花粉花药的培养影响因素

3．4 活性炭(AC) 活性炭(AC)
活性炭应用于花培是Naka—mura等首先提出的，目前已经在油菜、马 活性炭应用于花培是Naka—mura等首先提出的，目前已经在油菜、马 铃薯、烟草、玉米、黑麦、小黑麦、龙眼、辣椒和甜椒等花培中得到 应用。AC具有较强的吸附特性，在植物的组织培养中常用来吸附培养 应用。AC具有较强的吸附特性，在植物的组织培养中常用来吸附培养 基中的有害物质，特别是蔗糖在高温灭菌过程中降解产生的5 基中的有害物质，特别是蔗糖在高温灭菌过程中降解产生的5一羟甲 糠醛，花药组织产生的乙烯、酚、醌类物质以及琼脂中的杂质。如在 玉米花培中加入O ％的AC可以使愈伤组织或胚状体的诱导频率提 玉米花培中加入O．5％的AC可以使愈伤组织或胚状体的诱导频率提 高一倍左右，在分化培养基中加入O ％的AC还能促进分化的幼苗 高一倍左右，在分化培养基中加入O．5％的AC还能促进分化的幼苗 健壮，根系发达。但是，AC的吸附作用没有专一性，它既可吸附培养 健壮，根系发达。但是，AC的吸附作用没有专一性，它既可吸附培养 基内的有害物质，同时也能吸附培养基中的生长调节物质、Fe-EDTA、 基内的有害物质，同时也能吸附培养基中的生长调节物质、Fe-EDTA、 VB5、叶酸和烟酸等有益物质，如张玉华等在过滤灭菌的液体培养基 VB5、叶酸和烟酸等有益物质，如张玉华等在过滤灭菌的液体培养基 体系中研究了甘露醇预培养和诱导过程中，AC对大麦花培效率的影响， 体系中研究了甘露醇预培养和诱导过程中，AC对大麦花培效率的影响， 结果显示，AC会降低花粉胚和愈伤组织产量和质量，影响植株分化率， 结果显示，AC会降低花粉胚和愈伤组织产量和质量，影响植株分化率， 尤以诱导培养基中添加AC的影响较大。在该试验中，以液体培养基代 尤以诱导培养基中添加AC的影响较大。在该试验中，以液体培养基代 替固体培养基，用过滤灭菌法代替常规高温高压灭菌法，从而排除了 培养基中的蔗糖等在高压灭菌条件下产生有害物质的可能性。由此可 见，AC的使用一定要慎重。 见，AC的使用一定要慎重。
1.2 小孢子发育时期(即花粉来自育时 小孢子发育时期( 期)处于不同发育阶段的小孢子，其花药培养效率差 别很大。只有花粉发育到一定时期的花药，才对 外界刺激最敏感，而不同植物的花粉对外界刺激 的敏感时期是不同的。对多数植物来说，单核中 期至单核晚期的花粉都易形成花粉愈伤组织或花 粉胚。如水稻、烟草的花粉，从单核中期到双核 期皆可接受诱导，形成胚状体或愈伤组织；玉米 的花粉以单核中后期为佳；番茄花培的最适时期 为单核期；辣椒花培胚状体形成的频率在单核后 期为最高(9． 期为最高(9．7％)，双核次之(8．06％)，单核中期 ，双核次之(8．06％ 最低(3． 最低(3．8％)．
王子霞等发现十个玉米材料的花药愈伤组织诱导 率和分化率不同，有6 率和分化率不同，有6个材料诱导出愈伤，诱导率 最高的为O 317％，最低为0 0167％，这6 最高的为O．317％，最低为0．0167％，这6个材 料中只有2个分化出苗而其余4 料中只有2个分化出苗而其余4个材料愈伤诱导率 为0。在栽培稻中，一般以糯稻的培养力最高，其 培养力高低顺序为糯> 培养力高低顺序为糯>粳>粳／籼>籼型杂交稻>籼。 粳／籼>籼型杂交稻> 王立浩等报道在辣椒的花培中有些材料对某些培 养基根本无反应。烟草属各个种花药培养获得花 粉植株的比例最高，但郎氏烟草花药培养却很难 成功。由此可见，基因型的影响在花药培养中普 遍存在。
3．3 激素
在培养基的各种成分中，激素的水平和配比非常重要，常对诱发细胞 的分裂，生长和分化起决定作用。在花培中常用的激素有二类：一类 为生长素，如2 为生长素，如2，4一D(2，4一二氯苯氧乙酸)、IAA(吲哚乙酸)、 D(2， 一二氯苯氧乙酸) IAA(吲哚乙酸) NAA(萘乙酸)等．另一类称为细胞分裂素，如KT(激动素) NAA(萘乙酸)等．另一类称为细胞分裂素，如KT(激动素)、6一BA(6一 BA(6一 苄基氨基嘌呤) 苄基氨基嘌呤)和玉米素，一般生长素类物质对诱导细胞脱分化形成愈 伤组织及生长有决定性作用，分裂素对愈伤组织的分化和胚状体形成 有主要作用。在花培中，广泛使用的2 有主要作用。在花培中，广泛使用的2，4一D对于许多植物的花粉启 动、分裂、形成愈伤组织和胚状体起着决定性的作用。