血小板抗原抗体检测

血清学检测临床分析

1.6简易特点，但大多数方法因在实用性、敏感性和特异性及操作仪器等方面存在问题，不能在一般实验室和血库推广应用并显示价值。1994年我国研究成功了简易致敏红细胞血小板血清学试验(SEPSA)，近年来还进行了特异性血小板抗原抗体反应检测方法和应用的研究，从而逐步建立起一套完整的血小板血清学检测方法。
2.3开展母婴血小板血型及多种血液病(ITP、SLE)的研究：可早期预测、预防NAITP及早期流产的发生，达到优生优育的目的[2]。
2.4适合性血小板输血治疗，提高血小板成分输血相容性，达到安全有效的输血目的。SEPSA已对几万份标本进行了血小板抗体检查，有助于解决血小板成分输注治疗及血小板免疫性疾病的诊断和治疗上的迫切问题。SEPSA方法简易、快速、敏感、特异性强，应用范围广，特别在血小板交叉配合试验中是一种较为有效的方法。它不需要特殊的仪器设备，适合我国国情，正在全国各医院血库、临床实验室推广应用，已有不少应用成果发表。虽然已建立多种血小板抗原抗体血清学检测技术，但任何一种方法总有不足之处，不会是完美无缺，另外还有一个检测阈以及技术人员的掌握熟练程度等影响因素。目前谁也不敢说哪种方法能达到100％的正确率，任何一种方法学都有其一定的限制性，应相互互补。根据不同的检测要求及自身试验条件(如经费、设备、时间、标本量)等选择相应有效的一种或几种检测方法，并善于灵活应用各种方法，才能得出一个正确的结论。随着时代不断前进，科学不断进步，各种检测新技术不断发展，方法学的研究也在改进提高。
1.5特异的单克隆抗体对血小板抗原固定试验(MAIPA)
特异的单克隆抗体对血小板抗原固定试验(MAIPA)是1987年Kiefel等人发明的一项应用最广泛的血清学技术。原理是在血小板上先结合人的同种抗体，然后再结合鼠抗人血小板抗体，裂解血小板后，把裂解产物移至包被的羊抗鼠IgG的平底板内，通过辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG检测人的血小板同种抗体。这项技术具有下列优点：敏感性强，在血清中被污染的抗体也可检出。由于MAIPA试验具有高度敏感性，使得像Br(HPA－5)这样在血小板膜上数量很小的抗原也能得到表达。另外，当怀疑患儿可能是胎儿及新生儿同种免疫血小板减少症时，采用MAIPA技术对双亲进行配型，可以检测出许多低频率的同种异体抗原。其缺点是在未知抗体检测时必须使用一组单克隆抗体，而又不能对所有糖蛋白具有活性。因此，如果人抗体与单克隆抗体和同一个抗原决定簇反应，就会引起假阴性结果。

血小板抗体的检测及其对血小板输注效果的影响

为１．Ｏ（／０，小板输注无效率为１．３（／０。两组比较，Ａ抗体阳性率差异有统计学意义（＜Ｏ０）ＨＰ抗体Ｏ０３３）血３３４３）ＨＬＰ．５，Ａ阳性率比较差异无统计学意义（Ｐ＞Ｏ０）发生血小板输注无效率比较差异有统计学意义（．５，Ｐ＞Ｏ０）结论输注滤除白细胞的．５。
Ａｓｒｃ：ｂｅｔｅＴｉｕｓｔｅｏｕｒｎｅｆｌｔｌｎｉｄｎｖｌａｅｈｆｃｎｙｏｌｔｌａｓｕｉｎＭｅｈｄｂｔｔＯｊｃｉｏｄｓｓｃｒｅｃａｅｔｔｏｙｄｔｅａｔｔｅｅｆｉｃｆａｅｔｒｎｆｓ．ｔｏｓａｖｃｈｏｐｅａｂａｏｕｉｅｐｅｔｏ
摘要：目的探索血小板抗体的产生规律及对血小板输注效果的影响。方法检测非滤过组（组）滤过组（Ａ和Ｂ组）者患
血小板ＨＬ抗体和ＨＰ抗体，ＣＩ价两组患者血小板输注效果。结果Ａ组ＨＬ抗体阳性率为５．７（７３）ＨＰＡＡ以Ｃ评Ａ６６１／０，Ａ抗体阳性率为１．７（／０，小板输注无效率为４．７（４３）Ｂ组ＨＬ抗体阳性率为１．３（／０，Ａ抗体阳性率６６５３）血６６１／ｏ；Ａ３３４３）ＨＰ

