大豆蛋白的提取及与含量测定

2011年4月 The Chinese Journal of Process Engineering Apr. 2011收稿日期：2010−12−13，修回日期：2011−03−09基金项目：国家水体污染控制与治理科技重大专项基金资助项目(编号2008ZX07207-003-3)作者简介：高建萍(1987−)，女，山东省潍坊市人，硕士研究生，主要研究方向为蛋白质分离纯化；通讯联系人，张贵锋，E-mail: gfzhang@,王明林，E-mail: mlwang@.多级逆流固液提取技术提取大豆分离蛋白高建萍1,2， 刘 琳1， 张贵锋2， 王明林1， 黄永东2， 刘永东2， 苏志国2(1. 山东农业大学食品科学与工程学院，山东 泰安 271018；2. 中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京 100190)摘 要：采用液相色谱和生物质谱技术对豆粕中不同蛋白质在提取过程中的释放行为进行了研究，并将多级逆流固液提取技术用于大豆分离蛋白提取. 结果表明，豆粕中的2S 组分由于分子量低和高水溶性在提取过程中释放速率较快，提取2次总释放量超过80%, 3次提取7S 和11S 组分总释放量约为69%，提高固相和液相间7S 和11S 的浓度梯度或延长提取时间有助于7S 和11S 组分释放. 采用该提取技术可提高提取液中的总蛋白浓度，在相同蛋白质收率下可节水11%，同时较高的蛋白质浓度可增加酸沉过程中蛋白质收率.关键词：大豆分离蛋白；高效液相色谱−质谱联用技术；蛋白质识别；释放；多级逆流固液提取 中图分类号：X522 文献标识码：A 文章编号：1009−606X(2011)02−0312−061 前 言大豆分离蛋白(Soybean Protein Isolate, SPI)是从脱脂豆粕中提取的一种植物蛋白，总蛋白质含量超过90%，良好的保水性、乳化性、吸油性和凝胶性等使其广泛用作食品添加剂和食品原料[1]. 大豆中的蛋白质根据离心过程中的沉降系数可分为2S, 7S (Conglycinin), 11S (Glycinin)和15S 四种组分，所占比例约为9.4%, 34%, 42%, 4.6%[2,3]. 7S 组分中主要是7S 球蛋白(β-Conglycinin)，是由α(70.6 kDa), α′(80.2 kDa), β(48.4 kDa)三种亚基组成的三聚体结构糖蛋白，分子量约为180 kDa ，等电点5.2∼6.2[1,4,5]. 11S 组分中主要是11S 球蛋白，是一种由6个亚基对组成的多聚亚基蛋白，分子量320∼380 kDa ，每个亚基对由1个酸性亚基和1个碱性亚基通过二硫键连接而成，等电点为4.6[6,7]. 7S 和11S 组分的含量是影响SPI 功能特性的关键因素.目前，我国普遍采用的SPI 提取工艺属碱溶酸沉工艺，即豆粕经pH 7.8 (NaOH 调节)的水溶液浸提后离心去除不溶物，提取液经酸沉处理后再进行离心以分离出凝乳，凝乳经水洗、中和后直接进行喷雾干燥，获得SPI 粉[8,9]，提取液去除凝乳后获得的乳清水属高浓度有机废水. 豆粕中蛋白质的提取多采用传统的罐式提取，存在用水量大、7S 和11S 组分提取率低等缺陷. 提取1 t SPI 需用豆粕约2.4 t ，用水量超过29 t ，产生24 t 高浓度乳清废水(COD>20%)；此外，低提取率导致豆渣中7S 和11S 残留量高，亚基解离导致SPI 性能降低. 因此，研究新型SPI 提取工艺以降低用水量并提高7S 和11S 组分收率具有重要的现实意义. 多级逆流固液提取 (Multi-stage countercurrent solid −liquid extraction)技术是固相物料和溶剂运动方向相反、连续定量加入固相物料和溶剂、导出残留物和提取液的连续分离技术[10,11]. 根据提取设备差异，多级逆流固液提取工艺可分为罐组式、连通器式、螺旋式及离心式等多种形式. 在多级逆流固液提取过程中不同部位的溶剂存在浓度梯度，增加了溶剂和固相物料间的浓度差异，从而加快了目标物释放速率并获得较高的提取液浓度[12]. 多级逆流固液提取技术由于溶剂用量少、提取时间短和生产效率高等优点[13]，近年来在食品、中药、天然产物等领域中的应用日益增多.针对SPI 提取过程中存在的用水量大、7S 和11S 提取率低并导致高浓度有机废水产生量大等共性问题，本研究以蛋白质释放行为研究为基础，比较了不同条件下蛋白质的释放速率差异，研究了多级逆流固液提取技术用于提取大豆分离蛋白以降低用水量的可行性.2 材料与方法2.1 材料与试剂脱脂豆粕由大庆日月星公司提供，胰蛋白酶(序列纯)购自美国Promega 公司，三氟乙酸(TFA)和乙腈购自美国Fisher 公司，其他试剂均为市售分析纯. 2.2 仪器高效液相色谱−质谱联用系统(HPLC −MS)由美国Agilent 公司1100液相色谱和美国Thermo Fisher 公司LCQ Deca XP 电喷雾质谱组成，数据采集与处理软件为Xcalibur 1.3，数据分析软件为Biowork 3.1(含Turbosequest), Ultrospec 2000紫外分光光度计(瑞典Pharmacia 公司).2.3 实验方法2.3.1 蛋白质释放过程分析称取100 g 豆粕，加入800 mL pH 7.8的NaOH 溶液，50℃摇床中连续振荡10 min ，快速抽滤，收集滤液；向残余豆粕中加入400 mL pH 7.8的NaOH 溶液，重复上述过程4次. 将收集到的滤液离心(10000 r/min, 5 min)，上清液用HPLC 分离，收集分离出的各色谱峰，酶解后进行液质联用分析以进行蛋白质识别；通过HPLC 各色谱峰面积研究不同蛋白质释放过程.将上述实验获得的蛋白质提取液合并，调节pH 值至4.5，冷却至4~6℃，以10000 r/min 离心5 min ，收集上清液，酶解处理后用液质联用技术进行蛋白质种类分析.2.3.2 多级逆流固液提取实验多级逆流固液提取工艺实验装置系统图见图1. 在提取过程中清水从右向左移动，豆粕相对于提取液从左向右移动，整体上豆粕与提取液运动方向相反，其中S 0为新鲜豆粕，S 1, S 2和S 3分别为提取一、二和三次后的豆粕，W 为清水，提取液E 1为豆粕S 2与清水混合后的提取液，提取液E 2为豆粕S 1与E 1混合后的提取液，提取液E 3为新鲜豆粕S 0与E 2混合后的提取液. 多级逆流固液萃取实验启动时3个提取罐装满水溶液，向第1个罐中加入新鲜豆粕，连续搅拌并离心分离，洗涤后的豆粕依次导入第2和第3个提取罐直至稳态操作；在稳态多级逆流固液萃取过程中，清水W 与提取过2次的豆粕S 2均匀混合，通过旋流分离器分离后产生的豆粕残渣S 3不再使用，产生的提取液为一次蛋白提取溶液E 1；该提取液与提取过1次的豆粕S 1混合均匀，连续离心后的豆粕残渣为2次提取的残渣S 2，产生的提取液为二次蛋白提取溶液E 2；该提取液与新鲜的豆粕S 0均匀混合，连续离心后产生豆粕残渣S 1，产生的提取液为3次蛋白提取溶液E 3.