PCR技术克隆目的基因全过程

实验：目得基因克隆（PＣR技术) 【课前预习】 ＰCR （ｐoｌｙmeｒase chain rｅactｉon) 反应得基本原理. 【目得要求】

1.学习与掌握 PCR 反应得基本原理与实验技术方法. 2.认真完成每一步实验操作，详细记录实验现象与结果并加以分析与总结。

【基本原理】

类似于 DＮA 得天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补得寡核苷酸引物.PCR 由变性－-退火-—延伸三个基本反应步骤构成:①模板 DＮA得变性：模板 DNA 经加热至９３℃左右一定时间后，使模板 DＮA双链或经 PCR 扩增形成得双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备;②模板 DNＡ 与引物得退火(复性)：模板 DＮA 经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板 DＮA 单链得互补序列配对结合;③引物得延伸:DＮA 模板——引物结合物在 TaqDNＡ 聚合酶得作用下,以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新得与模板 ＤＮA 链互补得半保留复制链重复循环变性—－退火—-延伸三过程，就可获得更多得“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环得模板.每完成一个循环需 2～4 分钟,２~３ 小时就能将待扩目得基因扩增放大几百万倍。到达平台期（Ｐlatｅａｕ)所需循环次数取决于样品中模板得拷贝。

【实验用品】

１.材料:重组质粒DNA作为模板 2．器材与仪器：移液器及吸头，硅烷化得 PＣR 小管，DＮA扩增仪（PE 公司）,琼脂糖凝胶电泳所需设备(电泳槽及电泳仪）,台式高速离心机 ３。试剂: ① １0×PＣR 反应缓冲液:5０0mmol/L KCl， 100mmoｌ/Ｌ Ｔris·Cl， 在 25℃下, ｐH9、0， 1、0% Triton X-１00. ② ＭgCl２ ：２5mmｏｌ/L. ③ ４ 种 dNＴP 混合物：每种 2、5mmol/L。 ④ Taｑ DNA聚合酶 5U/μｌ。 ⑤ T4 DNA连接酶及连接缓冲液： 【方法步骤】

（一）PCＲ反应 1、 依次混匀下列试剂 ３５μl H2 O 5μｌ 1０×PCＲ反应缓冲液 4μl 2５mｍoｌ/L ＭｇCｌ2 4μｌ ４种dNTP ０、5μl 上游引物（引物1) 0、5μｌ 下游引物（引物2) 0、5μl 模板ＤＮＡ(约１nｇ） 混匀后离心5秒。 2、 将混合物在９4℃下加热５分钟后冰冷，迅速离心数秒， 使管壁上液滴沉至管底，加入Ｔａｑ DNA聚合酶（0、5μｌ约2、5U)，混匀后稍离心,加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上. ３、 用９4℃变性1分钟,45℃退火1分钟， 7２℃延伸２分钟, 循环35轮，进行PCR。最后一轮循环结束后， 于72℃下保温１0分钟，使反应产物扩增充分。 4 电泳 按前所述,取1０μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析,检查反应产物及长度. [注意] 1、 PCR非常灵敏， 操作应尽可能在无菌操作台中进行。 2、 吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂. ３、 加试剂前, 应短促离心10秒钟, 然后再打开管盖， 以防手套污染试剂及管壁上得试剂污染吸头侧面。 4、 应设含除模板ＤNＡ所有其它成分得负对照。

【实验结果】 【注意事项】 微量操作、PＣR 反应体系得设计、引物设计、扩增条件得优化 【思考题 】

１、 降低退火温度对反应有何影响? 2、 延长变性时间对反应有何影响？ ３、 循环次数就是否越多越好？为何？ 4、 ＰＣR有哪些用途?举例说明.