和血小板特异性抗原

HLA抗原性较强→多次输血→HLA抗体→输注随机血小
板（血小板膜上存在的HLA-A、B抗原）→抗体与输入的血小板反应→血小板减少→血小板输注治疗无效
12
非免疫因素
患者有发热、败血症、脾肿大、弥散性血管
内凝血等情况时，也可以导致发生血小板输注后记
数不增高的无效状态。因此当出现输血反应时，应
及时判断是否存在非免疫性血小板消耗的原因，并
原，正式命名为HPA-1~HPA-5和HPA-15。
4
血小板特异性抗原
血型系 HPA-1 以往命名 Zw PLA 糖蛋白 (GP)定位 GP IIIa 表现型频率抗原 HPA-1a HPA-1b 以往抗原命名 Zwa Zwb PLA1 PLA2 白人 97.9 26.5 日本人 >99 3.7 中国人 >99 n.t.
合”的浓缩血小板。
18
二、新生儿同种免疫性血小板减少性紫癜 ( nenatal alloimmune thrombocytopenic purpura ) 1、新生儿同种免疫性血小板减少性紫癜（NAITP）是由于胎儿和母亲的血小板血型不合，使母亲产生同种抗体，这种同种抗体能通过胎盘进入胎儿体内，与胎儿血小板反应而导致胎儿或新生儿的血小板减少症。
>99.9
3.7 nt 25.4 78.9 70.7 99.9
>99.9
11.5 nt nt 87.3 nt >99.9
99.6
nt 96.8 32.8 nt nt nt
99.9
nt nt nt 89.3 nt 99.9
>99.4
1.79 nt nt 72.9 80.7 >99.4
>99.9

无偿献血人群血小板抗体检测结果分析

血球为 ± 。②阴性结果：血球呈纽扣状，集中在孔底
中央。
１３统计学方法采用ＣＡＢ输血服务标准化．ＡＢ系统Ｖ．２０软件统计。数据比较采用检验。Ｐ≤
基金项目：聊城市卫生局医学科研立项项目（０９￣７。２０２）
＋，球呈环状为＋，球环状较小、围可见分散血血周
ＨＡ抗体均阳性者占１％。研究发现妊娠产生Ｐ８ＨＡ抗体的概率高于５ＪＬ％。但妊娠期产生的
ＨＬＡ抗体生产后很难长期维持高的效价和高的特异性，生产后时间愈长，效价及特异性愈低，至消甚
失引。
目前研究表明，ＡＩ类抗原是血小板膜固有ＨＬ
的蛋白，巨核细胞生成阶段及血小板生成后持续在表达，而不是血小板从血浆中吸收附着的成分；血小板细胞膜上ＨＡ抗原只是Ｉ类抗原，只是ＨＬ・Ｌ且Ａ
探讨其阳性率和分布特点。
１资料与方法
１１临床资料．
６５４例无偿献血者，中男２０９５其３
注：男性比较，Ｐ＜Ｏ０；无妊娠史者比较。Ｐ＜００与．１与．１
例，４５５例（性无妊娠史者２３２例，性有妊女１女４女娠史者２１３例）年龄１７；８～５５岁。分别留取未抗凝血样，离出血清，用。简易致敏红细胞血小板分备

血小板特殊配血检测

血小板特殊配血检测针对存在HLA抗体、HPA抗体或血小板自身抗体的患者进行的血小板配血称为血小板特殊配血。

（一）SEPSA1.该技术在血小板抗体检测中首次介绍，此处介绍在血小板特殊配血检测时的检验方法。

（1）原理：同SEPSA在血小板抗体检测中的原理。

器材：平板离心机，95×16mm尖底离心管（以下称“尖底管”），96孔脱卸式U型板，滴管，加样器。

（2）试剂：生理盐水、ACD-A保养液、甲醛、阴阳对照试剂、PBS及Tween20-PBS（以下称“T-PBS”）试剂。

（3）操作：1）与患者ABO同型的献血者富含血小板血浆（PRP）中加入1/10量的ACD-A液，混合，1100g（2800r/min），离心10分钟，弃去上清液。