图1 多级逆流固液提取实验装置系统图Fig.1 Schematic diagram of experimental apparatus for multi-stage countercurrent solid −liquid extraction2.4 分析方法 2.4.1 蛋白质含量测定蛋白质含量测定采用福林酚法. 2.4.2 凝胶过滤色谱分析大豆蛋白提取溶液用凝胶过滤色谱法(HPSEC)分析，色谱柱为TSK3000SW[300 mm×7.5 mm (I.D.), 10 µm]，流动相为0.02 mol/L 磷酸缓冲液(pH 7.0)，流速0.4 mL/min ，检测波长280 nm ，进样量10 µL. 2.4.3 HPLC 分析大豆蛋白提取溶液用去离子水稀释后用HPLC 分析，色谱条件：色谱柱Zorbax 300 SB C 18[250 mm×4.6 mm (I.D.), 5 µm]，流动相A 为水(含0.1% TFA)，流动相B 为乙腈(含0.1% TFA)，梯度：0~45 min 5%~60% B ，45~50 min 60%~90% B ，流速0.75 mL/min ，波长280 nm. 2.4.4 酶解方法将上节分离出的色谱峰在100℃下热变性处理10 min ，真空干燥，然后溶于200 µL 0.05 mol/L NH 4HCO 3溶液(pH 8.0)中，加入50 µg 胰蛋白酶[溶于50 µL 0.05mol/L NH 4HCO 3 (pH 8.0)中]，混合均匀后于37℃恒温8 h ，酶解产物直接进行HPLC −MS 分析. 蛋白质提取液经酸沉淀处理后的上清液于100℃下热变性处理10 min ，将pH 值调至8.0后加入胰蛋白酶，酶解条件同上. 2.4.5 HPLC −MS 分析色谱柱为Zorbax SB C 18[150 mm×2.1 mm (I.D.), 5 µm]；流动相A 为水(含0.1% TFA), B 为乙腈(含0.1% TFA)；梯度0~80 min 10%~90% B ，进样量30 µL. 质谱条件：离子源喷雾电压4.5 kV ，毛细管温度300℃，扫描范围m /z 300~2000. 精确质量数扫描和二级质谱扫描(MS/MS)均为数据依赖型扫描，MS/MS 碰撞能量为35%. 质谱数据用Turbosequest 软件进行检索，数据库为从Swiss-Prot 下载的包括大豆中已发现的全部蛋白质的氨基酸序列.3 结果与讨论3.1 豆粕提取液中蛋白质种类识别采用HPLC对豆粕提取液及其后续处理样品进行S 0. Fresh soybean mealS 1, S 2, S 3. Soybean meal after extraction byone, two and three timesW. Fresh waterE 1. Supernatant from the mixture of W with S 2E 2. Supernatant from the mixture of E 1 with S 1E 3. Supernatant from the mixture of E 2 with S 01. Extraction container 2. Pump3. Cyclone separator分析. 图2是豆粕提取液、经酸沉处理乳清废水和沉淀物重新溶解后的HPLC 图谱，可见豆粕提取液中不同种类成分的保留时间分布范围较宽，乳清废水中主要成分集中在23 min 以前，而沉淀物的保留时间主要集中在24 min 以后. 大豆中蛋白质主要是2S, 7S, 11S 和15S 组分，其中2S 中主要是蛋白酶抑制剂类及细胞色素C, 7S 中主要是球蛋白和少量的血球凝集素、脂肪氧化酶及β-淀粉酶，11S 中主要是球蛋白. 大豆中蛋白质分子量范围较宽，许多蛋白质以多聚亚基形式存在. 这些多亚基蛋白在提取过程中可能发生解离或聚集，且不同蛋白质组分及其亚基的等电点、分子量和亲疏水性不同.图2 豆粕提取液、乳清废水和沉淀物的HPLC 分析图谱 Fig.2 HPLC chromatograms of extraction solutions of soybeanmeal, supernatant and precipitation precipitate收集图2中不同保留时间的色谱峰，酶解产物用HPLC −MS 进行分析，质谱数据用Turbosequest 软件进行数据库检索以识别每个色谱峰中的蛋白质种类. 图3(a)是提取的上清液中保留时间为35.4 min 的色谱峰经胰蛋白酶处理后的总离子流图，表明酶解产物存在离子m /z 575.6；精确质量数扫描图谱表明离子m /z 575.6带双电荷[图3(c)]，该离子对应的多肽在图3(a)中的保留时间为15.1 min ，数据库检索表明该离子对应的多肽序列为VFDGELQEGR ，存在于11S 球蛋白G1 (A1aBx)亚基序列中，表明图2(a)保留时间为35.4 min 的色谱峰中存在11S 球蛋白. 确定了大豆中主要蛋白质在色谱图中的保留时间，其中2S 组分蛋白质主要分布于20 min 以前的色谱峰；保留时间为23 min 的色谱峰中检测出11S 球蛋白的碱性亚基和2S 中的Kunitz-trypsin Inhibitor (KTI)蛋白；保留时间为24.3 min 的色谱峰中主要是7S 的α亚基和11S 的A5A4B3亚基等；保留时间为24~36 min 的是完整的7S 和11S 球蛋白及发生部分解离的7S 和11S 球蛋白.图3 图2中保留时间为35.4 min 的色谱峰酶解产物的色谱−质谱分析Fig.3 HPLC −MS analysis of the digested chromatographic peakin 35.4 min of retaining time [(a) total ion, (b) peak in 15.1 min of retaining time, (c) zoom scan, m /z 575.3 and (d) MS/MS spectrum, m /z 575.3]反相色谱主要根据样品极性进行分离，但样品分子量超过一定范围时其保留时间随分子量增加而延长. 从整体上分析，大豆内丰度较高的4类蛋白质组分中2S 组分的分子量较小，较易分散于水溶液中，在色谱图中的整体保留时间较短. 7S 和11S 中的球蛋白均属多亚基蛋白质，图2中有些色谱峰中只检测出了7S 和11S 球蛋白的部分亚基，表明在提取过程中存在多亚基球蛋白的亚基解离. 24 min 之后的色谱峰中可检测出7S 和11S 的全部亚基，表明这些色谱峰中主要是完整的7S 和11S 球蛋白. 