花药与花粉培养优秀课件

第四节
花药培养
（2）材料生理状态 花药供体植株的生理状态，对花粉愈伤组织的诱导 率有直接影响。 对水稻、小麦和大麦等禾本科植物而言，大田植株 比温室植株、主茎穗比分蘖穗花粉愈伤组织的诱导率都 明显的要高。不同季节接种的花药愈伤组织诱导率也有 显著变化，例如：水稻，早造比晚造接种的愈伤组织诱 导率要高；烟草，开花早期比开花晚期的花药可产生更 多的花粉植株；小麦，早期接种比晚期接种的材料愈伤 组织诱导率可提高2～3倍。说明供体植株的生态环境， 特别是温度和光周期可能对花粉发育及其对离体培养的 反应有重要影响。
第二节
花药和小孢子的发育
（以烟草花粉发育过程为例，说明被子植物花粉发 育过程，P222） 第一期：小孢子母细胞经减数分裂形成孢子四 分体，随胼胝质分解，4个小孢子分离。 第二期：小孢子为球形细胞，核大，有液泡， 挤核靠边（单核靠边期），期末细胞明显增大，细 胞壁特化，小孢子进行第一次花粉细胞有丝分裂 （不对称），形成2个不均等的细胞。 第三期：小孢子细胞中有2个核。 在离体培养条件下，花粉发育偏离正常发育途 径，第一次花粉细胞有丝分裂是对称的，结果形成 两个形态和体积相等的细胞，把此作为B型。
第四节
花药培养
2、材料预处理 对所取用的穗子或花蕾，进行低温、激素（生长 素）或其他方法预处理，能有效提高愈伤组织诱导 率和苗分化率。 （1）低温预处理： 一般是将材料置于冰箱5～10℃下冷藏一定时 间再接种。处理时间视不同植物而定，水稻在5～ 10℃时为5～8天，烟草在7～9℃时为7～14天。 同种植物不同品种的要求也有差异，需作试验比较 才能确定。
第四节
花药培养
3、材料灭菌： 取回的材料，在接种前必须进行表面灭菌。一 般方法是先用70～75%酒精擦洗穗子和花蕾的外 部苞叶，然后用0.1%升汞浸泡7～10分钟（水稻、 玉米等需剥取穗子浸入消毒液）或用饱和漂白粉溶 液浸泡10～20分钟以灭菌，最后用无菌水冲洗3～ 5次，供接种用。 材料灭菌是花药培养成功与否的一个重要环节， 此关不过，谈不上什么培养。

胚状体发育途径
a) 球形胚 芸苔属小孢子培养
d) 鱼雷形胚
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愈伤组织发育途径
接种在平板上的水稻花药
部分花药产生愈伤组织
水稻花药培养
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水稻花药培养
愈伤组织转接种到再生培养基
愈伤组织分化形成再生植株
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（一）白化苗产生的影响因素及机理
1、内因
期。
供体植株基因型（如籼稻比粳稻白苗率高）、花粉发育时
2、外因
预处理、培养基成分、激素水平与种类、培养条件和方法
、愈伤组织转分化时间等。
3、机理
核基因起关键作用，导致质体DNA缺失，产生白苗。另
外地、无性系变异也可能是原因之一。
5、用于遗传转化
能直接表达外源基因，不受显隐性影响
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第二节 花粉孢子体发育途径
概念：花粉孢子体发育途径（雄核发育途径）
花粉是产生花粉植株的原始细胞，其第一次有丝分裂，在 本质上与合子的第一次孢子体分裂相似，把花粉形成植株的途 径称为花粉孢子体发育途径，也叫雄核发育途径
（1973）小麦花粉培养 （早期花药培养主要依靠小孢子的自然胚胎发生产生单倍体，能自发形
成胚胎发生的基因频率较低，效率极低） 80年代后期到90年代期间，花培技术迅速发展。许多作物小孢子培养已经成功。
十字花科、麦类、水稻、玉米等。
90年代，一些先前被认为是不易进行小孢子培养的基因型也相续成功Konzak
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第5章 花药和花粉培养
一、概念

梯度离心前 （小孢子形态、活力不一致）
30%蔗糖梯度离心后 （获得均一的小孢子群体）
(二)花粉培养方式
1、平板培养 花粉置琼脂固化培养基上培养。 2、液体培养 花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通气。 3、双层培养 花粉置固体-液体双层培养基上培养。培养基制作方 法：先铺一层琼脂固体培养基，凝固后，在表面加入少量液体培 养基。 4、看护培养 利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉 小孢子发育。 5、微室培养 利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养 6、条件培养基培养 利用培养过花药的液体培养基或含失活花药提 取物的培养基上培养。花药条件培养基、子房条件培养等。
（3）诱变育种中的作用
植株不受显隐性的影响，在诱变育种中能在当代及 时获得突变个体，加倍后成为稳定的纯系。
2、物种进化研究 可探索亲本染色体组的构成。分析单倍体 植物减数分裂时，形成二价体的数目和形状，能确定染色体组内 是否存在同源染色体。
3、遗传分析 单倍体植株中基因不受显隐性的影响，每一个基 因的作用均能表现出来。能用来研究基因的性质及其作用。还可 用于基因的剂量效应分析。
二、花粉培养
(一)花粉的分离与纯化 1、自然散落法(漂浮培养散落小孢子收集法) 将花药接种在 预处理液或液体培养基上，待花粉自动散落后，收集培养。 2、挤压法 在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后收集培养。 3、机械游离 （1）磁搅拌法 用磁力搅拌器搅拌培养液中的花药，使花粉 游离出来； （2）超速旋切法 通过搅拌器中的高速旋转刀具破碎花蕾、穗 子、花药，使小孢子游离出来（此法应用最广）。 4、小孢子纯化 对上述方法获得的小孢子混合物进行分级过筛、 梯度离心处理纯化小孢子
培养已经成功。十字花科、麦类、水稻、玉米等。 • 90年代，一些先前被认为是不易进行小孢子培养的基因型也相续

