酶解辅助提取关黄柏生物碱的工艺研究

３８８　第１８卷３期　２０１２年９月　天津医科大学学报　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｔｉａｎｊｉｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｖ０Ｉ＿ｌ８．Ｎｏ．３　Ｓｅｐ．２０１２　文章编号１００６—８１４７（２０１２）０３—０３８８—０４　酶解辅助提取关黄柏生物碱的工艺研究　

林静　，高卫真’，李卓燕　。李佩孚　。周晶　（１．天津医科大学药理学教研室，天津３０００７０；２．天津医科大学药学院，天津市临床药物关键技术重点实验　室，天津３０００７０；３．天津市胸科医院药剂科，天津３０００５１）　摘要　目的：考察酶解辅助提取技术对关黄柏生物碱提取率的影响，优选出总生物碱的最佳提ｇｘｘ＿￣条件。方法：采用正交实　验，考察酶解辅助法在不同ｐＨ，不同温度，不同浸取时间对关黄柏中总生物碱提取率的影响。结果：优化酶解法的最佳提取工艺　条件为：纤维素酶用量为Ｏ．９％，在ｐＨ４．５，３５℃条件下酶解２．５　ｈ。酶解法可将总生物碱提取率提高约２７％。结论：酶浸一回流法提　取总生物碱方法可行，该方法提取时间短，提取率高，适合工业化生产。　关键词酶辅助提取；关黄柏；生物碱；正交试验　中图分类号Ｒ９　文献标志码Ａ　Ｓｔｕｄｙｉｎｇ　ｏｎ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ－ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｌｋａｌｏｉｄ　ｆｒｏｍ　Ｐｈｅｌｌｏｄｅｎｄｒｏｎ　ａｍｕｒｅｎｓｅ　ＬＩＮ　Ｊｉｎｇ　，ＧＡＯ　Ｗｅｉ—ｚｈｅｎ　，ＬＩ　Ｚｈｕｏ—ｙａｎ。，ＬＩ　Ｐｅｉ—ｆｕ　，ＺＨＯＵ　Ｊｉｎｇ　（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ　３０００７０，Ｃｈｉｎａ；２．Ｔｉａｎｊｉｎ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｅｎａｂｌｉｎｇ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ　３０００７０，Ｃｈｉｎａ；３．Ｄｅｐａｒｔ—　ｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ　Ｃｈｅｓｔ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｔｉａｎｊｉｎ　３０００５　１，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｉｎｓｐｅｃｔ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｅｎｚｙｍ０ｌｙｓｉｓ—ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ａｌｋａｌｏｉｄ　ｉｎ　Ｐｈｅｌｌｏｄｅｎｄｒｏｎ　ａｍｕｒｅｎｓｅ，ａｎｄ　ｏｐｔｉｍｉｚｅ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ａｌｋａｌｏｉｄ．Ｍｅｔｔ１０‘ｌｓ：Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ　ｗａｓ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｆｏｒ　ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ　ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ—ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ａｌｋａｌｏｉｄ　ｉｎ　Ｐｈｅｌｌｏｄｅｎｄｒｏｎ　ａｍｕｒｅｎｓｅ．Ｔｈｅ　ｅｆｒｅｃｔ　ｏｆ　ｅｎｚｙｍｅ　ｄｏｓａｇｅ，ｐＨ，ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｔｉｍｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｅｘ－　ｔｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ａｌｋａｌｏｉｄ　ｉｎ　Ｐｈｅｌｌｏｄｅｎｄｒｏｎ　ａｍｕｒｅｎｓｅ　ｗｅｒｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ａｓ　ｆｏｌ—　ｌｏｗｓ：Ｔｈｅ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｄｏｓａｇｅ　ｂｙ　０．９％，ｐＨ４．５，ｔｈｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｏｆ　２．５ｈ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏｆ　３５ｃＣ，Ｂｙ　ｔｈｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｒａ—　ｔｉｏ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　２７％．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ—ａｓｓｉｓｔｅｄ　ａｎｄ　Ｒｅｆｌｕｅｎｃｅ—Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｉｓ　ｗｏｒｋａｂｌｅ，ｗｈｉｃｈ　ｓｈｏｕｌｄ　ｂｅ　ｓｈｏｒｔｅｄ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ａｎｄ　ｉｎｅｒｅａｓｅｄ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ａｌｋａｌｏｉｄ．Ｉｔ　ｉＳ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｉｚｅｄ　ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ—ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；Ｐｈｅｌｌｏｄｅｎｄｒｏｎ　ａｎｕｒｅｎｓｅ；ａｌｋａｌｏｉｄ；ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　