文献[14]报道15S 组分较难溶于溶液而残留于粕渣中.3.2 大豆中蛋白质的释放行为为比较豆粕中不同组分的释放行为，重点以2S 组分及7S 和11S 球蛋白为指标，考察了不同提取条件下提取液中各组分相对含量的变化. 图4是不同提取次数所得豆粕提取液的HPLC 图谱. 从图可以看出，随提取次数增加，上清液中2S 组分(保留时间为14.98~20 min)含量逐渐降低，保留时间为23 min 的色谱峰中存在11S 球蛋白的碱性亚基和2S 中的KTI ，该色谱峰面积随提取次数增加逐渐降低，HPLC −MS/MS 分析结果表明，提取2次后该色谱峰中主要是11S 球蛋白的碱性亚基，而2S 中的KTI 含量较低，表明2S 组分具有较快的释放速率. 含7S 和11S 球蛋白的各色谱峰(保留时间为24.67, 29.7和36.2 min)面积变化趋势表明，随提取次数逐渐增加，上清液中7S 和11S 球蛋白所占比例逐渐增加. 用HPSEC 对不同提取次数的上清液进行了分析，图5表明，随提取次数增加，提取液中高分子量组分增加，与HPLC −MS 和反相色谱分析结果一致.05010005010001020304005010035.3929.6223.0720.7014.623.90(a) Soybean meal (b) SupernatantR e l a t i v e a b s o r b a n c e 36.1424.3122.9720.0613.7010.535.2635.3929.6424.8020.0713.6110.534.22(c) PrecipitationprecipitateTime (min)01020304050050100150600800100012001400050100572574576578580501002004006008001000050100(a)45.5043.0139.0937.6527.8823.0520.1911.196.01R e l a t i v e a b u n d a n c eTime (min)(b)1149.6955.5697.0667.5575.6(c)578.7576.7575.7575.3573.0571.3(d)904.3903.3788.4602.2525.9489.2361.1246.8m /z图4 提取一次、三次和五次的豆粕提取液HPLC 图谱 图5 提取一次、二次和三次的豆粕提取液HPSEC 图谱Fig.4 HPLC chromatograms of protein solutions extracted Fig.5 HPSEC chromatograms of protein solutions extractedonce, thrice and five times from soybean meal once, twice and thrice from soybean meal以二级质谱中检测出的目标多肽对应的一级质谱峰面积计算不同种类蛋白质在提取过程中的动态变化. 图6是以提取液中KTI 、亚基A5A4B3和α亚基的多肽峰面积代表的2S, 7S 和11S 组分在提取过程中的相对释放量随提取次数的变化. 2S 组分在第1次提取时的相对释放量高达55%左右，提取2次时相对释放量超过80%，分子量较高的7S 和11S 组分的相对释放量较2S 组分低，4次提取总释放量不足90%. 可见，7S 和11S 组分由于释放速率低于2S 组分，其提取过程需更长的时间；此外，在提取过程中增加豆粕与提取液之间7S 和11S 的浓度梯度有利于提高其释放速率，释放出的高分子量组分及时移出有助于增加豆粕与提取液之间的浓度梯度并提高豆粕中7S 和11S 组分的释放量.图6 大豆蛋白质提取过程中2S 组分中KTI, 11S 组分中的A5A4B3亚基和7S 球蛋白中的α亚基释放量动态变化 Fig.6 Relative release rate of KTI of 2S fraction, A5A4B3 subunitof 11S fraction and α subunit of β-conglycinin of 7S fraction in extraction of proteins from soybean meal3.3 多级逆流固液提取利用多级逆流固液提取法提取了大豆分离蛋白，研究了不同固液比下豆粕中蛋白质释放过程、总蛋白释放量、提取液中不同蛋白质相对含量及所制大豆分离蛋白的分子量范围.图7是固液比为1:10 g/mL 和单级停留时间为6 min 条件下不同提取级数蛋白提取液的HPLC 和HPSEC 图谱. 由于2S 等低分子量蛋白经2次提取后释放较完全，豆粕S 2中残留的蛋白质主要是7S 和11S 蛋白，E 1曲线表明保留时间为29 min 的组分所占比例较高，因此提取液E 1中7S 和11S 组分所占比例较高；HPSEC 图谱中保留时间为13.43 min 的色谱峰强度较高也表明提取液E 1中主要是分子量较高的蛋白质[图7(b)]，该结果与7S 和11S 组分释放行为研究结果(图4)一致. S 1与E 1充分混合后S 1中的7S 和11S 组分继续释放，提取液E 2中7S 和11S 组分绝对含量增加. 同时，图7中提取液E 2中低分子量的组分含量也有所升高，原因在于第1次提取过程中未完全释放的2S 组分由于溶出速率高于7S 和11S 组分，相对比例逐渐增加. 在多级逆流固液提取过程中，不同提取级数中2S, 11S 和7S 组分的相对释放量的动态变化见图8，与图7结果一致.在多级逆流固液提取过程中，随提取次数增加豆粕中蛋白组分由左向右逐渐被释放，由于大豆蛋白中不同蛋白组分释放行为的差异，7S 和11S 组分从E 3到E 1的相对比例逐渐增加，从E 1到E 3逐级提取后7S 和11S 绝对含量逐渐升高. 实验比较了基于多级逆流法提取和传统提取过程获得的蛋白质溶液中7S 和11S 所占比例，结果表明多级逆流固液提取法获得的蛋白质溶液中7S 和11S 所占比例提高了8%. 