条更为先进、更为稳定可靠的HYP 检测方法。

现报道如下：一，材料及其方法1，主要实验材料1.1 羟脯氨酸标准品北京鼎国生物技术发展中心1.2 酶标仪美国VERSAmax1.3 微量电子天平瑞士METTLer AE2601.4 对二氨基苯甲醛天津市博迪化工有限公司1.5 氯胺－T 天津市精细化工研究所2，试剂配制2.1 标准HYP储存液（1mg/ml）：称取100mgHYP标准品，用0.1mol/l盐酸溶解并定容至100ml，置棕色瓶于4℃保存。

羟脯氨酸测定原理羟脯氨酸（Hydroxyproline）是一种非常重要的氨基酸，在胶原蛋白中占有重要地位。

羟脯氨酸的含量可以作为评估胶原蛋白合成和降解的指标，因此，羟脯氨酸的测定具有重要的临床意义。

本文将介绍羟脯氨酸测定的原理及其应用。

羟脯氨酸的测定原理主要基于其与酚类物质反应生成紫色化合物的特性。

一般情况下，羟脯氨酸的测定方法主要有两种：色素法和高效液相色谱法。

色素法是羟脯氨酸测定的常用方法之一。

其原理是在碱性条件下，羟脯氨酸与酚类试剂发生缩合反应，生成有色产物。

这种反应是一种氧化还原反应，需要存在氧化剂的存在，常用的氧化剂有次氯酸钠和过氧化氢。

在碱性条件下，羟脯氨酸与酚类试剂发生缩合反应，生成的产物可以通过分光光度计测定其吸光度，从而计算出羟脯氨酸的含量。

高效液相色谱法是羟脯氨酸测定的另一种常用方法。

该方法利用高效液相色谱仪对样品进行分析。

在该方法中，首先将样品中的羟脯氨酸与特定的试剂进行反应，生成具有荧光的产物。

然后，将反应产物注入高效液相色谱仪中进行分离和检测。

通过测定峰面积或峰高的方式，可以计算出羟脯氨酸的含量。

羟脯氨酸的测定方法在临床和科研领域有着广泛的应用。

在临床上，羟脯氨酸的测定可以用于评估胶原蛋白合成的情况，对于一些与胶原蛋白代谢相关的疾病的诊断和治疗具有重要意义。

此外，羟脯氨酸的测定方法还可以用于评估食物中胶原蛋白的含量，对于食品安全和质量控制也有一定的应用价值。

在科研领域，羟脯氨酸的测定方法可以用于胶原蛋白的合成和降解研究。

通过测定羟脯氨酸的含量，可以评估胶原蛋白的合成速率和降解速率，进而研究胶原蛋白的代谢机制。

此外，羟脯氨酸的测定方法还可以用于评估某些药物对胶原蛋白合成和降解的影响，为新药的研发提供参考依据。

总结起来，羟脯氨酸是一种重要的氨基酸，在胶原蛋白代谢中起着关键作用。

羟脯氨酸的测定可以通过色素法和高效液相色谱法等方法进行。

这些方法不仅在临床上有着重要的应用价值，还在科研领域中发挥着关键作用。

羟脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）试剂盒说明书微量法100T/96S注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：HYP是机体胶原蛋白主要成分之一，胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等，因此HYP含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。

测定原理：样品经水解产生游离的HYP，进一步被氯胺T氧化，氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应，产生红色化合物，在560nm处有特征吸收峰。

通过测定样品水解液560nm吸光值，可计算HYP含量。

自备实验用品及仪器：天平、烘箱、玻璃管、离心机、水浴锅、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、无水乙醇、异丙醇、6mol/L盐酸和蒸馏水。

试剂组成和配制：组织提取液：6mol/L盐酸，自备。

浓盐酸：H2O（V/V）= 1:1，室温保存。

细胞提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体6mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂二：液体6mL×1瓶，4℃避光保存。

羟脯氨酸提取：1. 组织：称取约0.2g样品于玻璃管，加入2mL的组织提取液，置于110℃烘箱，水解6至12小时，用提取液定容至2mL，12000g，25℃，离心20min，取上清待测。