关黄柏为芸香科植物黄檗（Ｐｈｅｌｌｏｄｅｎｄｒｏｎ　ａ—　ｍｕｒｅｎｓｅ　ＲｕｐＬ．）的干燥树皮。黄柏有清热燥湿、泻火　除蒸、解毒疗疮之功效，常用作健胃、止泄、消炎药，　主治湿热泻痢，黄疽带下争”。关黄柏中的有效成分　小檗碱已广泛应用于中西医临床，常用于治疗各种　感染性疾病，近年来还用于各种心脑血管病、糖尿　病及癌症的治疗［２－５］。小檗碱的降血糖作用具有很高　的药用价值。目前关黄柏中生物碱的提取方法有酸　水提取、碱水提取、乙醇提取、酸性乙醇提取法等，　而关黄柏生物碱的酶解一乙醇回流提取的试验研究　尚未见报道，本试验以盐酸小檗碱和盐酸巴马汀的　提取率为评价指标，选用正交试验法，优化酶辅助一　回流提取关黄柏生物碱的工艺条件，以期为合理利　用关黄柏的药用资源以及制药工业的生产提供依　基金项目天津市科技攻关项目（０６ＹＦＧＰＳＨ０２９００）　作者简介林静（１９８３一），女，主管药师。硕士在读．研究方向：药理学　及天然药物化学；通信作者：周晶。Ｅ—ｒｎａｉｌ：ｚｈｏｕ１９５６２０＠１２６．ｃｏｍ。　据。　１材料与方法　１．１材料Ｗａｔｅｒｓ高效液相色谱仪（美国）；关黄柏　采自辽宁省庄河市塔岭乡，由天津医科大学药学院　张功老师鉴定为关黄柏树皮；盐酸巴马汀，盐酸小　檗碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号分别　为：１　１０７３２—２００５０６、０７３３—２００００５）；纤维素酶（ｃｅｌ—　ｌｕｌａｓｅ，滤纸酶活力５　１０９．５２　Ｕ／ｇ，购自宁夏夏盛酶工　程公司）；甲醇为色谱纯；其他试剂为分析纯。　１．２关黄柏中巴马汀和小檗碱含量测定的方法学　考察　１．２．１含量测定采用高效液相色谱法测量盐酸　小檗碱和盐酸巴马汀的含量。色谱法条件：色谱柱：　ＤＩＫＭＡ　Ｄｉａｍｏｎｄｓｉｌ　Ｃ１８柱（４．６　ｍｍｘ２５０　ｍｍ，５　ｔｚｍ）；　流动相：乙腈一０．１　ｔｏｏｌ・Ｌ　磷酸溶液（２０：８０）；流速：　１　ｍＬ・ｍｉｎ　；检测波长：３４５　ｎｍ；柱温：４０℃；进样量　为１０　ｔｚＬ。ＨＰＬＣ色谱图见图１～３。

　第３期　林静，等．酶解辅助提取关黄柏生物碱的工艺研究　３８９　０．Ｏ６　０．０５　０．ｏ４　匿ｏ．０３　警Ｏ．Ｏ２　０．０１　Ｏ．００　Ｂ　

Ａ　

—　Ａ—　

１００　２００　３００　４００　５００　６００　７００　８００　９００１　０００１　１００１　２００１　３００　时间，ｓ　Ａ．盐酸巴马汀Ｂ．盐酸小檗碱　图１标准品ＨＰＬＣ图　Ｆｉｇｌ　ＨＰＬＣ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ　ｏｆ　ｐｈｅｌｌｏｄｅｎｄｒｏｎ　ａｍｕｒｅｎｓｅ　Ｂ　