可见在多级逆流固液提取过程中豆粕S 0经1次提取后仍有大量未完全释放的7S 和11S 组分，在第2次和第3次提取时释放量较大，从而提高了蛋白提取液中7S 和11S 组分的比例，这对增加SPI 中高分子量组分相对含量并改善SPI 功能特性十分关键.5010005010001020304005010036.0729.5419.9622.9919.365.34(a) OnceR e l a t i v e a b s o r b a n c e35.3429.5723.0220.0214.573.85(b) Thrice 41.0634.2629.5823.0020.0313.694.24(c) Five times Time (min)0501000501000102030405005010035.3124.9113.49(a) OnceR e l a t i v e a b s o r b a n c e 29.9435.3528.7616.6413.45(b) Twice46.4128.7519.1513.40(c) ThriceTime (min)1234530405060708090100R e l a t i v e r e l e a s e r a t e (%)Extraction times图7 多级逆流固液提取过程中不同提取级数豆粕提取液的HPLC 图谱和HPSEC 图谱Fig.7 HPLC and HPSEC chromatograms of protein solutions during multi-stage countercurrent solid −liquid extraction图8 多级逆流固液提取过程中不同提取级数的提取液中2S组分中KTI 和11S 组分中A5A4B3亚基、7S 球蛋白中 的α亚基释放量的动态变化Fig.8 Relative release rate of KTI of 2S fraction, A5A4B3subunit of 11S fraction and α subunit of β-conglycinin of 7S fraction in three extraction stages during multi-stage countercurrent solid −liquid extraction实验采用福林酚法测定了多级逆流固液提取大豆分离蛋白提取液中的蛋白质浓度，进行3次多级逆流平行实验. 豆粕中蛋白质含量为55%，多级逆流固液提取工艺中大豆分离蛋白的提取率为77.6%，而目前工业上每生产1 t 大豆蛋白粉需2.4 t 豆粕，大豆蛋白粉中的蛋白质含量按90%计算，则原料豆粕中蛋白质的收率不足70%. 大豆中2S, 7S, 11S 和15S 四种组分的含量分别为9.4%, 34%, 42%和4.6%，经过提取后15S 中主要蛋白质存在于豆渣中，但仍有少量溶出；2S 组分尽管平均分子量较低且易溶解，但部分蛋白质的等电点接近 4.5，因此，酸沉阶段会有部分2S 组分与7S 和11S 共同沉淀. 蛋白质等电点沉淀过程主要与溶液pH 有关，但蛋白质浓度会影响沉淀过程的收率，本实验中蛋白质收率提高的主要原因是提取液的浓度较高. 多级逆流固液提取技术是一种有效提高大豆分离蛋白提取率的方法.目前工业上使用的大豆分离蛋白提取过程属错流提取工艺，第1次提取时豆粕与水的比例为1:8 g/mL ，离心后向残余豆粕中加入清水，加入量与第1次提取时豆粕用量的比例为4:1 mL/g ，整体上豆粕与水的比例为1:12 g/mL. 由于错流提取工艺用水量较高，提取液中蛋白质浓度与用水量近似呈反比，7S 和11S 组分的浓度降低后导致其在酸沉阶段沉淀不完全，乳清废水中存在一定量的7S 和11S 球蛋白及其亚基，增加了后续水处理过程负荷，同时也降低了大豆分离蛋白的收率. 本研究采用多级逆流固液提取过程中的固液比为1:8 g/mL ，降低了用水量. 结果表明提取液中7S 和11S 组分的总释放率可达75%左右，在酸沉淀阶段7S 和11S 组分的收率提高了3%，降低了乳清废水中7S 和11S 组分的总量，同时降低用水量后乳清废水中2S 组分浓度比错流提取工艺有所增加.比较了固液比分别为1:7, 1:8和1:9 g/mL 条件下多级逆流固液提取工艺中大豆中蛋白质的释放量及7S 和11S 组分的相对含量变化，结果(表1)表明，固液比为1:8和1:9 g/mL 条件下大豆分离蛋白的相对释放量比固液比为1:7 g/mL 条件下分别提高了12.9%和20.7%，其中7S 和11S 组分在提取物中的总含量分别提高了14.6%和20.8%. 在提取过程中固液比越高，多级逆流固液提表1 不同固液比条件下大豆分离蛋白的相对释放量及7S 和11S 组分的相对含量Table 1 Relative release rate of SPI and content of 7Sand 11S fractions in extraction process with different ratios of solid to liquidRatio of solid to liquid(g/mL) Relative release rateof SPI (%) Relative content of 7S and 11S fractions (%)1:7 1:8 1:971.3 84.2 92.069.2 83.8 90.005010005010001020304005010036.1728.9622.9320.055.42E 1(a) HPLCR e l a t i v e a b s o r b a n c e 36.6128.9822.9620.0513.565.44E 236.1428.8322.8719.985.39E 3Time (min)501000501000102030405005010035.3228.7516.6313.43(b) HPSECE 1R e l a t i v e a b s o r b a n c e 35.5428.8021.6516.7313.50E 238.8835.5029.5521.6313.52E 3Time (min)20406080100123R e l a t i v e r e l e a s e r a t e (%)Extraction solution取工艺对离心分离过程要求越高，在工业上会增加动力消耗. 同时，固液比过高将导致7S和11S组分浓度过高，也会影响其释放行为. 与传统的蛋白提取工艺相比，固液比为1:10 g/mL条件下用水量节省了11%，同时由于提取液中较高的7S和11S浓度，在酸沉阶段7S和11S的收率较传统工艺中的酸沉阶段提高了3%.4 结 论(1)以脱脂豆粕为原料，利用碱溶酸沉法提取大豆分离蛋白，利用高效液相色谱−质谱联用系统对大豆分离蛋白提取液中的蛋白质种类进行了分析，识别出提取液中2S, 7S和11S等主要成分，而分子量较大的15S组分则残留于豆粕残渣中.(2)在蛋白质组分识别的基础上，对不同蛋白质组分在提取过程中的释放行为进行了研究. 结果表明，2S组分具有相对较快的释放速率，而7S和11S组分的释放速率相对较低.(3)利用多级逆流固液提取技术提取大豆分离蛋白可有效提高7S和11S组分的相对释放量，且可使大豆分离蛋白的提取率比传统提取方法提高8%.参考文献：[1] Castro R F, Marina M L, Garfa M C. 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Food Chem., 2007, 102(4): 1310−1316.