脯氨酸(PRO)检测试剂盒(茚三酮比色法)

测定脯氨酸药品配制及操作一、药品二、试验用具电子天平、烧杯、蒸馏水、容量瓶（250ml）1个、50ml容量瓶6个、试管6支（制作标曲应用）、水浴锅、试管若干、药品、标签、研钵、称量纸、注射器。

三、溶液配制酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol/L的磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解贮于冰箱中。

6mol/L磷酸：浓度为85%的磷酸大约是14mol/l，如果要配置6M的磷酸大约稀释到原来体积的2.3倍即可。

3%的磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。

冰醋酸甲苯四、试验步骤1、标准曲线的制作(1)在分析天平上精确称取25 mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250 ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每毫升含脯氨酸100 μg。

(2)系列脯氨酸浓度的配制取6个50 ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5及3.0 ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5及6 μg·ml-1。

(3)取6支试管，分别吸取2 ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2 ml冰醋酸和3 ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30 min。

表2-5脯氨酸标准曲线表试剂 1 2 3 4 5 6系列Pro 溶液(mL) 2 2 2 2 2 2冰醋酸 2 2 2 2 2 2酸性印三酮溶液 2 2 2 2 2 2Pro 含量 2 4 6 8 10 12(4)冷却后各试管准确加入5 ml甲苯，振荡30 s，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。

(5)用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520 nm波长处进行比色。

(6)标准曲线的绘制：先求出吸光度值(Y)依脯氨酸浓度(X)而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2 ml测定液中脯氨酸的含量(μg·2 ml-1)。

茚三酮比色法测定游离氨基酸含量原理：茚三酮与氨基酸的反应分两步进行，首先是氨基酸被氧化，产生二氧化碳､氨和醛，而水合茚三酮被还原成还原性茚三酮；第二步是所生成的还原性茚三酮与另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成成为蓝紫色化合物，该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比｡磷酸缓冲液（pH.8.04）：称磷酸二氢钾4.5350 g，定容500 ml。

称NAH2PO4·12H2O11.9380 g分别溶解定容500 ml。

取磷酸二氢钾10 ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液2％茚三酮溶液：称取水合茚三酮 2 g，加水溶解后定容至 100 mL。

储成于棕色瓶中，避光保存。

0.25%抗坏血酸溶液：称取抗坏血酸 0.1 g，加水溶解后定容至 100 mL，现配现用，或者密封，冻存于-20 o C。

茚三酮反应液：取50 ml 2% 茚三酮，加入5 ml 0.25%的Vc，使用蒸馏水稀释到100 ml，密封储存在棕色瓶中。

亮氨酸标准液:称取 100 mg 亮氨酸（纯度不低于 99%）溶于 100 mL 水中，作为母液，此时亮氨酸的浓度为1 mg/mL。

茚三酮标准曲线制作溶液中氨基酸的浓度如果低于20 μg/ml，茚三酮显色反应将不能发生，故先配制不同浓度的氨基酸标准液，取十支试管，标号为1，2，3……10，按照下表配制1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1000 μg/ml亮氨酸超纯水 ml 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9 8.9 8.8 8.7 8.6 8.5 亮氨酸 终浓度μg/ml 405060708090100110120130140150使用螺旋盖（内垫）试管分别取上述浓度的氨基酸标准液1ml，空白对照使用1ml 超纯水替代氨基酸标准液，然后向各个试管中加入0.5 ml 的茚三酮反应液和0.5 ml 的磷酸缓冲液，盖好盖子悬紧，置于沸水浴中煮沸15 min，分别加入3 ml 的超纯水，斡旋混匀，测定吸光度，绘制标准曲线取一支中等程度显色的试管进行紫外和可见波段的全波长扫描，结果如下图所示3004005006007008000.00.10.20.30.40.50.60.7吸光度波长（nm ）403 nm565 nm选择565 nm 作为其最大吸收波长，测定各管的吸光度，弃去吸光度大于1的值 茚三酮终浓度（μg/mL） 565 nm 的吸光度 20 0.037 25 0.114 30 0.226 35 0.347 40 0.412 45 0.538 500.62155 0.692 60 0.754 65 0.834 700.968使用origin 8.5 绘制散点图并进行线性拟合，结果如下图所示0.00.20.40.60.81.0O D 565氨基酸浓度（μg/mL ）注意事项：1. 茚三酮比色受测定环境中的pH 影响很大，故每次测定前需要将样品溶液的pH 值调整到中性（pH7左右），2. 茚三酮不光可以与氨基酸反应，与蛋白质同样可以反应，因此需要在测定前去除溶液中的蛋白质，因此正确做法是：向样品溶液中加入等体积等0.6 mol/L 三氯乙酸，斡旋震荡，静置10 min 后，3000 rpm 离心10 min，取上清调整pH 值至中性pH7左右，再进行测定，3. 稀释倍数的确定：因为标准曲线的测定范围为20-70 μg/mL，即20-70 mg/L，所以在不清楚你所要检测样品中氨基酸的浓度时，最好取部分样品稀释10倍和100倍，分别检测原液、十倍稀释液和100倍稀释液的OD565，发现哪个水平下OD565落在标准曲线的范围内，从而判断需要对样品稀释多少倍4. 标准曲线测定时最好选择密封性较好的试管（螺旋盖硅胶内垫），同时需要检查气密性，防止水浴蒸发导致计量误差或者使用10 mL 具塞比色管，以方便在水浴之后可以准确补水。