2）同血小板抗体检测SEPSA操作3）～8）。

3）每孔中加入25μl被检者血清，室温湿盒1小时。

4）同血小板抗体检测SEPSA操作10）。

5）同血小板抗体检测SEPSA操作12）。

6）结果判定与记录：凝集强度判读见表。

阳性表明受检者血清中存在和献血者血小板反应的抗体，为血小板特配不相合；阴性表明受检者血清中未检出和献血者血小板反应的抗体，为血小板特配相合。

2.方法学评价同血小板抗体检测中的SEPSA方法学评价。

3.质量保证（1）检测前：将被检血清4000r/min（2800g）离心10分钟，以去除沉淀。

被检标本不能使用血浆。

被检血清不需要灭活补体。

（2）检测中：为了防止静电干扰，宜在室温湿润状态下操作。

设立阴阳性对照以进行质量控制，以正常人AB血清为阴性对照，已知阳性血清为阳性对照。

4.参考范围阴性。

5.临床意义对于有指征的患者，在明确血小板抗体性质的基础上，其输注血小板时应通过血小板特殊配血获得配合性血小板输注，以避免血小板输注无效和输血后紫癜。

当患者被高度同种免疫，存在多种同种抗体时，比较难以获得相容性血小板，血小板特殊交叉试验往往难以成功。

这种情况下，可以通过选择HLA匹配的血小板来得以解决。

血小板抗体与血小板输注无效

血小板抗体与血小板输注无效一般情况下输注1个治疗量单采血小板，可以使患者血小板计数升高约为10~20×109/L，血小板计数升高不是作为判断的唯一指标，要结合患者病情以及输血次数等方面综合考虑。

如患者症状减轻或出血停止，血小板计数升高，CCI≥10输注有效，CCI<10提示输注无效。

输注后应测定1 h和24 h的PPR，如果输注后 1 h，PPR<30%，24 h PPR<20%，则考虑输注无效。

血栓弹力图TEG MA值明显上升或恢复正常为有效。

导致血小板输注无效的原因有很多，包括血小板制备质量，免疫因素，如血小板抗体的产生，以及非免疫因素如发热，感染，脾大以及药物等。

血小板抗体是免疫性血小板输注无效的主要原因。

一般患者输注血小板后血小板抗体的阳性率为8.2%～60.0%，肿瘤患者和干细胞移植患者血小板抗体阳性率为12.6%～66.0%，这些抗体是导致免疫性血小板输注无效的主要因素。

对患者进行血小板抗体筛查和鉴定，可以诊断免疫性血小板输注无效。

对血小板抗体阳性患者输注血小板交叉配合的血小板，可有效预防免疫性血小板输注无效。

为保障患者输血健康与安全，经中国医师协会输血科医师分会和中华医学会临床输血学分会部分输血专家团队以及与相关临床科室专家认真研讨，一致认为应对以下患者进行血小板抗体检测：●1血小板输注患者；●2 NHTR患者；●3有输血史、妊娠史、器官移植、血液病、自身免疫性疾病、肿瘤等需要输血患者；●4 ITP、SITP、PTP患者；●5不明原因性反复流产患者；●6可疑FNAIT妊娠患者；●7血小板计数降低原因不明患者；●8其它输血不良反应（如输血相关急性肺损伤等）的原因调查患者。

血小板抗体检测内容：1、HLA抗体如果患者HLA抗体阳性，应做血小板交叉配型，输注交叉配型阴性血小板；有条件的应做供、受者HLA分型，首选HLA抗体相应抗原阴性ABO同型的血小板输注，次选HLA抗体相应抗原阴性ABO相容的血小板输注。