2. 细胞：取约500万个细胞，加入1mL的细胞提取液，于高压消毒器中15磅保持30min，自然降压后待测。

3. 血清游离羟脯氨酸提取：取0.1mL血清，加入0.5mL无水乙醇使蛋白质沉淀，8000g4℃离心5min。

将上清倒入另一个EP管，氮吹或沸水浴将乙醇挥发干。

冷却后再加入0.2mL50%异丙醇，充分溶解混匀待测。

测定操作表：1、分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长至560nm，蒸馏水调零。

2、操作表对照管测定管样本（µL）60试剂一（µL）60 60混匀，室温静置20min试剂二（µL）60 60H2O（µL）180 120混匀，60℃，20min，取出后25℃静置15 min，取200µL于微量石英比色皿/96孔板中检测560nm处吸光值。

乳与乳制品中动物水解蛋白鉴定乳与乳制品中动物水解蛋白鉴定法—L(-)-羟脯氨酸含量测定羟脯氨酸含量测定法1主题内容与适用范围本方法规定了乳与乳制品制品中L(-)-羟脯氨酸含量的测定方法。

本方法适用于乳与乳制品中L(-)-羟脯氨酸含量的测定。

本方法通过对L(-)-羟脯氨酸含量的测定，可判定是否为动物水解蛋白。

2 引用标准) --羟脯氨酸含量测定L(--)GB9695.23-90 肉与肉制品L(3 原理试样经酸水解,释放出羟脯氨酸。

经氯胺T氧化,生成含有吡咯环的氧化物。

用高氯酸破坏过量的氯胺T。

羟脯氨酸氧化物与对二甲氨基苯甲醛反应生成红色化合物,在波长558nm处进行比色测定。

4 试剂所用试剂均为分析纯,水为蒸馏水或同等纯度的水。

4.1 氯化亚锡(GB638):0.75％溶液。

将氯化亚锡7.5g溶于500mL水中,再加入500ml浓盐酸(GB 622)。

4.2 盐酸(GB622):6mol/L溶液。

4.3 氢氧化钠(GB629);1mol/L、10mol/L溶液。

4.4 缓冲液:将50g柠檬酸,26.3g氢氧化钠和146.1g结晶乙酸钠(GB694)溶于水,稀至1L,此溶液与200mL水和300mL正丙醇混合。

4.5 氯胺T(HG3-972)溶液:将1.41g氯胺T,溶于10mL水中,依次加入10mL正丙醇和80mL缓冲溶液(用时现配)。

4.6 显色剂:称取10g对二甲氨基苯甲醛,用35mL高氯酸(GB623)溶解,缓慢加入65mL异丙醇。

4.7 L(-)-羟脯氨酸(C5H9NO3)标准溶液。

4.7.1 标准储备液500μg/mL:称取50.0mg/L(-)-羟脯氨酸用少量水溶解,加一滴6mol/L盐酸,定容至100mL容量瓶中。

4.7.2 标准工作液5μg/mL:吸取标准储备液5.00mL于500mL容量瓶中,定容。

5 仪器和设备5.1 实验室常规设备。

5.2 配有冷凝管的三角瓶:250mL。

5.3 恒温水浴。

羟脯氨酸（HYP）检测
羟脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）是亚氨基酸之一，是一种非必需氨基酸，是胶原组织的主要成分之一，且为胶原中特有的氨基酸。

利用羟脯氨酸在胶原蛋
白中含量最高这一特点，通过血液和尿液对羟脯氨酸的测定，可了解体内胶原
蛋白分解代谢情况，即可作为结缔组织分解情况指标。

此外，测定羟脯氨酸也
是了解骨吸收、骨代谢情况的指标。

迪信泰检测平台采用高效液相色谱(HPLC)和液质联用(LC-MS)法，可高效、精准的检测羟脯氨酸的含量变化。

此外，我们还提供其他氨基酸及其代谢物检测服务，以满足您的不同需求。

HPLC和LC-MS测定羟脯氨酸样本要求：
1. 请确保样本量大于0.2g或者0.2mL。

周期：2~3周
项目结束后迪信泰检测平台将会提供详细中英文双语技术报告，报
告包括：
1. 实验步骤（中英文）
2. 相关质谱参数（中英文）
3. 质谱图片
4. 原始数据
5. 羟脯氨酸含量信息
迪信泰检测平台可根据需求定制其他物质测定方案，具体可免费咨询技术支持。

LC-MS氨基酸测定项目样本报告，点击查看>。