目的意义植物在正常条件下游离脯氨酸（proline，Pro）含量很低，但在干旱、高温、低温、盐碱、水涝等逆境条件下便会大量积累，并且积累指数与植物的抗逆性呈正相关关系。

因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标，测定其含量也成为抗性生理研究的重要内容之一。

本实验的目的是掌握游离脯氨酸含量的测定方法、原理及操作技术。

一、酸性茚三酮法（一）原理植物体内的氨基酸只有脯氨酸能与酸性茚三酮发生反应，生成稳定的红色产物。

该产物在515nm有一最大吸收高峰，其吸收值与脯氨酸的含量呈直线关系。

因此，样品中的脯氨酸含量可用酸性茚三酮法测定。

除脯氨酸外，酸性和中性氨基酸不能与酸性茚三酮形成红色产物，碱性氨基酸对这一反应只有轻度干扰，在同类样品的测定中可忽略不计，在不同样品的测定中可加入人造沸石排除这种干扰。

（二）实验材料、仪器与试剂1. 实验材料：正常生长与经逆境处理的植物茎、叶、穗等器官或组织。

2. 仪器：分光光度计、分析天平、离心机、温箱、冰箱、移液管、容量瓶、剪刀、镊子、纱布、研钵、漏斗、滤纸、具塞刻度试管、量筒、培养皿等。

3. 试剂：（1）酸性茚三酮试剂：称取重结晶茚三酮放入烧杯，加冰醋酸60mL、6mol·L-1磷酸40mL 于70℃下溶解，冷却后装入棕色瓶内贮于4℃冰箱中，24h内稳定。

现用现配。

（2）100μg·mL-1脯氨酸母液：精确称取脯氨酸溶于少量80％乙醇中，用蒸馏水定容至100mL。

（3）其他试剂：人造沸石、活性炭粉、冰醋酸、80％乙醇。

（三）操作步骤1. 标准曲线制作：（1）取7个50mL容量瓶，分别放入脯氨酸母液、、、、、、，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为、、、、、、μg·mL-1。

（2）另取具塞刻度试管8只（0～7号），0号加入2mL蒸馏水，1～7号分别加入不同浓度的标准系列各2mL，再分别加入冰醋酸2mL和茚三酮试剂2mL，充分摇匀，加盖，沸水浴10～15min。

逆境胁迫下植物体脯氨酸含量测定【实验目的】1.了解脯氨酸在植物抗逆性决定中的作用。

2.掌握脯氨酸提取和测定的方法。

【实验原理】1.逆境条件下（干旱、盐碱、热、冷害、冻害）,植物体内脯氨酸含量会显著增加，并且积累指数与植物的抗逆性有关，因此脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。

2.测定脯氨酸含量目前一般使用的方法是茚三酮法。

酸性条件下,茚三酮和脯氨酸反应生成稳定的红色化合物,产物在520nm 波长下具有最大吸收峰。

用磺基水杨酸提取植物样品时,脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中,然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色,再用甲苯萃取，则色素全部转移至甲苯中,颜色的深浅即表示脯氨酸含量的高低。

【实验材料】1.材料：小麦幼苗：（1）对照（2）100mM、200mM NaCl处理48h（3）5%、15% PEG-6000处理48h2.试剂：3%磺基水杨酸；冰醋酸；甲苯；2.5% 酸性茚三酮溶液；脯氨酸母液50 μg/ml3.器材：天平，烧杯，分光光度计，研钵，容量瓶，具塞试管，移液管，胶头滴管，水浴锅【实验内容】1.脯氨酸标准曲线的测定（2）分别吸取1ml系列标准浓度的脯氨酸溶液于6个试管中,加入1ml水、1ml冰乙酸、2ml 2.5％的酸性茚三酮,于沸水浴中加热30min。