血小板输注前检测人类白细胞抗原抗体的必要性探讨

ＮｅｅｓｔｆｄｔｃｉｃｓｉｙｏｅｅｔｎｇＨＬＡｎｉｏｅｏｅｐｌｔｌｔｔａｓｕｉｎＬＵＯａｔｂｄｙｂｆｒａｅｅｒｎｆｓｏＹｉ，ＥＮＧｎｐｉ（ＭＦａ — ｎｇＣｈｏｎｇｑｎＳａｎａｉｇｘｉＣｅ — ｎ
ＩｓｖｒｃｓａｙｔａｒｔＨＩＡｎｔｂｏｓｒｅｎｇｉｏｏｒｎｆｉｎｐａｉｎｔｅｐｅｉｌｙｍｕｔｐｌｌｏｔｉｅｙｎｅｅｓｒｏｃｒｙｏｕａｉｄｙｃｅｎｉｎｂｌｄｔａｓｕｓｏｔｅｓ，ｓｃａｌｌｉｅｂｏｄ
・
２４７・
检验医学与临床２１０１年２月第８卷第３期
ＬｂＭｅｌ，ｅｒａｙ２１，１８Ｎｏ３ａｄＣｉＦｂｕｒ０１Ｖｏ．，．ｎ
・
论著・
血小板输注前检测人类白细胞抗原抗体的必要性探讨
ｐｔｅｓｏｆｍｕｌｉｅｂｌｏｄｔａｆｓｏｎａｏｒ．ｓｔＴｈｅｅｗｅｅ５２ｃｅｌｏｔｂｙｐｏｉｉｔｅｓｉｈａｉｎｔｔｐｌｏｒｎｓｕｉｓｓｃｎｔｏ１Ｒｅｕｌｓｒｒａｓｓｏｆａｌａｎｉｏｄｓｔｖｅｐａｉｎｔｎｔｅ
罗仪，凡萍（庆三峡中心医院，庆万州孟重重
【要】目的摘
４４０）０００
探讨血小板输注前检测人类白细胞抗原（Ｌ抗体的必要性。方法对１６例血小板输注ＨＡ）０

抗血小板膜糖蛋白自身抗体测定

抗血小板膜糖蛋白自身抗体测定抗血小板膜糖蛋白自身抗体测定介绍：抗血小板膜糖蛋白自身抗体测定是应用流式细胞术(FCM)测定血抗血小板膜糖蛋白自身抗体，研究其对特发性血小板减少性紫癜(ITP)诊断的意义。

特发性血小板减少性紫癜(ITP)是一种免疫性疾病，患者体内产生抗血小板自身抗体与血小板抗原结合，导致血小板迅速从循环中清除。

抗血小板膜糖蛋白自身抗体测定正常值：检查结果为阴性。

抗血小板膜糖蛋白自身抗体测定临床意义：异常结果：检查结果呈阳性，即FCM法检测，荧光显示阳性，表明患有特发性血小板减少性紫癜(ITP)。

需要检查的人群：有急性型临床出血重及血液病史的人群。

抗血小板膜糖蛋白自身抗体测定注意事项：不合宜人群：无检查前禁忌：检查前一天不吃过于油腻、高蛋白食物，避免大量饮酒。

血液中的酒精成分会直接影响检验结果。

体检前一天的晚八时以后，应禁食。

检查时要求：，要求采用静脉血，抽血时应放松心情，避免因恐惧造成血管的收缩、增加采血的困难。

抗血小板膜糖蛋白自身抗体测定检查过程：采用静脉采血进行检测。

静脉采血前要仔细检查针头是否安装牢固，针筒内是否有空气和水分。

所用针头应锐利、光滑、通气，针筒不漏气。

先用30g/L碘酊棉签自所选静脉穿刺处从内向外、顺时针方向消毒皮肤，待碘酊挥发后，再用75%乙醇棉签以同样方法拭去碘迹。

以左手拇指固定静脉穿刺部位下端，右手拇指和中指持注射器针筒，食指固定针头下座，使针头斜面和针筒刻度向上，沿静脉走向使针头与皮肤成30°角斜行快速刺入皮肤，然后以5°角向前穿破静脉壁进入静脉腔。