[6] Zarkadas C G, Gagnon C, Poysa V, et al. Protein Quality andIdentification of the Storage Protein Subunits of Tofu and Null Soybean Genotypes, Using Amino Acid Analysis, One- and Two-dimensional Gel Electrophoresis and Tandem Mass Spectrometry [J]. Food Res. Int., 2007, 40(1): 111−128.[7] Yuan Y J, Velev O D, Chen K, et al. Effect of pH and Ca2+-inducedAssociations of Soybean Proteins [J]. J. Agric. Food Chem., 2002, 50(17): 4953−4958.[8] Duranti M, Barbiroli A, Scarafoni A, et al. One-step Purification ofKunitz Soybean Trypsin Inhibitor [J]. Protein Express. Purif., 2003, 30(2): 167−170.[9] 赵西周，陈春佳，张效伟，等. 连续性碱溶酸沉生产大豆分离蛋白特点分析 [J]. 中国油脂, 2002, 5(5): 61−63.[10] Wang Q E, Ma S M, Fu B Q, et al. Development of Multi-stageCountercurrent Extraction Technology for the Extraction of Glycyrrhizic Acid (GA) from Licorice (Glycyrrhiza uralensis Fish) [J]. Biochem. Eng. J., 2004, 21(3): 285−292.[11] 胡小中，温光源，李里特. 多级逆流醇浸法制取大豆浓缩蛋白工艺的研究 [J]. 食品工业科技, 2009, 30(3): 272−275.[12] 王英，崔政伟. 连续动态逆流提取的动态和现状 [J]. 包装与食品机械, 2009, 27(1): 49−53.[13] Li W, Zheng C, Wang J S, et al. Microwave Multi-stageCountercurrent Extraction of Dihydromyricetin from Ampelopsis Grossedentata [J]. Food Technol. Biotechnol., 2007, 45(4): 374−380. [14] 周兵，周瑞宝. 大豆球蛋白的性质 [J]. 西部粮油科技, 1998,23(4): 39−43.Extraction of Soybean Protein Isolate UsingMulti-stage Countercurrent Solid−Liquid Extraction MethodGAO Jian-ping1,2, LIU Lin1, ZHANG Gui-feng2, WANG Ming-lin1, HUANG Yong-dong2, LIU Yong-dong2, SU Zhi-guo2(1. College of Food Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Taian, Shandong 271018, China;2. State Key Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering, CAS, Beijing 100190, China) Abstract: Release behavior of proteins in soybean meal during their extraction process using high performance liquid chromatography−mass spectrometry was investigated. The possibility for extraction of soybean protein isolate using multi-stage countercurrent solid−liquid extraction (MSCSLE) was also studied. The result indicated that 2S protein showed a higher release rate and more than 80% of total 2S proteins were released after extraction in two times. The total release rate of 7S and 11S proteins reached 69% after three times of extraction, indicating that 7S and 11S fractions had a lower release rate during extraction process. Increasing the concentration gradient between the solid and liquid or extending the extraction time enhanced the release of 7S and 11S fractions. The concentration of total proteins obtained using MSCSLE was higher than that obtained by multi-time extraction, resulting in higher 7S and 11S recovery rate. Under the same recovery rate of soybean protein isolate, 11% of water could be saved. During precipitation, 8% of total 7S and 11S protein could be recovered.Key words: soybean protein isolate; high performance liquid chromatography−mass spectrum; protein identification; release; multi-stage countercurrent solid−liquid extraction。