（3）冷却后准确加入4ml甲苯,振荡30S,静置片刻,使色素全部转至甲苯溶液。

（4）轻轻吸取各管上层甲苯溶液至比色杯中,以甲苯为空白对照,于520nm进行比色。

2.样品的测定（1）称取不同处理的小麦叶片各0.5 g，于2.5 ml 3%磺基水杨酸试管中，沸水浴中提取10 min。

（2）吸取1ml上清于另一试管中，加入1 ml水、1 ml冰乙酸、2 ml 2.5％的酸性茚三酮，混合液于沸水中显色30 min。

（3）冷却后加入4 ml甲苯，摇荡30S，萃取完全后用吸管轻轻吸取上层红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在520nm比色。

【实验结果】查标准曲线，得脯氨酸含量c（µg）脯氨酸含量（µg.g-1）＝c ×(v／a )／w其中V为提取液总体积ml; a为测定液体积ml；W为样品质量g。

脯氨酸的检测方法Coca-cola standardization office【ZZ5AB-ZZSYT-ZZ2C-ZZ682T-ZZT18】脯氨酸的检测方法1. 原理样品用茚三酮处理，样品中的脯氨酸反应生成橙色物质，在520nm检测吸光度，并作空白对照实验。

2. 应用范围本方法适用于蜂蜜、果汁和浓缩汁中的脯氨酸的检测。

本方法在其它方面的应用必须经过个别论证。

3. 试剂及仪器脯氨酸3%茚三酮2-甲氧基乙醇溶液（茚三酮溶解于10ml 2-甲氧基乙醇，每天保持新鲜，即现用现配）2-甲氧基乙醇蚁酸(96%)，即甲酸异丙醇（2-丙醇）水溶液：水：丙醇= 1：115ml旋盖玻璃离心管（确保离心管的边缘没有缺口，将有缺口的离心管丢掉）分光光度计，检测吸光度设定在520nm下1cm 玻璃比色皿4. 样品准备苹果，梨和大部分浆果的果汁用单一浓度（即原果汁浓度），橙汁用1：20的水进行稀释。

其它的果汁应进行适当的稀释，以保证稀释后的样品中的脯氨酸的含量低于50mg/L(见稀释表)。

浓缩果汁用水稀释到单一浓度，然后再进一步进行适当的稀释。

蜂蜜的稀释，采用蜂蜜加50ml水。

将样品在分析之前离心5min左右，去除悬浮物，取上清液进行分析。

原果汁稀释表样品类型稀释比例颜色空白期望值Apple 苹果1:1yes Apricot 杏21:1yes Aronia 野樱莓1:1yes Banana 香蕉1:1yes Blackberry 黑莓1:1yes Cherry 樱桃1:1yes Cranberry 蔓越莓1:1yes Grape 葡萄16:1yes Grapefruit 柚子21:1no Guava 番石榴3:1yesKiwi 泥猴桃1:1yesLemon 柠檬21:1noLime 酸橙21:1noMandarin 中国柑桔21:1noMango 芒果1:1yesNectarine 油桃21:1noOrange 柑桔21:1noPapaya 番木瓜1:1yesPassion Fruit 西番莲1:1yesPeach 桃6:1yesPineapple 菠萝1:1yesPlum 李子7:1yesPrune 西梅16:1yes5:1yesRaspberry 悬钩子（树梅）Strawberry 草莓1:1yesTangerine 橘子21:1noTomato 番茄1:1yes5. 标准溶液的制备脯氨酸贮备液（500mg/L）：脯氨酸加水定容至100ml。

脯氨酸(PRO)检测试剂盒(茚三酮比色法)简介：脯氨酸(Proline，Pro)是一种环状的α-亚氨基酸，呈中性，等电点为6.30，水中溶解度比任何氨基酸都大，水中可溶162g左右，易潮解不易得结晶，有甜味。

与茚三酮溶液共热，生成黄色化合物，一旦进入肽链后，可发生羟基化作用，从而形4-羟脯氨酸，是组成动物胶原蛋白的重要成分。

羟脯氨酸也存在于多种植物蛋白质中，尤其与细胞壁的形成有关，在正常情况下脯氨酸含量较低，但在逆境下(旱、热、冷、冻、盐碱等)，常有脯氨酸的明显积累，即积累指数与植物的抗逆性有关。

在临床、生物材料、工业等方面均有广泛应用。

Leagene脯氨酸(PRO)检测试剂盒(茚三酮比色法)检测原理是脯氨酸游离于磺基水杨酸溶液中，前者与茚三酮共热发生反应，能产生稳定的红色产物，以分光光度计测定处吸光度，在一定范围内颜色深浅(即吸光度)与脯氨酸浓度成正比。