Ｌ一　１００　２ｏ０　３００　４００　５００　６００　７００　８００　９００　１　Ｏ０ｏ　ｌ　１ｏ０　１　２００　时间，ｓ　Ａ．盐酸巴马汀Ｂ．盐酸小檗碱　图２关黄柏回流样品ＨＰＬＣ图　Ｆｉｇ　２　ＨＰＬＣ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ　ｏｆ　ｒｅｆｌｕｅｎｃｅ　Ｏ．０５　０．０４　０．０３　喧　磐Ｏ．０２　０．０ｌ　Ｏ．０Ｏ　ｌ００　２００　３００　４００　５００　６００　７００　８００　９【）ｏ　ｌ　０００　ｌ１【】０　ｌ　２ｏｏ　时间／ｓ　Ａ．盐酸巴马汀Ｂ．盐酸小檗碱　图３关黄柏酶解一回流ＨＰＬＣ图　Ｆｉｇ３　ＨＰＬＣ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ　ｏｆｅｎｚｙｍａｔｉｃ－ａｓｓｉｓｔｅｄ　ａｎｄ　ｒｅｆｌｕｅｎｃｅ－　ｃｅｌｌｌＩｌｏｓｅ　１．２．２对照品溶液的制备盐酸巴马汀：精密称量　１０．１３　ｍｇ定容于１０　ｍＬ的容量瓶中，浓度为１．０１３　ｍｇ・ｍＬ－　，取１　ｍＬ母液稀释定容于１０　ｍＬ容量瓶中，　得盐酸巴马汀对照液（１０１．３　Ｉ，ｚｇ・ｍＬ－－）。盐酸小檗碱：　精密称量７．００　ｍｇ定容于１０　ｍＬ的容量瓶中，浓度　为０．７００　ｍｇ・ｍＬ～，取１　ｍＬ母液稀释定容于１０　ｍＬ　容量瓶中，得盐酸小檗碱对照液（７０．０　ｇ・ｍＬ　）。　１．２．３药材供试液的制备将关黄柏原药材粉碎，　过４０目筛，混合均匀，称取样品约０．１　ｇ，置于１００　ｍＬ　容量瓶中，加入盐酸一甲醇（１：１００）至刻度，称重，超　声处理４５　ｍｉｎ，放冷，称重，加盐酸一甲醇（１：１００）补　足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液为供试品液［６－７１。　１．２．４线性关系考察分别准确移取盐酸小檗碱　对照液４　ｍＬ、盐酸巴马汀对照液１　ｍＬ置于同一　１０　ｍＬ的容量瓶中，用甲醇定容至刻度摇匀即得对　照品混合液。然后分别取对照品混合液４、６、８、１０、　１２、１４、１６　Ｌ注入高效液相色谱仪。以标准品的含　量为横坐标（　），以峰面积为纵坐标（】，），进行线性　回归得到回归方程：盐酸巴马汀Ｙ＝４．２３￣１０６Ｘ一　１．４２　ｘｌＯ　，ｒ＝Ｏ．９９９　８，结果表明盐酸巴马汀在　０．０３８６６～０．１５５０４　Ｉ，Ｚｇ范围内线性关系良好。盐酸小　檗碱Ｙ＝３．８６ｘｌＯ６Ｘ一９．６０￣１０　，ｒ＝Ｏ．９９９　７，结果表明盐　酸小檗碱在０．１　１０　２５～０．４３９　９１　Ｉ－Ｌｇ范围内线性关系　良好。　１．２．５精密度试验取对照品溶液１０　，分别连　续进样６次，测定峰面积，计算。盐酸巴马汀和盐酸　小檗碱峰面积的相对标准差（ＲＳＤ）分别为０．７５％和　０．８５％。　１．２．６重现性试验取同一批样品６份，每份约　０．１　ｇ，按“１．２．３项下”制备药材供试液，并在２．１．１　色谱条件下进行测定和依据回归方程计算，巴马汀　和小檗碱含量的ＲＳＤ分别为０．５３％和０．５２％，表明　方法重现性良好。　１．２．７稳定性试验称取同一批样品６份，每份约　０．１　ｇ，按“１．２．３项下”制备药材供试液，并于０、２、４、　６、８、１０、１２、２４　ｈ分别进样，测定峰面积。巴马汀和　小檗碱峰面积的ＲＳＤ分别为０．６９％和０．６３％，表明　样品在２４　ｈ内稳定性良好。　１．２．８加样回收率试验精密称取已测含量的样　品９份，每份约０．２５　ｇ，准确加人对照品适量，按　“１．２．３项下”方法提取，并在１．２．１色谱条件下测定　巴马汀和小檗碱，依据回归方程计算两种生物碱的　含量，依据下列公式计算回收率，结果见表１。　回收率：　竖×１００％　表１加样回收率试验　Ｔａｂ　１　Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｔｅｓｔ　

１．３关黄柏总生物碱酶解辅助提取方法研究　１－３．１纤维素酶液的配制　准确称取５００　ｍｇ纤维　∞　叭　∞　Ｏ　Ｏ　Ｏ　Ｏ　０　Ｏ　鼷阻彗　３９０　天津医科大学学报　第１８卷　素酶，用ｐＨ４．５的蒸馏水溶解后定容至１００　ｍＬ容　量瓶中，此酶液浓度为５　ｍｇ／ｍＬ，经滤纸酶活力法测　定纤维素酶活力为：５　１０９．５２　Ｕ／ｇ。　１．３．２酶辅助提取小檗碱和盐酸巴马汀工艺优选　根据单因素探索性试验考察结果，确定了纤维素酶　用量（Ａ），酶解温度（Ｂ），酶解ｐＨ值（Ｃ），酶解时间　（Ｄ）４个考察因素。根据单因素试验的最佳水平考　察，确定了每个单因素的３个水平，见表２。以巴马　汀和小檗碱生物碱总提取率为指标，选用Ｌ９（３４）正　交试验分析，设计因素水平表，按经过前期初步筛　选优化的提取条件，即８倍量７５％乙醇一Ｈ２ＳＯ　（１００：　０－３）回流３次，每次１．５　ｈ，进行试验。　提取，率一　ｘｌ　对试验结果做直观分析，由各因素的极差值Ｒ，　确定最佳提取工艺，并用方差分析评价各因素水平　表对提取工艺影响的显著性。　表２正交试验因素水平　Ｔａｂ　２　Ｔｈｅ如　ｒ　ａｎｄ　ｌｅｖｅｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