实验十六蛋白质含量的测定衡量食品的营养成分时，要测定蛋白质含量，但由于蛋白质组成及其性质的复杂性，在食品分析中，通常用食品的总氮量表示，蛋白质是食品含氮物质的主要形式，每一蛋白质都有其恒定的含氮量，用实验方法求得某样品中的含氮量后，通过一定的换算系数。

即可计算该样品的蛋白质含量。

一般食品蛋白质含氮量为10%如肉、蛋、豌豆、玉米等，其换算系数为 6.25,小麦取 5.70，大米 5.95、乳制品 6.38、大豆 5.17，动物胶 5.55。

一、目的与要求：掌握微量凯氏法测定蛋白质总氮量的原理及操作技术。

包括样品的消化，蒸馏吸收及滴定与含氮量的计算。

二、原理：凯氏定氮法：食品经加硫酸消化使蛋白质分解，其中氮素与硫酸化合成硫酸铵。

然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收后，再用盐酸或硫酸滴定根据盐酸消耗量，再乘以一定的数值即为蛋白含量，其化学反应式如下。

( 1 ) 2NH2(CH2)2COOH+13H2S04 (NH4)2S04+6C02+12S02+ 16H2(2) ------------------------------ (NH4)2SO4+2NAOH 2NH 2+2H2O+NA2SO4(3) 2NH3+4H3BO3 -- (NH 4)2B4O7+5H2O(4) (NH4)2B407+H2S04+5H20-(NH4)9SO4+4H2BO2三、试剂与仪器：1、硫酸钾2、硫酸铜3、硫酸4、2%硼酸溶液5、40%氢氧化钠溶液6、混合指示剂：把溶解于95%乙醇的0.1%溴甲酚绿溶液10毫升和溶于95% 乙醇的0.1%甲基红溶液2毫升混合而成.7、0.01mol/LHCL标准溶液或0. 01mol/L硫酸标准溶液.8、K DN-08A(04A定氮仪10、三角瓶250ml 3 只。

11、量筒50ml、l0ml、l00ml。

12、吸量管10ml 只。

13、酸式滴定管1 支。

14、容量瓶100毫升1 只。

15、小漏斗1 只。

大豆7s与11s球蛋白亚基缺失品系的鉴定与品质评价
大豆7s和11s球蛋白是大豆种子中两种重要的蛋白质。

在某些情况下，7s和11s球蛋白可能会发生亚基缺失，这会对大豆的品质产生一定影响。

鉴定大豆7s和11s球蛋白亚基缺失品系可以通过分子生物学方法进行。

可以使用PCR扩增和测序等技术，检测大豆基因组中7s和11s球蛋白编码基因的亚基是否存在缺失。

另外，可以通过蛋白质分析方法，如凝胶电泳、质谱等技术，检测大豆种子中7s和11s球蛋白的亚基组成情况。

品质评价方面，可以通过多种指标进行评价。

首先是蛋白质含量的评价，亚基缺失品系可能导致蛋白质含量的降低。

其次是蛋白质组成的评价，亚基缺失可能导致7s和11s球蛋白的相对含量发生变化。

可以使用凝胶电泳或质谱等方法，定量和比较不同品系中7s和11s球蛋白的含量。

此外，还可以通过蛋白质功能性评价，如酶活性和功能性特性的测定，评估亚基缺失对大豆蛋白质功能的影响。

综上所述，鉴定和评价大豆7s和11s球蛋白亚基缺失品系需要综合运用分子生物学和蛋白质分析等技术，同时考虑蛋白质含量、组成和功能等指标。

这些评价结果可以为选育具有优异7s和11s球蛋白特性的大豆品种提供科学依据。

豆渣蛋白的提取及含量测定
李夏
【期刊名称】《科学与财富》
【年(卷),期】2011(000)004
【摘要】大豆富含植物蛋白,可以增强体质和机体的抗病能力,还有降血压和减肥的功效,并能补充人体所需要的热量,可以治疗便秘,极适宜老年人食用.目前,饮用豆浆逐渐成为一种时尚,但是打磨豆浆会产生大量豆渣,一般都用作饲料或者丢弃,造成了浪费.对此,本课题主要以水溶剂法提取的富含大豆蛋白的豆渣为原料,进一步提取水溶、酸溶、碱溶性大豆蛋白同时采用考马斯亮蓝法对大豆蛋白的含量进行了分析,以期为将来的工业生产及科研提供科学依据.
【总页数】1页(P370)
【作者】李夏
【作者单位】四川化工职业技术学院,四川泸州,646005
【正文语种】中文
【相关文献】
1.超声辅助提取发酵豆渣蛋白工艺研究
2.豆渣中蛋白质的响应面法优化超声辅助提取
3.EM发酵豆渣、鱼杂、鸡血及其粗蛋白含量测定分析
4.豆渣蛋白提取及检测试验
5.联合酶法提取豆渣蛋白肽和可溶性膳食纤维
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国家标准《粮油检验大豆蛋白质、脂肪含量测定近红外法》编制说明《粮油检验大豆蛋白质、脂肪含量测定近红外法》国家标准起草组二〇〇八年十月十六日1.工作简况（包括任务来源、协作单位、主要工作过程、国家标准主要起草人及其所做工作等）项目背景和来源近红外分析方法(NIR)是近年来在粮食质量测定中作为迅速、简便、非破坏性检测发展起来的新技术，它是利用粮食中某一成分在近红外谱段中（700nm—2500nm）对特定波长近红外光能量与其含量有等比吸收的原理。