该试剂盒主要用于测定植物组织中的游离脯氨酸含量。

该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

组成：自备材料：1、蒸馏水2、研钵或匀浆器3、离心管或试管4、滤纸或纱布5、水浴锅6、比色杯7、分光光度计操作步骤(仅供参考)：编号名称TO111350TStorage试剂(A): 脯氨酸标准(100μg/ml) 1ml 4℃试剂(B): PRO Lysis buffer 250ml RT试剂(C): PRO Assay buffer80ml RT试剂(D): 茚三酮2支RT 避光使用说明书1份1、准备样品：①植物样品：取新鲜植物组织，清洗干净，擦干，切碎，迅速称取，加入PRO Lysis buffer 后匀浆或研磨，沸水浴(期间经常摇动)，混匀，用滤纸或纱布过滤，滤液即为脯氨酸提取液，4℃保存备用。

②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，冻存，用于脯氨酸的检测。

③细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如有必要用PRO Lysis buffer进行适当匀浆，留取上清即脯氨酸提取液，4℃保存备用，用于脯氨酸的检测。

目的意义植物在正常条件下游离脯氨酸（proline，Pro）含量很低，但在干旱、高温、低温、盐碱、水涝等逆境条件下便会大量积累，并且积累指数与植物的抗逆性呈正相关关系。

因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标，测定其含量也成为抗性生理研究的重要内容之一。

本实验的目的是掌握游离脯氨酸含量的测定方法、原理及操作技术。

一、酸性茚三酮法（一）原理植物体内的氨基酸只有脯氨酸能与酸性茚三酮发生反应，生成稳定的红色产物。

该产物在515nm 有一最大吸收高峰，其吸收值与脯氨酸的含量呈直线关系。

因此，样品中的脯氨酸含量可用酸性茚三酮法测定。

除脯氨酸外，酸性和中性氨基酸不能与酸性茚三酮形成红色产物，碱性氨基酸对这一反应只有轻度干扰，在同类样品的测定中可忽略不计，在不同样品的测定中可加入人造沸石排除这种干扰。

（二）实验材料、仪器与试剂1. 实验材料：正常生长与经逆境处理的植物茎、叶、穗等器官或组织。

2. 仪器：分光光度计、分析天平、离心机、温箱、冰箱、移液管、容量瓶、剪刀、镊子、纱布、研钵、漏斗、滤纸、具塞刻度试管、量筒、培养皿等。

3. 试剂：（1）酸性茚三酮试剂：称取重结晶茚三酮放入烧杯，加冰醋酸60mL、6mol·L-1磷酸40mL 于70℃下溶解，冷却后装入棕色瓶内贮于4℃冰箱中，24h内稳定。

现用现配。

（2）100μg·mL-1脯氨酸母液：精确称取脯氨酸溶于少量80％乙醇中，用蒸馏水定容至100mL。

（3）其他试剂：人造沸石、活性炭粉、冰醋酸、80％乙醇。

（三）操作步骤1. 标准曲线制作：（1）取7个50mL容量瓶，分别放入脯氨酸母液、、、、、、，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为、、、、、、μg·mL-1。

（2）另取具塞刻度试管8只（0～7号），0号加入2mL蒸馏水，1～7号分别加入不同浓度的标准系列各2mL，再分别加入冰醋酸2mL和茚三酮试剂2mL，充分摇匀，加盖，沸水浴10～15min。

测定脯氨酸药品配制及操作The document was finally revised on 2021测定脯氨酸药品配制及操作一、药品二、试验用具电子天平、烧杯、蒸馏水、容量瓶（250ml）1个、50ml容量瓶6个、试管6支（制作标曲应用）、水浴锅、试管若干、药品、标签、研钵、称量纸、注射器。

三、溶液配制酸性茚三酮溶液：将茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol/L的磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解贮于冰箱中。

6mol/L磷酸：浓度为85%的磷酸大约是14mol/l，如果要配置6M的磷酸大约稀释到原来体积的倍即可。

3%的磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。

冰醋酸甲苯四、试验步骤1、标准曲线的制作(1)在分析天平上精确称取25 mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250 ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每毫升含脯氨酸100 μg。

(2)系列脯氨酸浓度的配制取6个50 ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液，，，，及 ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5及6 μg·ml-1。

(3)取6支试管，分别吸取2 ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2 ml冰醋酸和3 ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30 min。

表2-5脯氨酸标准曲线表试剂 1 2 3 4 5 6系列 Pro 溶液(mL) 2 2 2 2 2 2冰醋酸 2 2 2 2 2 2酸性印三酮溶液 2 2 2 2 2 2Pro 含量 2 4 6 8 10 12(4)冷却后各试管准确加入5 ml 甲苯，振荡30 s ，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。

(5)用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520 nm 波长处进行比色。

(6)标准曲线的绘制：先求出吸光度值(Y)依脯氨酸浓度(X)而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2 ml 测定液中脯氨酸的含量(μg·2 ml -1)。