2、物种进化研究
可探索亲本染色体组的构成。分析单倍体植 物减数分裂时，形成二价体的数目和形状，能确 定染色体组内是否存在同源染色体。
3、遗传分析
单倍体植株中基因不受显隐性的影响，每一个
基因的作用均能表现出来。能用来研究基因的性质
及其作用。还可用于基因的剂量效应分析。
4、构建连锁图谱
双单倍体（DH）群体是永久性群体，能有效 地用于遗传图谱的构建。
单倍体 二倍体 AB------ --------------------> AABB aB----------------------------> aaBB Ab----------------------------> AAbb ab-- --------------------------> aabb

80年代后期到90年代期间，花培技术迅速发展。许多作物小孢子
培养已经成功。十字花科、麦类、水稻、玉米等。 90年代，一些先前被认为是不易进行小孢子培养的基因型也相续

成功Konzak (1999) 。
通过 花药 培养 育成 的甜 椒新 品种 ： 海花 三号
三、花药和花粉培养的应用
1、作物育种
1)诱导形成单倍体，快速获得纯系，缩短育种周期；
3、其它
包括γ射线、离心、磁场等。
（四）培养基
1.基本培养基 主要为N6和MS培养基。 MS和H培养基：适合双子叶植物花药培养； B5培养基：适合豆科和十字花科花药培养； N6培养基：适合禾谷类作物的花药培养。 Nitsch培养基:适合芸薹属和曼陀罗属。 高浓度的NH4+显著抑制花粉愈伤组织形成。 铁盐对花粉胚状体发育很重要。活性炭促进胚状体发育。
花粉离体培养时，雄核发 育最适宜的时期一般是第 一次有丝分裂或之前。

花药培养的
利用离休培养花药的方法，诱导花粉形成单 倍体）。
单倍体植物的主要特点是其孢子体细胞的染 色体数目和配子体细胞染色体数目一致，对 单倍体植物进行染色体人工加倍之后，即可 得到同质结合的纯系，使育成的杂种不再分 离，缩短育种年限，加快育种速度。
花药培养的
在我国花药培养和单倍体育种方面做了 大量的工作，如培养基的研制，雄核发 育机理，培育新品种等。由于花药培养 的方法日趋完善，培养效率也逐年提高， 使这一技术开始被广泛应用于常规杂交 育种，逐渐成为作物改良和新品种培育 的一个重要手段。
花药培养应注意的问题
1 材料的选择 用作花药培养的亲本植株的基因型、
法有：用市售漂白粉饱和液浸泡10～15 分钟；用8～10%安替福民水溶液浸泡 5～10分钟；用0.1%升汞浸泡10分钟。 如果小花或花蕾包封严密，只须用70% 酒精进行仔细擦拭即可。
花药培养应注意的问题
适合于禾谷类的N6培养基（1975）； 2mg/L及秋水仙素4mg/L的1/2MS大量元素、铁盐和其他成分全量、蔗糖1. 适合玉米培养的正14培养基和玉培培养基（1978）；
花药培养应注意的问题
用冷处理可以增加诱导频率，其原因是： 冷处理抑制纺锤体的形成，冷处理不能 诱导花药的发育，但它有助于培养花粉 的存活。并且阻止配子体分化，导致较 高频率的花粉发育。冷处理的作用是间 接的，因此不是离体花药成功培养的先 决条件。
花药培养应注意的问题
3 材料的表面灭菌 对花药表面灭菌的方法很多，常用的方
最常用的方法是低温冷藏。具体做法是将带 有叶鞘的穗子或花蕾用湿纱布包裹后再用塑 料袋套起，放在冰箱中冷藏。
花药培养应注意的问题
不同材料对处理温度的高低有不同的要 求，一般耐寒植物比喜温可耐受较低的 温度。低温处理时间视使用的温度而定， 较低的温度处理时间要短，反之则长。 烟草7～9度下处理7～14天，水稻7～10 度下处理10～15天，大麦3～7度下处理 7～14天，都可显著提高花药的出愈率。 但低温处理对小麦的效果不稳定。

23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢谢！
花药和花粉的培养
11、战争满足了，或曾经满足过人的 好斗的 本能， 但它同 时还满 足了人 对掠夺 ，破坏 以及残 酷的纪 律和专 制力的 欲望。 ——查·埃利奥 特 12、不应把纪律仅仅看教育的手段 。纪律 是教育 过程的 结果， 首先是 学生集 体表现 在一切 生活领 域—— 生产、 日常生 活、学 校、文 化等领 域中努 力的结 果。— —马卡 连柯(名 言网)
13、遵守纪律的风气的培养，只有领 导者本 身在这 方面以 身作则 才能收 到成效 。—— 马卡连 柯 14、劳动者的组织性、纪律性、坚毅 精神以 及同全 世界劳 动者的 团结一 致，是 取得最 后胜利 的保证 。—— 列宁 摘自名言网
15、机会是不守纪律的。——雨果
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