近年来，我国粮食和农业部门引进了世界各国多种型号近红外分析仪，使我国近红外应用技术迅速发展，在农产品质量控制上发挥了一定作用。

近红外分析方法自二十世纪七十年代被美国确定为非破坏检测粮食水分、蛋白质、脂肪的标准方法以来，在美国、法国、丹麦、瑞典、日本、澳大利亚等农业发达国家已经将NIR检测装置作为大豆蛋白质、脂肪证明的认定基准装置。

实践验证，近红外分析仪不仅可以为生产企业的品质控制提供直接快速的信息，使生产企业能够及时调整生产工艺，而且近红外光谱分析仪在粮食质量检测中充分体现了它快速、准确、节省人力物力等优点。

多年来，粮食检验部门和加工企业陆续购置了不少近红外分析仪器，但是由于缺乏标准的支撑，近红外分析技术在粮食检验机构一直未能得到真正应用。

为了规范近红外光谱仪的使用，确保测定结果的可靠性，使各级检测部门、研究机构及厂家在使用近红外光谱分析仪时有标准方法可依据。

通过近红外粮食质量检测系列标准的建立，将为粮食质量保证体系提供良好的技术支撑。

根据国家标准化管理委员会《关于下达2007年第四批国家标准制修订计划的通知》（国标委计[2007]85号）的要求，项目编号为-T-449的《粮油检验大豆蛋白质、脂肪含量测定近红外法》国家标准起草任务由河南工业大学负责起草。

在国家粮食局标准质量中心的组织、协调下，河南工业大学连同有关单位组成了本标准起草小组。

本标准制定主要工作过程本标准重点研究了AACC、ISO等关于近红外测定大豆或饲料方法的标准（草案），同时研究了国内有关近红外测定方法的标准。

·油脂工程· 粮油加工与食品机械 MACHIN ERY FO R CEREA LS OI L AN D FOOD PROCESSING提取大豆分离蛋白的工艺研究邵佩兰1　徐　明2(1.宁夏大学农学院　2.宁夏大学生命科学学院)　【摘　要】研究了采用碱法工艺提取大豆分离蛋白的影响因素。

通过试验,确定了提取大豆分离蛋白的最佳工艺条件,即pH值9.0、浸提温度50℃、固液比1∶10的条件下浸提50min,提取率可达79.35%。

　【关键词】提取;大豆;分离蛋白中图分类号:TS224 文献标识码:A 文章编号:1009-1807(2005)09-0047-03 大豆蛋白是一种可与动物蛋白相媲美的优质蛋白,大豆中蛋白质含量高达40%,且所含氨基酸组分齐全,被誉为“绿色奶牛”、“植物肉”。

同时还含有丰富的不饱和脂肪酸、钙、磷、铁、膳食纤维、低聚糖等,不含胆固醇,不易引起心脑血管疾病,具有很高的营养价值。

大豆蛋白质是优质的植物蛋白质资源,在人们摄入的蛋白质中,大豆蛋白质占20%以上,但国内豆制品加工业存在的突出问题是大豆蛋白质利用率低,平均利用率仅为60%,这就意味着在加工过程中造成了40%左右的蛋白质损失,从而造成了资源的巨大浪费。

因此,为提高蛋白质的提取率,本文就pH值、固液比、浸提温度、浸提时间等因素对大豆分离蛋白提取的影响进行了研究,以确定其最佳的提取条件,以便进一步开发利用大豆蛋白,促进大豆蛋白资源的综合利用。

1　仪器和材料1.1　试验材料大豆:市售陈年大豆,去皮后置于45℃的烘箱中干燥、粉碎、过80目筛,得大豆粉。

经测定蛋白质含量为34.12%。

试剂:盐酸、氢氧化钠、硫酸、乙醇、过氧化氢、硼酸、硫酸铜、硫酸钾、硒粉、甲基红、溴甲酚绿等(均为分析纯)。

1.2　试验仪器pH-2型酸度计、800型离心机、磁力搅拌可调控制器、鼓风恒温干燥箱、B-N电子分析天平、分光光度计、电热恒温水浴锅、组织捣碎机、凯氏定氮装置、循环水多用真空泵。

大豆品质分析摘要：大豆是豆科大豆属的一年生草本植物，原产于中国，在中国各地均有栽培，同时广泛栽培于世界各地。

大豆是中国重要粮食作物之一，已有五千年栽培历史是一种其种子含有丰富植物蛋白质的作物，大豆用处很广泛，大豆最常用来做各种豆制品、榨取豆油、酿造酱油和提取蛋白质。

是数百种天然食物中最受营养学家推崇的食物。

而大豆的品质对大豆的价值起了决定性作用。

关键词：大豆品质、蛋白质含量测定、脂肪含量测定论文主体内容一、研究背景及意义大豆是我们常见的农作物。

作为食品，大豆富含蛋白质和氨基酸，可提供人们必须的营养物质。

除了直接食用，大豆还可以加工成豆腐、豆浆、豆干、腐竹，酿造酱油、制作豆豉，极大丰富了人们的餐桌。

除此之外大豆用来榨油，加工成饲料，在工业上也是重要的原材料。

大豆的品质和大豆的价值息息相关，只有提升大豆的品质、了解大豆品质的测定方法以选择出优质的大豆，才能让大豆更好的发挥作用。

二、优质大豆品质分析测定指标大豆的测定指标有很多，包括大田产量及各类物质含量，以下几点就是1、蛋白质含量高，则大豆蛋白质含量达45%以上，产量比当地同类品种增产5%。