PROLINEPrincipleThe prepared sample is treated with ninhydrin. Proline in the sample reacts to form an orange derivative. Absorbance is measured at 520 nm versus appropriate reagent blank.ApplicabilityThis method is applicable to the determination of proline in honey, fruit juices and concentrates. Other applications of this method must be individually validated.Reagents and EquipmentProline 脯氨酸3% ninhydrin in 2-methoxy ethanol (0.3 g of ninhydrin dissolved in 10 mL 2-methoxyethanol is satisfactory; make up fresh daily)3%的茚三酮在2-甲氧基乙醇（0.3 g茚三酮溶解在10 mL 2-甲氧基乙醇；每天补充新的）2-methoxy ethanol 2-甲氧基乙醇formic acid (96%) 蚁酸(96%)（甲酸）aqueous isopropanol (2- Propanol ) - diluted 1+1 水：异丙醇 1：115 mL screw cap glass centrifuge tubes (be sure that there are no chips on the rim of the tube; dispose of chipped tubes) 15 mL的带螺帽的玻璃离心管（确定管子的边没有破损；除掉有破损的瓶子）spectrophotometer set to measure absorbance at 520 nm 520 nm测定吸光度1 cm glass cuvettes 1 cm 的玻璃小管Sample PreparationApple, pear and most berry juices are run single strength.苹果，梨和多数浆果类的汁液是直接做。

脯氨酸含量的测定——水分胁迫下植物的渗透调节【实验目的】1.了解植物对环境胁迫的抗性生理作用，及植物对胁迫的影响机制；2.了解脯氨酸对植物水分胁迫下的抗性生理。

【实验原理】在逆境条件下（旱、盐碱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸（proline，Pro）的含量显著增加。

植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。

因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。

另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。

在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。

在酸性条件下，茚三酮和脯氨酸反应生成稳定的红色化合物，产物在520nm 波长下具有最大吸收峰。

用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。

【材料、仪器及试剂】1.实验材料：小麦幼苗：对照；100mM、200mM NaCl处理48h；5%、15% PEG-6000处理48h2.仪器：天平，烧杯，分光光度计，研钵，容量瓶，具塞试管，移液管，胶头滴管，水浴锅3.主要试剂：3%磺基水杨酸、冰醋酸、甲苯（使用完勿弃入下水道，请回收）、2.5% 酸性茚三酮溶液（60 ml冰醋酸、16.4 ml磷酸加蒸馏水定容至100 ml，再加入2.5 g茚三酮，溶解后避光保存）、脯氨酸标准母液：精确称取25 mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入500 ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中脯氨酸浓度50 μg /ml。

【实验步骤】（一）、样品的测定1.脯氨酸的提取：准确称取不同处理的待测植物叶片各0.2g（每种处理至少做三个平行），用3%磺基水杨酸研磨提取，分别转移至试管中，然后向各试管分别加入5ml 3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min，（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液用3%磺基水杨酸定容至5mL，即为脯氨酸的提取液（预先湿润滤纸，尽量全部收集Pro提取液）。

植物体内游离脯氨酸含量的测定(共3页)-本页仅作为预览文档封面，使用时请删除本页-目的意义植物在正常条件下游离脯氨酸（proline，Pro）含量很低，但在干旱、高温、低温、盐碱、水涝等逆境条件下便会大量积累，并且积累指数与植物的抗逆性呈正相关关系。

因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标，测定其含量也成为抗性生理研究的重要内容之一。

本实验的目的是掌握游离脯氨酸含量的测定方法、原理及操作技术。

一、酸性茚三酮法（一）原理植物体内的氨基酸只有脯氨酸能与酸性茚三酮发生反应，生成稳定的红色产物。

该产物在515nm有一最大吸收高峰，其吸收值与脯氨酸的含量呈直线关系。

因此，样品中的脯氨酸含量可用酸性茚三酮法测定。

除脯氨酸外，酸性和中性氨基酸不能与酸性茚三酮形成红色产物，碱性氨基酸对这一反应只有轻度干扰，在同类样品的测定中可忽略不计，在不同样品的测定中可加入人造沸石排除这种干扰。

（二）实验材料、仪器与试剂1. 实验材料：正常生长与经逆境处理的植物茎、叶、穗等器官或组织。

2. 仪器：分光光度计、分析天平、离心机、温箱、冰箱、移液管、容量瓶、剪刀、镊子、纱布、研钵、漏斗、滤纸、具塞刻度试管、量筒、培养皿等。

3. 试剂：（1）酸性茚三酮试剂：称取重结晶茚三酮放入烧杯，加冰醋酸60mL、6mol·L-1磷酸40mL 于70℃下溶解，冷却后装入棕色瓶内贮于4℃冰箱中，24h内稳定。

现用现配。

（2）100μg·mL-1脯氨酸母液：精确称取脯氨酸溶于少量80％乙醇中，用蒸馏水定容至100mL。

（3）其他试剂：人造沸石、活性炭粉、冰醋酸、80％乙醇。

（三）操作步骤1. 标准曲线制作：（1）取7个50mL容量瓶，分别放入脯氨酸母液、、、、、、，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为、、、、、、μg·mL-1。

