第二章 生物酶解技术

某些物质能使酶的活性增强，成为酶
的激活剂，某些物质能使酶的活性降
低，成为酶的抑制剂。
再如一些金属螯合剂如EDTA（乙二胺
四乙酸）等能除去重金属离子对酶的
抑制作用，也可视为酶的激活剂。
5. 激活剂对酶反应速度的影响
激活剂：能提高酶活性的物质。 主要的激活剂有： 无机离子： 主要是金属离子，它们有的本身就
第二章 生物酶解技术
细胞壁的层次
生物酶解技术在中药提取 中的应用
胞间层（中层）(middle lamella):果胶类物质组成， 具强的亲水性和可塑性。 初生壁(primary wall)： 细胞生长过程中，原生质 分泌，有纤维素、半纤维 素和果胶，还含有酶和糖 蛋白。 次生壁(secondary wall)： 细胞停止生长，原生质产 生的壁物质沉积在初生壁 内侧。由纤维素、半纤维 素和木质素构成。分内层 (S3)、中层(S2 )和外层S1 )。
2. pH对酶反应速度的影响
pH对酶反应速度的影响较大。其原因有：
pH影响酶分子解离状态。
pH影响底物的解离，从而影响酶与 底物的结合。 极端pH的条件引起酶蛋白的变性。 每种酶只能在一定的pH范围内表现出它 的活性，且在某一pH值范围内活性最高， 其两侧活性都下降。∴ 酶促反应具有一最 适pH。
以70%乙醇为空白参比,10min后用1cm比色 皿于510nm测定吸光度,得芦丁的回归方程: Y=0.0749A+0.0022(R2=0.9961)。 苦荞茎总黄酮的测定:准确称取2.50g苦荞茎 叶粉,于250mL三角瓶中,加入50mL水,按试验 设置的处理条件,在不同的加酶量、酶解温度 和pH值条件下,酶解不同的时间,然后升温至 90℃提取,离心去沉淀,用70%乙醇定容至 200mL,作为待测液。取3mL待测液于50mL 量瓶中,按照标准曲线的制备项下方法测定吸 光度,计算总黄酮的质量,并计算总黄酮得率 (总黄酮得率=提取液中总黄酮质量/苦荞茎叶 粉质量×100%)。
对于简单的酶反应，当酶浓度和其他条件恒定时：
v
Vmax
零级反应 混合级反应
该曲线可以用 米氏方程 来描述
一级反应
0
[S]
4.酶浓度对酶反应速度的影响 在一般的酶促反应中，常常[S]>>[E]，酶反应 速度达到最大反应速度。
当[S]>>[E]，由于Vmax=k[E]0，∴反应速度与酶 浓度成正比。
酶 浓 度 曲 线
2.复合酶的作用
由于植物组织细胞壁的多样性，有时采用 复合酶，但由于复合酶的作用广泛应考虑 对有效成分的多重影响。 有效成分含量明显超过单一酶 复合酶 综合作用 有效成分含量低于单一酶
复合酶解法提取三七皂苷结果比较
提取方法 皂苷含量(%) 平均
纤维素酶解法 9.46 8. 78 9.46 9.23 果胶酶酶解法 8.90 8.64 9.16 8.90 复合酶解法 11.26 11.38 10.97 11.17
是酶的辅助因子，有的是酶的辅助因子
的必要成分。 如: 激酶需要Mg2+激活
唾液淀粉酶需要Cl-激活
5. 激活剂对酶反应速度的影响
有机小分子： 一些还原剂，如抗坏血酸、半胱氨
酸，使含-SH的酶处于还原态
金属螯合剂，如 EDTA( 乙二胺四乙
酸 ) ，可络合一些重金属杂质，解除它
们对酶的抑制，从而使酶活升高。
第五节 酶解技术在中药提取中的应用
一、酶解技术在中药成分提取中的应用 （一）多糖 实例2.甘草多糖的酶辅助提取 运用正交设计法设计酶法提取工艺，采用 分光光度法测定多糖含量。【结果】酶法 提取甘草多糖的最佳工艺是温度40℃、pH 值5.0、加酶量5g•kg(-1)、提取时间5h。提 取率3.29%酶法提取甘草多糖速度快，提取 率高。
三、酶解技术在中药提取液精制与纯化的应用
中药水提液含有多种类型的杂质，如淀 粉、蛋白质、鞣质、果胶等。采用常规提 取法时，煎煮过程中药材里的蛋白质遇热 凝固、淀粉糊化，影响有效成分煎出，分 离困难。针对中药水提液中所含的杂质类 型，采用相应酶将其降解为小分子物质或 分解除去，可解决上述问题，并改善中药 口服液、药酒等液体制剂的澄清度，提高 成品质量。
酶解优点
4.
提高提取率
3.
加速有效成分释放
2.
将植物组织温和分解
1.