附：PCＲ知识(供参考）

(一）PCR 反应体系与反应条件 标准得 ＰCR 反应体系: １0×扩增缓冲液 10ul 4 种 ｄNＴP 混合物 各 ２00ｕmol／L 引物 各 10~100pmｏl 模板ＤＮＡ ０、１～２ｕg Taq DNA聚合酶 2、5ｕ Mｇ２＋ 1、5mmoｌ/L 加双或三蒸水至 １0０ul PCR 反应五要素: 参加 PＣＲ 反应得物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板与 Mg2＋ 引物： 引物就是 PCR 特异性反应得关键,ＰCＲ 产物得特异性取决于引物与模板DNA互补得程度.理 论上，只要知道任何一段模板 ＤNA序列，就能按其设计互补得寡核苷酸链做引物,利用 ＰＣR 就可将模板ＤNA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则： ① 引物长度: 15-30bp,常用为２0bp左右。 ② 引物扩增跨度： 以 200—50０bp为宜，特定条件下可扩增长至 10ｋb 得片段。 ③ 引物碱基:G＋C 含量以 ４0—６０%为宜,Ｇ+Ｃ 太少扩增效果不佳，G＋Ｃ 过多易出现非特异条带。ATGＣ最好随机分布,避免５ 个以上得嘌呤或嘧啶核苷酸得成串排列。 ④ 避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别就是 3’端得互补,否则会形成引物二聚体，产生非特异得扩增条带。 ⑤ 引物 3’端得碱基，特别就是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致 PＣR 失败. ⑥ 引物中有或能加上合适得酶切位点,被扩增得靶序列最好有适宜得酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处. ⑦ 引物得特异性:引物应与核酸序列数据库得其它序列无明显同源性. 引物量： 每条引物得浓度 0、1~1umol 或 １0～100ｐmｏl,以最低引物量产生所需要得结果为好，引物浓度偏高会引起错配与非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体得机会。 酶及其浓度: 目前有两种 Taq ＤNA聚合酶供应， 一种就是从栖热水生杆菌中提纯得天然酶，另一种为大肠菌合成得基因工程酶。催化一典型得 PCR 反应约需酶量 2、5U(指总反应体积为 1０0uｌ 时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 dNTP 得质量与浓度：dＮTＰ 得质量与浓度与 PCR 扩增效率有密切关系，dNTP 粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP 溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后,以 1M NaOH 或 1M Tris。HＣｌ得缓冲液将其 PH调节到 7、０~７、5,小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使 dＮTP 降解。在 PＣR 反应中，dNＴP 应为 5０~2０0ｕmoｌ/Ｌ， 尤其就是注意 4 种 dＮＴP 得浓度要相等（ 等摩尔配制）， 如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低)，就会引起错配.浓度过低又会降低 PCＲ 产物得产量.dＮTP 能与 Ｍg２+结合，使游离得 Mｇ2+浓度降低。 模板（靶基因)核酸:模板核酸得量与纯化程度，就是 PＣR 成败与否得关键环节之一，传统得 DNA 纯化方法通常采用 SＤS 与蛋白酶 Ｋ 来消化处理标本。SＤS 得主要功能就是: 溶解细胞膜上得脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中得核蛋白，SDＳ 还能与蛋白质结合而沉淀;蛋白酶 K 能水解消化蛋白质,特别就是与 DNA 结合得组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质与其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取得核酸即可作为模板用于PCR 反应。一般临床检测标本,可采用快速简便得方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体得蛋白质使靶基因游离，直接用于 PCＲ 扩增.RNＡ 模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶Ｋ 法,要防止 RNaｓｅ降解 RＮＡ。 Mg2+ 浓度: Ｍg２+ 对 PCR 扩增得特异性与产量有显著得影响,在一般得 PCＲ 反应中，各种 dＮＴP 浓度为 ２００umol/L时，Ｍg2+浓度为 1、5~２、0mｍol/L为宜。Mｇ2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低 Tａq DNA聚合酶得活性，使反应产物减少。 PCR 反应条件得选择 ＰCR 反应条件为温度、时间与循环次数。 温度与时间得设置： 基于 ＰＣＲ 原理三步骤而设置变性－退火—延伸三个温度点.在标准反应中采用三温度点法，双链 DNA 在 ９0～95℃变性，再迅速冷却至 40 ~6０℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至 70～75℃,在 Ｔaq ＤNＡ 聚合酶得作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为 100～300bｐ 时)可采用二温度点法, 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用 94℃变性，６５℃左右退火与延伸（此温度 Ｔaq DＮA酶仍有较高得催化活性）. ① 变性温度与时间：变性温度低，解链不完全就是导致 ＰCR 失败得最主要原因。一般情况下,9３℃~94℃lｍiｎ足以使模板 DNA变性,若低于 93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶得活性有影响。此步若不能使靶基因模板或 ＰCＲ 产物完全变性,就会导致 PＣR 失败。 ② 退火(复性）温度与时间:退火温度就是影响 PCＲ 特异性得较重要因素.变性后温度快速冷却至 4０℃~６0℃，可使引物与模板发生结合。由于模板 ＤＮA 比引物复杂得多,引物与模板之间得碰撞结合机会远远高于模板互补链之间得碰撞.退火温度与时间，取决于引物得长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列得长度。对于 ２０ 个核苷酸，G+C 含量约 50%得引物，5５℃为选择最适退火温度得起点较为理想。引物得复性温度可通过以下公式帮助选择合适得温度： Tm值(解链温度)＝4（G+C）＋2（A+T） 复性温度=Tm值-（5~10℃) 在Tm值允许范围内， 选择较高得复性温度可大大减少引物与模板间得非特异性结合,提高 PCR 反应得特异性。复性时间一般为3０～60sec,足以使引物与模板之间完全结合。 ③ 延伸温度与时间：Ｔaq DNA聚合酶得生物学活性: ７０~８０℃ 15０核苷酸/S／酶分子 70℃ ６０ 核苷酸/S/酶分子 ５５℃ ２4 核苷酸/S/酶分子 高于9０℃时， DＮＡ合成几乎不能进行. PCＲ 反应得延伸温度一般选择在 70～7５℃之间，常用温度为 ７2℃，过高得延伸温度不利于引物与模板得结合。PＣR 延伸反应得时间，可根据待扩增片段得长度而定,一般 1Kb以内得ＤNA片段,延伸时间１min就是足够 得。3~4kb 得靶序列需 3～4ｍｉn；扩增 1０Ｋb 需延伸至 15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带得出现.对低浓度模板得扩增，延伸时间要稍长些. 循环次数：循环次数决定 PＣR 扩增程度。PCR 循环次数主要取决于模板 ＤNＡ得浓度。一般得循环次数选在 ３0～40 次之间，循环次数越多，非特异性产物得量亦随之增多。 PCＲ 反应特点特异性强 PCR 反应得特异性决定因素为: ① 引物与模板 DNA 特异正确得结合; ② 碱基配对原则; ③ Taｑ DNA 聚合酶合成反应得忠实性; ④ 靶基因得特异性与保守性。 其中引物与模板得正确结合就是关键.引物与模板得结合及引物链得延伸就是遵循碱基配对原则得。聚合酶合成反应得忠实性及 Taq ＤNA 聚合酶耐高温性,使反应中模板与引物得结合（复性）可以在较高得温度下进行,结合得特异性大大增加，被扩增得靶基因片段也就能保持很高得正确度。再通过选择特异性与保守性高得靶基因区,其特异性程度就更高.灵敏度高 PＣＲ 产物得生成量就是以指数方式增加得，能将皮克（pｇ=１０ -12 g）量级得起始待测模板扩增到微克（ｕg＝10 —6 g)水平。能从10０ 万个细胞中检出一个靶细胞;在