（2）另取具塞刻度试管8只（0～7号），0号加入2mL蒸馏水，1～7号分别加入不同浓度的标准系列各2mL，再分别加入冰醋酸2mL和茚三酮试剂2mL，充分摇匀，加盖，沸水浴10～15min。

脯氨酸含量的测定方法
脯氨酸是一种氨基酸，在生物体中具有重要的功能和作用。

以下是常见的脯氨酸含量测定方法之一：
1. 高效液相色谱法（HPLC）：HPLC 是目前最常用的脯氨酸测定方法之一。

该方法是利用色谱柱将样品中的脯氨酸与其他化合物分离，并通过比较峰面积或峰高来定量分析脯氨酸。

2. 气相色谱法（GC）：GC 方法需要将样品中脯氨酸进行衍生化反应，将其转化为易于气相色谱分析的化合物，如三氯化乙酰的脯氨酸酯。

通过测定峰面积或峰高来定量分析脯氨酸。

3. 毛细管电泳法（CE）：毛细管电泳是基于溶液中离子迁移速率的差异进行分离和测定的方法。

该方法可以通过测定脯氨酸的迁移时间或峰面积来定量分析脯氨酸。

4. 免疫测定法：免疫测定法是利用特异性抗体与脯氨酸结合，通过测定免疫复合物的形成量来定量分析脯氨酸。

常见的方法包括酶联免疫吸附测定法（ELISA）和放射免疫测定法等。

需要注意的是，不同的测定方法具有不同的特点和适用范围，在选择方法时需要根据具体情况进行选择。

同时，还需要注意测定方法的准确性、灵敏度和重复性
等指标。

脯氨酸的测定方法
脯氨酸是一种重要的氨基酸，其测定方法主要有以下几种：
1. 高效液相色谱法（HPLC）：这是一种常用的测定脯氨酸浓度的方法。

首先将样品中的脯氨酸与特定的试剂反应生成有色化合物，然后使用高效液相色谱仪进行分离和定量。

这种方法具有灵敏度高、准确度高和分析速度快的优点。

2. 气相色谱法（GC）：该方法需要将脯氨酸进行甲硫酸甲酯化反应，然后使用气相色谱仪分离和定量。

这种方法具有分离能力强、重复性好和灵敏度高的优点。

3. 近红外光谱法（NIR）：该方法利用近红外光谱仪对脯氨酸进行光谱测定，通过建立标准曲线或者使用化学计量学方法进行定量分析。

这种方法具有快速、无损伤和非破坏性的特点。

4. 比色法：比色法是利用脯氨酸与特定试剂发生反应生成有色产物，然后使用分光光度计进行测定。

常用的试剂有二硫代二氨基苯，其生成的紫色产物与脯氨酸的浓度成正比。

这种方法简便易行，但灵敏度较低。

需要注意的是，不同的测定方法适用于不同的样品和实验要求，选择合适的方法需要考虑样品类型、测定要求和实验设备等因素。

植物体内游离脯氨酸含量的测定一、原理磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应，当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸溶液中。

然后用酸性茚三酮加热处理后，茚三酮与脯氨酸反应，生成稳定的红色化合物，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。

在520nm波长下测定吸光度，即可从标准曲线上查出脯氨酸的含量。

二、仪器及试剂1. 仪器：分光光度计；电子分析天平；离心机；10ml+2ml离心管；恒温水浴锅；2 .试剂及配制：冰醋酸；甲苯。

2.5﹪酸性茚三酮溶液配制：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol·L －1磷酸(7ml磷酸+13ml蒸馏水)中，37度摇床摇动溶解，贮于4℃冰箱中。

3％磺基水杨酸配配制：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。

1mg·ml-1脯氨酸标准母液配制三、实验步骤1. 脯氨酸标准曲线的制作1.1 取6支10ml离心管编号，按下表配制每管含量为0～25μg的脯氨酸标准液。

加入表中试剂后，标准曲线样品和待测样品一起置于沸水浴中加热60min （注意管盖需要压住，不然会爆开挥发液体），取出冷却，各试管再加入2ml 甲苯，振荡30秒钟，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。

1.2 以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。

1.3 标准曲线的绘制以1～5号管脯氨酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 样品的测定2.1 脯氨酸的提取液氮研磨样品材料，称取适当重量样品粉末（0.1-0.2g）于2ml离心管, 然后向各管分别加入1.5ml3％的磺基水杨酸溶液，振荡混匀。

（注意：样品一定要精确称量并记录）离心12000g，10min，上清液1ml移至新10ml离心管中。

2.2 测定加入1ml冰醋酸及1ml 2.5﹪酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热60min，溶液即呈红色。