选用纤维素酶
第 四节 生物酶解辅助提取条件优选
一、酶辅助提取条件的优选 植物根茎类药材——纤维素酶 种子药材——纤维素酶、半纤维素酶 花类、果类——选用果胶酶 动物药材——蛋白酶
（一）酶的种类
1.酶对有效成分的影响 催化水解酶(纤维素酶）对苷类药材的影响P48
多糖的酶及超声联合提取
采用正交试验,优化玉米须多糖的酶及超 声提取方案,并研究这两种方案的结合效果.结 果三种提取工艺中联合提取多糖得率最高,酶辅 助提取次之,超声提取最低.结论联合提取是一 条高效的提取路线. 方法 超声 酶法 时间（min) 20 170 多糖含量 % 2.878 5.697 酶法-超声 190 7.720
总黄酮的UV法测定法
标准曲线的制备:将芦丁于120℃烘箱中烘 于干燥器中冷,却后称至恒重，称取50mg用 70%乙醇溶解,定容至250mL,得0.200mg/mL 芦丁对照品溶液。准确吸取芦丁对照品溶液 0、3.0、6.0、9.0、12.0、15.0mL于50mL量 瓶中,加入5%NaNO2溶液15mL,摇匀,放置 6min后加入10%Al(NO3)3溶液15mL,摇匀,放 置6min后加入4%NaOH溶液20mL,再用70% 乙醇定容,摇匀,
由表中可知，各因素对提取效果的影响顺 序依次为A＞B ＞ C即酶解温度酶解时间达 到极显著水平（P0.05）最佳工艺组合为 A2B2C3
直接水提和酶法水提效果比较
在酶解辅助提取过程中，酶的种类、酶解温度，酶解 时间及酸碱度各因素的影响不是孤立的，而是相互影 响的，所以要在单因素考查的基础上，通过正交试验 综合考虑，以获得更好酶解提取效果。
（二）酶解温度
温度升高加速化学反应
但酶的本质是（ 范围（ 度范围内活性随（ 过实验考查来确定。 ）所以温度超过一定 )升高而（ ）。 ）所以对同一种酶在一定温
对于对不同药材酶的最适合的温度可以通
方法
实例1.苦荞茎叶粉中总黄酮酶法提取工艺研究
固定酶的用量，作用时间，酶解液的PH值 等相同的条件，将酶解液分成若干份，分 别控制不同的温度进行酶解反应，测定代 表性的有效成分为考查指标，根据含量多 少确定最合适的酶解温度
反应速度和pH的关系见下图：
2. pH对酶反应速度的影响
酶的最适pH一般在7左右。也有很多例外，如胃蛋白 酶 的 最 适 pH 只 有 1.5 ， 木 瓜 蛋 白 酶 (5.6) ， 胰 蛋 白 酶 (7.8) 。酶的最适 pH 并非酶的特征性常数，它与底物的 种类、浓度等因素有关。
3.底物浓度的影响
3. 酶的比活力
指每毫克酶蛋白所含的酶活力单位数
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比活力 ＝
酶活力单位数（U） 酶蛋白质量（mg）
比活力是酶制剂纯度的常用指标 —— 比活力越大，表示酶越纯
三、影响酶活性的因素
酶解提取中药有效成分，均有较高收 率，具有较大应用潜力，但该技术也 存在着局限性。酶法提取对生产条件 要求较高，为使酶发挥最大作用，并 将其用于工业化时，必须综合考虑酶 的浓度和底物浓度，温度，pH，作用 时间等对提取物的影响。
酶的催化效率是无机催 化剂的107 ~1013 倍 每一种酶只能催化一种 或一类的化学反应 酶所催化的反应一般是 在比较温和的条件下进 行的。
酶的作用条 件较温和
二、酶活力与酶单位
酶活力:是酶促反应的能力。酶活力大
小就是指在一定条件所催化的某一化
学反应速度的快慢，即酶催化的反应
速度越快，酶活力越高，反之则表示 该酶活力低。
验证试验:按原醇提取工艺进行3次试验,同时根据 正交试验优选结果对酶解工艺进行3次重复试验,结果 见表3。可见,两工艺重现性良好,但是加酶工艺比不加 酶收率提高了3.92%。
同样酶解技术可以用于提取黄酮类，皂苷 类，苯丙素类，有机酸类，蛋白质类，挥 发油。
二、酶解技术在中药成分转化中的应用 研究证明,白藜芦醇具有抗菌、抗癌、抗炎、抗过 敏、降血脂和抗氧化等多方面的药理活性,是目前 研究较热门而有希望的抗癌药剂之一。 白藜芦醇在虎杖中主要以苷的形式存在,因此, 作者考虑将白藜芦醇苷转化成白藜芦醇苷元,这将 大大提高白藜芦醇的得率。（虎杖提取用乙醇）