见回血后，将针头顺势探入少许，以免采血时针头滑出;但不可用力深刺，以免造成血肿，同时立即去掉压脉带。

针栓只能外抽，不能内推，以免静脉内注入空气形成气栓，造成严重后果。

取下注射器针头，将血液沿试管壁缓缓注入抗凝管中，防止溶血和泡沫产生。

血小板配型及相关性抗体检测操作规程

血小板配型及相关性抗体检测操作规程 SXYJ-GZ-02131目的规范血小板交叉配型或血小板抗体检测，保证检测结果准确及时。

2适用范围临床血小板输注无效患者及习惯性流产患者。

3职责检测者负责依据此程序进行血小板配型及相关性抗体检测操作。

4材料与设备血小板配型试剂盒、ACD/CPD红细胞保存液（成分手分室提供）、0.9%无菌生理盐水； KUBOTA KA-2200型离心机、KUBOTA KA-5100型离心机、DK-8A型电热恒温水槽（37℃）、观察灯、湿盒；一次性使用滴管、试管等。

5操作方法5.1试验前将试剂从4℃取出置室温平衡30min以上，或37℃平衡10 min以上；5.2待检标本的准备患者血清或EDTA抗凝血浆、血小板悬液(血小板交叉配型供者血小板悬液标本由检测者到发血室、或包装组自取检测结果合格的血小板血辫、血小板抗体检测的血小板悬液按5.3方法制备)；5.3制备血小板悬液5.3.1富血小板血浆的制备室温保存的新鲜EDTA抗凝全血(当天)2～3ml，800rpm离心10min，取上层富血小板血浆备用；5.3.2血小板悬液的制备取0.5-1ml浓缩机采血小板或富血小板血浆，用ACD/CPD红细胞保存液洗涤1次，3400rpm离心2分钟，弃上清，用生理盐水调节血小板浓度，肉眼观察稍透明似毛玻璃状；5.4每孔加入1d（约50µl）相对应的血小板悬液，并设阳性对照、阴性对照、待检孔，离心600rpm5分钟；5.5轻轻倒出未结合的血小板，并用PBS液洗6次，每孔约150µl。

每次加洗液时要缓慢加入，并旋转轻摇微孔板，然后再倒掉清洗液；倒时切勿用力过大，以免将包被好的血小板倒出；5.6每孔加入Liss液2d，加入相应的阳性对照血清、阴性对照血清、检测血清各1d，轻轻振荡微孔板条至紫色Liss试剂变成蓝色（约10秒钟）；5.7将反应微孔板放于湿盒内，置37℃孵育30分钟；5.8用PBS液洗6次，各孔立即加抗-IgG1d、指示红细胞1d，2000rpm离心5分钟；6结果判断根据指示红细胞分布情况进行判读阳性——红细胞粘附在微孔整个底部；阴性——红细胞呈紧密细胞扣附于微孔底部中央；弱阳性——介于阴性和阳性之间。

血小板相关抗体的检验

血小板相关抗体的检验发表时间：2010-08-11T15:57:41.937Z 来源：《中外健康文摘》10年第21期供稿作者：孙晓春李娟（黑龙江省虎林市人民医院158400）[导读] 在特发性血小板减少性紫癜(ITP)和一些自身免疫性疾病时机体存在抗自身血小板抗体，可破坏自体血小板，这些抗体主要是。

IgG，另有少数IgM和IgA，可采用Elisa法、放射免疫法、流式细胞术等进行检测。

血小板相关抗体的检验孙晓春李娟（黑龙江省虎林市人民医院 158400）【中图分类号】R558 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085 (2010)21-0212-01【摘要】目的探讨血小板相关抗体(PAIg)检测的临床意义.方法研究近年来我科进行的血浆凝血酶原时间测定报告。

结论 PAIg检测有助于ITP的诊断、选择最佳治疗方案并判断疗效. 【关键词】血小板相关抗体的检验1．原理在特发性血小板减少性紫癜(ITP)和一些自身免疫性疾病时机体存在抗自身血小板抗体，可破坏自体血小板，这些抗体主要是。