冷却后加入2ml甲苯，摇荡30秒钟，静置片刻，用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。

茚三酮法植物体内游离脯氨酸含量的测定游离脯氨酸在植物体内的积累指数与植物的抗逆性有关。

因此作为衡量植物抗逆性的一项生化指标。

一、【目的】在正常环境条件下，植物体内游离脯氨酸含量较低，但在逆境（干旱、低温、高温、盐渍等）及植物衰老时，植物体内游离脯氨酸含量可增加10~100倍，并且游离脯氨酸积累量与逆境程度、植物的抗逆性有关。

因此，测定植物体内游离脯氨酸的含量，在一定程度上可以判断逆境对植物的危害程度和植物对逆境的抵抗力，可作为植物抗逆性的一项生化指标。

二、【原理】采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减少了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态(干或鲜样)限制。

在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520nm 处有一最大吸收峰。

脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比，可以用分光光度法测定。

（有的用80%酒精）紫色三、【仪器与用具】分光光度计：水浴锅；漏斗；20ml大试管数支；20ml具塞刻度试管9支；5～10ml注射器或滴管。

【试剂】1．3％磺基水杨酸水溶液；甲苯；冰乙酸2．5%酸性茚三酮显色液：称取2.5g茚三酮，加入60ml 冰乙酸和40 ml 2mol／L磷酸(以3∶2混合)，在70度下加热溶解，冷却后贮于棕色瓶中，此液在4℃下2～3d有效。

3．脯氨酸标准溶液：准确称取25Mg脯氨酸，用蒸馏水溶解后定容至250ml，其浓度为100μg／ml。

再取此液10ml，用蒸馏水稀释至100ml，即成10μg／ml的脯氨酸标准液。

再用蒸馏水释释成1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0μg/mL 的系列溶液。

四、【方法与步骤】样品脯氨酸提取：取不同处理(干旱处理与对照)的剪碎混匀小麦叶片各0.3g(干样根据水分含量酌减)，分别置于20ml 具塞试管中，加入5ml 3％硝基水杨酸溶液，管口加盖玻璃塞，于沸水浴中浸提15Min。

茚三酮中文名称：苯并戊三酮，茚三酮英文名称：Ninhydrin分子量：160.13CAS RN：485-47-2熔点：251℃密度: 0.86性状：本试剂近似为白色结晶,或浅黄色结晶粉末,微溶于乙醚及三氯甲烷,100℃以上变为红色。

特性反应：跟酶类或者多肽在加热状况下发生显紫色反应。

作用茚三酮是一个有机化合物，被广泛用于检测氨、一级和二级胺，尤其是氨基酸。

氨基酸与茚三酮水合物在弱酸条件下共加热时，氨基酸被氧化脱氨、脱羧，而茚三酮水合物被还原，其还原物可与氨基酸加热分解产生的氨结合，再与另一分子茚三酮缩合成为蓝紫色化合物，称为罗曼紫（Ruhemann's purple）。

此化合物最大吸收峰在570nm波长处。

由于此吸收峰的大小与氨基酸释放的氨量成正比，因此可作为氨基酸的定量分析方法法医学上这个反应被用于鉴定指纹。

茚三酮反应（Kaiser鉴定）也可用来在固相接肽时检验脱保护基是否已经完成，鉴定和比色法分离氨基酸以及鉴定铵离子（呈紫色）。

茚三酮与氨基酸反应生成蓝紫色化合物，但pro，羟-pro反应时呈黄色。

茚三酮用于脯氨酸含量的测定当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸的含量的高低。

在520nm 的波长下比色，从标准曲线（用脯氨酸标准溶液制得）上查出(或用回归方程计算)脯氨酸的含量。

①茚三酮检出物：氨基酸、胺与氨基糖类。

溶液：本品O.2g溶于乙醇l00ml中。

方法：喷后于110oC加热。

结果：呈红紫色斑点。

茚三酮对一级二级的胺显色肯定没问题的，三级胺有些可以，酰胺应该也没问题的，配制：1.5g 茚三酮 + 100mL of 正丁醇+ 3.0mL 醋酸；显色的时候板子浸湿，用纸擦一下多余液滴，再用电热枪（电吹风太弱了）吹出斑点，显色因为氨基酸的不同而显示不同的紫色黄色等等，你想检测伯胺的话，肯定没有问题的！配制方法：1.5g 茚三酮+ 100mL of 正丁醇+ 3.0mL 醋酸茚三酮不是太好溶解，需要多搅拌才行。