单因素考查法（一）温度
（二）酶用量
酶解温度55，pH6.5酶解2小时纤维素酶
（三）酸碱度
固定纤维素酶的量，酶解温度，时间2h， 考查pH影响。
（四）酶解时间
固定：纤维素酶量，酶解温度55pH6.5考查 不同时间
二、酶解技术的工艺设计
实例1.苦荞茎叶粉中总黄酮酶法提取工艺研究 1.酶解液黄酮成分测定 2.正交实验设计
细胞壁的化学组成
纤维素(cellulose): 由葡萄糖分子串联而成。 结构单位：微团(micelle) 、微纤丝(microfibre) 、 大纤丝(macrofibre) 纤维素的网络结构中交联半纤维素和果胶类物质。
第一节 概述
目前，生物酶技术在现代中药提取中正展
示着其独特的优势，引起了许多企业和科 研单位的关注，并已经开始了在这一领域 的探索和应用。世界上广泛开展了有关酶 的性质的研究，至今已从动物，植物中发 现了两千多种酶，并有两百多种酶已得到 结晶。
6. 抑制剂对酶反应速度的影响 抑制作用：有些物质与酶结合后，引起酶的活 性中心或必需基团的化学性质发生改变，
从而使酶活力降低或丧失。
第三节 生物酶辅助提取中药成分的机制
原理
酶解破壁
纤维素酶 解提取
有效成分的提取
内切葡聚糖酶 纤维素酶 纤维素二糖水解酶 β-葡萄糖苷酶 β甘露聚糖酶 半纤维素酶 β-木聚糖酶 β-葡萄糖苷酶 β-甘露糖苷酶 β-木聚糖苷酶 果胶酶 聚α-1,4半乳糖醛酸的聚糖水解酶 果胶质酰基水解酶
1. 采用纤维素酶解法新工艺提取虎杖 中白藜芦醇。即在乙醇提取前,先用纤维 素酶处理虎杖粗粉。通过实验确定最佳 的提取工艺条件为:提取温度50℃,酶解 pH值5.0,酶解时间90min,纤维素酶与虎
杖粗粉配比为1∶500。与传统醇提工艺
相比,提取率提高了近5倍。
2.人参的有效成分为皂苷类，其中在红参与野 山参中仅为十万分之几的人参皂苷Rh2等稀有 成分，对肿瘤细胞具有凋亡等作用，对人体无 毒且具有较高的保健功能。但人参皂苷Rh2结 构复杂，以化学方法制备的难度高、污染大、 收率低。金凤燮采用皂苷酶处理人参中常见组 分Rb、Rc、Rd等二醇类皂苷生产Rh2等稀有 皂苷。酶处理生产Rh2等的转化率在60％以上， 比从红参中直接提取提高了500～700倍。
1. 温度对酶反应速度的影响
温度对酶反应速度的影响具有双重性：
随着温度的升高，反应速度会加快 随着温度的升高，酶蛋白会失 活，使反应速度下降
因此，在这双重因素的综合作用
下，酶促反应具有一最适温度。
四. 温度对酶反应速度的影响
不同酶的最适温度也不一样。动物酶的最适温度 一般在35~40℃，植物酶为40~50℃。 酶的最适温度并非酶的特征性常数，它与底物、作 用时间等因素有关。
一、 酶的概念
酶的概念—酶是由生物细胞产生的以蛋白质
为主要成分的生物催化剂。
生物体内的反应是在很温和的条件（
如温和的温度、接近中性的pH）下进
行的，而同样的反应若
在非生物条件下进行，则需要高温、
高压、强酸、强碱等剧烈的条件。
第二节酶反应的特点与影响酶活性的因素
一、酶反应的特点 酶的高效性 酶的专一性
（二）生物碱
生物碱一般采取方法？ 酶法辅助提取率比传统方法显著增加，生 物碱结构无（ )键， 不存在被酶水解问题。 实例3.贝母生物碱酶 辅助提取工艺研究 （1）酶解条件单因素 考查
（2）酶解条件正交试验
温度
pH
由极差分析得到各因素对提取效果的影响度:A>D>B>C, 由此可见,酶解温度为主要因素,酶解时间为次要因素,其 次是pH值,而酶用量的影响最小。因此得到最佳提取条件: 提取温度为60℃,pH值为45,酶用量为2.5g/L,提取时3.5h
1. 酶活力概念
酶的定量并非对其蛋白质进行定量， 而是对它的催化能力进行定量。
所以，酶的定量就是测定酶的活力，
也即测定酶促反应的速度。
2. 酶活力与单位
A.国际单位 (U)
这种单位是由国际酶学委员会规定的。 在标准条件(25℃、最适pH、最适底物浓度)下， 酶每分钟催化 1 mmol 底物转化，这样的速度所代 表的酶的活力即酶的量定义为1个国际单位 (IU)。