2、脂肪含量高，则大豆脂肪含量23%以上，产量比当地同类品种增产5%。

3、双高含量的大豆，蛋白质含量42%以上，脂肪含量21%以上，产量比当地同类品种增产5%。

4、适于菜用的大粒品种大豆鲜荚长5.3 cm，宽1.3 cm，含糖量7%，蛋白质36%～37%。

5、外观光滑整洁，无畸形，种脐颜色淡的大豆商品价值最高。

三、大豆品质分析方法（一）、大豆蛋白质的测定（凯氏定氮法）1、把大豆用粉碎机粉碎,取3-5g于已经称量好的皿盒中,在120度的烘箱中烘30分钟。

拿出等待凉后称重,减去皿盒重量，计算水分的百分比。

2、称取0.2gH2SO4，6gK2SO4，把0.5g粉碎好的大豆（不用测量水分的）用滤纸包好放入定氮瓶中，加20ml硫酸,（瓶口上放一个小漏斗,防止蛋白跑掉）开小火在电炉子上消化,等没有碳化颗粒,并处于澄清状态时,拿下来凉一会，再加过氧化氢直到把瓶颈上的蛋白冲洗干净为止，再消化30min，拿下来，等凉.。

大豆分离蛋白凝胶值的测定大豆分离蛋白具有很好的凝胶性、乳化性和胶粘性等功能特性，利用物性测定仪测试大豆分离蛋白的功能性，可以把这些特性作出数据化的准确表述，本论文提出了凝胶性的测定方法，仪器的设置参数，同时对不同浓度盐水制备的样品胶体分别进行了分析。

测定2.5%的盐水制备的胶体，能够得到最好的凝胶值。

标签：物性测定仪凝胶值的测定方法随着食品市场的不断繁荣发展，现代人群需要的食品是既能引起食欲，又无不良副作用，而且含有丰富营养，大豆分离蛋白应运而生，其原料就是大豆。

大豆中富含蛋白质，而且蛋白质中人体“必须氨基酸”含量充足，属于“优质蛋白”，大豆分离蛋白具有很好的凝胶性和乳化性，广泛应用于肉制品中，提高肉制品的蛋白含量、风味和咀嚼感。

1 术语1.1 大豆分离蛋白是以大豆为原料，采用先进的加工技术制取的一种蛋白含量高达90%以上的功能性食品添加剂，它具有很好的凝胶性、粘弹性和乳化性，又兼有蛋白含量高的营养性，广泛应用于肉制品、冷饮制品、烘焙食品中。

1.2 凝胶性是指大豆分离蛋白形成胶体状结构的性能，它使分离蛋白具有较高的粘性、可塑性和弹性，即可做水的载体，也可做风味剂及其他配合物的载体，可赋予产品良好的凝胶组织结构，增加咀嚼感。

2 测定方法2.1 方法提要物性测定仪可对样品的物性概念作出数据化的准确表述，使用统一方法的测试，是精确的感官量化。

本方法是利用物性测定仪，配置专用探头，在一定的条件下，模仿人的牙齿压缩产品胶体，得到第一次压缩时的峰值（硬度）、压缩后的回复程度（弹性）及二次压缩的耐受能力（凝集性）三个数值，对这三个数值的综合评价即为咀嚼性，用凝胶值来表示。

2.2 仪器和设备①物性测定仪：英国TA.XTplus。

②恒温循环水浴锅。

③小型搅拌机：Cuisnart DLC-1。

④真空包装机。

⑤不锈钢模具：直径5cm，高35cm，或用肠衣代替。

2.3 测定步骤2.3.1 称量量取2.5%的盐水170ml+30g样品于搅拌机中（蛋白液浓度15%）。

食品中蛋白质的测定实验报告一、实验目的准确测定食品中蛋白质的含量，掌握常见的蛋白质测定方法及原理，评估食品的营养价值和质量。

二、实验原理蛋白质是含氮的有机化合物。

食品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。

然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。

根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。

三、实验材料与仪器（一）材料1、牛乳、鸡蛋、大豆等食品样品。

2、浓硫酸（比重 184）。

3、硫酸铜、硫酸钾。

4、 40%氢氧化钠溶液。

5、 2%硼酸溶液。

6、混合指示液：1 份 01%甲基红乙醇溶液与 5 份 01%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。

7、 005mol/L 盐酸标准溶液。

（二）仪器1、消化炉。

2、定氮蒸馏装置。

3、凯氏烧瓶（500ml）。

4、容量瓶（100ml、500ml）。

5、移液管（10ml、20ml）。

6、酸式滴定管（50ml）。

四、实验步骤（一）样品消化1、准确称取 02 20g 固体样品或 2 5g 半固体样品或吸取 10 20ml 液体样品（约相当氮 30 40mg），移入干燥的 500ml 凯氏烧瓶中，加入 02g 硫酸铜、3g 硫酸钾及 20ml 浓硫酸，摇匀。

2、将凯氏烧瓶以 45°角斜支于有小孔的石棉网上。

用电炉小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热 05h。

取下放冷，小心加 20ml 水，放冷后，移入 100ml 容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。

（二）蒸馏与吸收1、按图装好定氮蒸馏装置。

在水蒸气发生瓶内装水至约三分之二处，加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。

2、向接收瓶内加入 10ml 2%硼酸溶液及混合指示液 1 滴，并使冷凝管的下端插入液面下。