IgG，另有少数IgM和IgA，可采用Elisa法、放射免疫法、流式细胞术等进行检测。

2．标本采集EDTA抗凝静脉血，特殊处理后(详见操作方法)收集血小板。

3．试剂以Elisa法PAlgG测定为例，也可以试剂盒说明书为准。

(1)抗凝剂67 mmol／L EDTA-Na2。

(2)洗涤液0.01 mol／L PBS-67 mmol／L EDTA-Na2，pH 6.5。

(3)缓冲液0.01 mol／L PBS缓冲液，pH 7.4。

(4)包被液0.05 mol／L碳酸盐缓冲液，pH 9.6。

(5)反应液0.02 mol／L Tris-盐酸缓冲液，pH 7.4。

(6)显色液0.1 mol／L枸橼酸-枸橼酸钠液100 ml，加邻苯二胺40mg和30％过氧化氢溶液12μl。

(7)终止液：3mol／L硫酸。

(8)其他①抗人IgG抗体。

②酶标记的抗人IgG抗体。

全血法流式细胞术检测血小板抗体分析

性高，在检测血小板抗体中的优势日渐明显，对医生判断病情和提出治疗的意义重大，也越来越广泛地被应用于临床检
溶解、离心。将上清液１００ｐ．１加到９６孔酶标板当中，再加ＨＲＰ—ＩｇＧ（４ｍｌ／Ｌ），混合均匀，放置到３７ ℃ 环境中，６０ａｒｉｎ
特发性血小板减少性紫癜（ＩＴＰ）是由于患者自身的抗血小板抗体和血小板抗原结合，血小板迅速清除而导致的免疫性疾病。血小板抗体的检测与分类在血小板相关性疾病的诊断、治疗和疗效判定方面都具有重大价值… 。然而，虽然
可作为临床检测的首选方法。
全血法流式细胞术在检测血小
板抗体中极具优势，需血量少、检测结果准确、可重复性好、灵敏度高，对医生提出有效地治疗方案有指导性意义，【关键词】血小板；抗体；诊断
【中图分类号】Ｒ５５８【文献标识码】Ｂ【文章编号】１６７４ — ３２９６（２０１４）０３Ｃ一０１４— ００２
ｓｏｎ公司生产的流式细胞仪ＦＡＣＳｃａｎ。抗凝剂使用１０９ｍｍｏｌ／Ｌ柠檬酸钠；磷酸缓冲液使用ＰＢＳ（１ｇ／Ｌ叠氮钠，ｐＨ为７．１～７．３）；固定液使用０．１％多聚甲醛；单克隆抗体
１．１一般资料
ｒｒＰ患者７７例，其中男４６例，女３１例；年龄２５～５９岁，平

血小板抗体检测及配型对血小板输注无效的临床意义

Ｔｈｌｎｃｌｓｇｉｉａｅｏａｅｅｎｔｂｏｙｄｔｃｉｎａａｔｌｔｃｏｓｍａｃｄｏｎｐｌｔｌｔｔａｆｉｎｅｒｃｏｉｅｓｅｃｉｉａｉｎｆｃｎｃｆｐｌｔｌｔａｉｄｅｅｔｏｎｄｐｌｅｅｒｓ－ｔｈｅａｅｅｒｎｓｕｓｏｒｆａｔｒｎｓ
在临床上，小板输注主要用于预防和治疗血小板减少或血
血小板功能异常患者的出血，一种有效的治疗方法。患者在是
ＩＧ致敏红细胞，离心后指示红细胞通过抗人ＩＧ的桥连与ｇ经ｇ
ｃｏｓｍａｃｅ．ｔｏｓＲｅａｄｎｈｍｐｏｅｎｆｈｅｒｈｇｙｔｍ，ｏｒｃｅｏｎｎｒｍｅｔＣ）ｒｓ — ｔｈｄＭｅｈｄｇｒｉｇｔｅｉｒｖｍｅｔｏａｍｏｒａｅｓｍｐｏｃｒｅｔｄｃｕｔｉｃｅｎ（ＣＩ，ｐｒｅｔｐａｅｅｅｏｅｙ（ＰＲ）ａｈｔｎａｄ，ｔｅｅｆｃｅｃｆｔａｓｕｉｎｏｅｏｅａｄａｔｒｐａｅｅｓｃｏｓｅｃｎｌｔｌｔｒｃｖｒＰｓｔｅｓａｄｒｈｆｉｉｎｙｏｒｎｆｓｏｆｂｆｒｎｆｅｌｔｌｔｒｓ —
ｍａｃｄｗｅｅｃｍｐａｅＲｅｕｔＩ５ｃｓｓｏｆｐａｉｎｔｉｈｐｌｔｌｔｔａｆｓｏｎｒｆａｔｒｎｅｓ，９ｃｓｓｔｈｅｒｏｒｄ．ｓｌｓｎ２ａｅｔｅｓｗｔａｅｅｒｎｓｕｉｅｒｃｏｉｓａｅｐｌｔｌｔａａｅｅｎ— ｔｂｙｅｅｔｏｎｗｅｅｏｓｔｖｅｉｏｄｄｔｃｉｒｐｉｉ．Ｔｒｎｓｕｓｏｆｉｉｎｙｒｔｓｏｆｅｓｓｗｅｅｓｇｎｉｉａｌｄｆｅｅｔｅｏｒａｆｅａｆｉｎｅｆｃｅｃａｅ９ａｅｒｉｆｃｎｔｙｉｆｒｎｂｆｅｎｄａｔｒ