植物体内脯氨酸的含量可用酸性茚三酮法测定。

在酸性条件下，脯氨酸和茚三酮反应生成稳定的有色产物，该产物在520nm 有一最大吸收峰，其色度与含量正相关，可用分光光度法测定。

该反应具有较强的专一性，酸性和中性氨基酸不能与酸性茚三酮试剂形成有色产物，碱性氨基酸对这一反应有干扰，但加入人造沸石（permutit ），在PH 1~7 范围内振荡溶液可除去这些干扰的氨基酸（如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸，精氨酸等 2 —氨基的氨基酸）。

3 ．酸性茚三酮试剂：称取2.5g 茚三酮，加入60mL 冰醋酸和40mL 6mol/L 磷酸，于70 ℃加热溶解，冷却后储于棕色试剂瓶中，4 ℃保存，两天内稳定。

4 ．脯氨酸标准母液：称取10mg 脯氨酸溶于少量80% 乙醇中，再用蒸馏水定容至100mL, 成100μg/L 母液。

测脯氨酸含量：1 ．脯氨酸标准曲线制作：吸取脯氨酸标准母液0, 0.5, 1.25, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0, 15.0mL 分别放入8 个50mL 容量瓶中，分别加入蒸馏水定容至50mL ，配成0.0 ，1.0 ，2.5 ，5.0 ，10.0 ，15.0 ，20.0 ，30.0μg/mL 的系列溶液。

分别吸取上述各标准溶液2mL ，冰醋酸2mL ，茚三酮试剂2mL ，加入到10mL 带塞刻度试管中，塞上塞子，于沸水浴中加热15 分钟，用分光光度计测定520nm 的光密度值，以零浓度为空白对照。

将测定结果以脯氨酸浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标制作标准曲线。

2. 测定样品的脯氨酸含量（ 1 ）提取脯氨酸：分别称取胚轴，每种处理各取三份，每份0.3g 。

剪碎，加入适量80% 乙醇，少量石英砂，于研钵中研磨成匀浆。

匀浆液全部转移至25mL 刻度试管中，用80% 乙醇洗研钵，将洗液移入相应的刻度试管中，最后用80% 乙醇定容至刻度，混匀，80 ℃水浴中提取20 分钟。

(2 ）除去干扰的氨基酸：向提取液中加入约0.4g 的人造沸石和0.2g 活性碳，强烈振荡5 分钟，过滤，滤液备用。

脯氨酸的检测方法1. 原理样品用茚三酮处理，样品中的脯氨酸反应生成橙色物质，在520nm检测吸光度，并作空白对照实验。

2. 应用范围本方法适用于蜂蜜、果汁和浓缩汁中的脯氨酸的检测。

本方法在其它方面的应用必须经过个别论证。

3. 试剂及仪器3.1脯氨酸3.2 3%茚三酮2-甲氧基乙醇溶液（0.3g茚三酮溶解于10ml 2-甲氧基乙醇，每天保持新鲜，即现用现配）3.3 2-甲氧基乙醇3.4 蚁酸(96%)，即甲酸3.5 异丙醇（2-丙醇）水溶液：水：丙醇=1：13.6 15ml旋盖玻璃离心管（确保离心管的边缘没有缺口，将有缺口的离心管丢掉）3.7 分光光度计，检测吸光度设定在520nm下3.8 1cm 玻璃比色皿4. 样品准备4.1苹果，梨和大部分浆果的果汁用单一浓度（即原果汁浓度），橙汁用1：20的水进行稀释。

其它的果汁应进行适当的稀释，以保证稀释后的样品中的脯氨酸的含量低于50mg/L(见稀释表)。

浓缩果汁用水稀释到单一浓度，然后再进一步进行适当的稀释。

蜂蜜的稀释，采用2.5g蜂蜜加50ml水。

将样品在分析之前离心5min左右，去除悬浮物，取上清液进行分析。

4.2原果汁稀释表样品类型稀释比例颜色空白期望值Apple 苹果1:1 yes Apricot 杏21:1 yes Aronia 野樱莓1:1 yes Banana 香蕉1:1 yes Blackberry 黑莓1:1 yes Cherry 樱桃1:1 yes Cranberry 蔓越莓1:1 yes Grape 葡萄16:1 yes Grapefruit 柚子21:1 no Guava 番石榴3:1 yes Kiwi 泥猴桃1:1 yesLemon 柠檬21:1 noLime 酸橙21:1 noMandarin 中国柑桔21:1 noMango 芒果1:1 yesNectarine 油桃21:1 noOrange 柑桔21:1 noPapaya 番木瓜1:1 yesPassion Fruit 西番莲1:1 yesPeach 桃6:1 yesPineapple 菠萝1:1 yesPlum 李子7:1 yesPrune 西梅16:1 yesRaspberry 悬钩子（树梅）5:1 yesStrawberry 草莓1:1 yesTangerine 橘子21:1 noTomato 番茄1:1 yes5. 标准溶液的制备5.1脯氨酸贮备液（500mg/L）：0.0500g脯氨酸加水定容至100ml。