活化血小板检测方法

活化血小板检测方法1．临床意义心肌梗塞、脑血管血栓形成、深静脉血栓形成、脑栓塞和肺栓塞等血栓性疾病在中国有很高的发病率，也是致死的重要原因。

血小板活化是血栓形成的重要环节，检测血小板的活化状态可辅助诊断和监控血栓性疾病，对判断血栓前状态意义也非常重大。

2．检测原理静止状态的血小板内分布着多种颗粒，如a颗粒、溶酶体颗粒等。

这些颗粒表面存在着一些特定蛋白，如a颗粒表面有CD62p抗原，溶酶体颗粒表面有CD63抗原。

血小板活化时，由于颗粒膜蛋白与血小板膜蛋白相互融合，使颗粒膜蛋白翻转到血小板膜表面。

因此，可通过检测这些颗粒膜蛋白来判断血小板的活化状态。

3. 采血EDTA抗凝采血，取后段血。

因前段血中可能有组织液存在，造成人为血小板活化。

4. 试剂选择FITC标记的CD42b抗体PE标记的CD62p或CD63抗体在血小板膜表面稳定表达的抗原有CD41/CD61(GPIIb/IIIa)和CD42a, CD42b 等，这些抗原均可作为血小板的标志。

但因中国存在着一部分血小板无力症患者，其血小板表面缺乏CD41/CD61(GPIIb/IIIa)。

因此，一般使用CD42b来鉴别血小板。

因一般情况下，CD62p和CD63的表达率均较低，需用PE等荧光较强的荧光素标记检测。

5. 染色a. 全血法：1) 取试管A(阴性对照)和试管B(测定管)，均加入5ml 抗凝全血和200ml PBS2) A管中加入适量的CD42b-FITC和阴性对照抗体(对应于CD62-PE或CD63-PE)B管中加入适量的CD42b-FITC和CD62-PE或CD63-PE抗体3) 室温，避光孵育25分钟4) 加2 ml PBS，上机检测血小板在体外随着时间的延长会自发活化，所以由采血到检测一般要在3小时内完成。

b. 固定法：1) 抗凝全血800rpm 离心10分钟，取上清液即PRP(富血小板血浆)2) 以等体积1-2%的多聚甲醛固定10分钟3) PBS洗涤1次，用PBS调节细胞浓度为1×107个/ml左右4) 分别在试管A(阴性对照)和试管B(测定管)进入100ml血小板悬液5) A管中加入适量的CD42b-FITC和阴性对照抗体(对应于CD62-PE或CD63-PE)B管中加入适量的CD42b-FITC和CD62-PE或CD63-PE抗体6) 其余步骤同全血法固定法可避免血小板在体外因时间或操作造成的人为活化，固定后的血小板可在5天内检测。