如曹晓燕等发 现，毛刺槐的花培中单独附加BA无法诱导愈伤组织的形成，单独附加 现，毛刺槐的花培中单独附加BA无法诱导愈伤组织的形成，单独附加 2，4一D可诱导愈伤组织的形成，且BA与2，4一D配合使用比BA与 可诱导愈伤组织的形成，且BA与 配合使用比BA与 NAA配合使用对愈伤组织的诱导效果好，2 NAA配合使用对愈伤组织的诱导效果好，2，4一D在毛刺槐花药愈伤 组织的形成过程中起着非常重要的作用。但是，由于2 组织的形成过程中起着非常重要的作用。但是，由于2，4一D是一种 其他植物激素的拮抗物质，其本身具有刺激组织形成层活性的作用； 虽然随着浓度增大，诱导愈伤组织的频率也增加，由此产生的愈伤组 织其分化能力都显著降低，因此不能为了追求较高的愈伤组织诱导率 而在初代培养基中加入过多的2 而在初代培养基中加入过多的2，4一D。
2 预处理
在大多数花药培养成功的例子中，要想获 得理想的培养效果，常常在花药接种前进 行各种预处理。预处理的方法主要有低温、 高温以及甘露醇预处理等，其中以低温预 处理应用最为广泛。
2．l 温度预处理
黄英金等”发现，对水稻亚种间杂种的花培，多数基因组合给以6 黄英金等”发现，对水稻亚种间杂种的花培，多数基因组合给以6℃一8℃4 d的预 d的预 处理与不进行预处理相比，对提高出愈率及绿苗分化率均有极显著的促进作用。低温 预处理还可以提高番茄愈伤组织的诱导率，而茄子的花药只有经过热处理才能产生胚 状体。庄军平等以辣椒为材料，研究了不同温度处理对辣椒花药愈伤组织形成的影响， 接种前花蕾经l 接种前花蕾经l一7 d 0℃一4℃低温预处理有利于花药愈伤组织的形成，其中以3—5 d处 0℃ 低温预处理有利于花药愈伤组织的形成，其中以3 d处 理的效果最好；接种后经12— 理的效果最好；接种后经12—16 h 32℃短期热激处理，也有利于花药愈伤组织的形成， 32℃ 但超过60 h反而抑制愈伤组织的形成。试验还对低温预处理和短期热处理的效果进行了 但超过60 h反而抑制愈伤组织的形成。试验还对低温预处理和短期热处理的效果进行了 比较，发现单独热激处理的效果稍优于单独低温预处理，而两者配合处理的效果与单 独热激处理的效果差异不明显。此外，曹晓燕等对毛刺槐花培的研究结果显示在4 独热激处理的效果差异不明显。此外，曹晓燕等对毛刺槐花培的研究结果显示在4℃条 件下不同时间的低温预处理对愈伤组织诱导率没有明显的促进作用。 关于高温预处理 对提高花粉胚或愈伤组织诱导率的作用机理目前研究尚少，有学者发现是由于高温预 处理导致内源激素和蛋白质产物的不同所致。 关于低温预处理提高花粉胚胎发生能力 的作用机理存在以下观点。Nitsch等认为低温能改变花粉粒第一次有丝分裂纺锤体的轴 的作用机理存在以下观点。Nitsch等认为低温能改变花粉粒第一次有丝分裂纺锤体的轴 向，并且还能破坏纺锤体的微管蛋白，从而阻止纺锤体的形成，使有丝分裂的正常过 程被打乱，不能进行极性分化，导致去分化过程的发生。Sunderlandc~a?认为，低温作 程被打乱，不能进行极性分化，导致去分化过程的发生。Sunderlandc~a?认为，低温作 用的机理不在于改变纺锤体的轴向，而在于使花粉保持活力，使其不在数天内死亡， 在此期间营养细胞得以完成细胞质的改组转向胚胎发生。徐武等报道了低温预处理过 程中大麦花药内源激素的变化，推测 低温预处理改变了花药内源激素的含量，阻断了 花粉原来的发育方向，使其由配子体的发育途径转向孢子体的发育途径。黄斌提出低 温预处理的可能作用机理为：(1)低温预处理引起花药内源激素发生变化，进而影响愈 温预处理的可能作用机理为：(1)低温预处理引起花药内源激素发生变化，进而影响愈 伤组织的形成；(2)引起小孢子的孤立化，花药壁细胞和绒毡层在低温预处理过程中逐 伤组织的形成；(2)引起小孢子的孤立化，花药壁细胞和绒毡层在低温预处理过程中逐 渐退化解体；(3)使绝大多数小孢子保持其生活力。 渐退化解体；(3)使绝大多数小孢子保持其生活力。
1 材料基因型 2 预处理 3 培养基 4 培养条件
1 材料基因型
材料的基因型是花药培养是否成功的关键 因素。不同基因型的材料，花药诱导率不 同。花药培养力的大小是受多基因控制的 数量性状．因而随基因型的差异变化很大。
基因型对花培的影响主要有以下几个方面， 产生单倍体的途径(胚状体或愈伤组织) 产生单倍体的途径(胚状体或愈伤组织)、发 生的频率、形成的时间、植株的再生能力 以及在所形成的植株中单倍体与二倍体的 频率等。
3．2 碳源
一般情况下，糖浓度在花药培养中要比一般组织培养高，有人认为这 是由于花粉细胞的渗透压比花丝等体细胞渗透压高的缘故，高浓度糖 不利于体细胞的生长，但不妨碍花粉的生长。在玉米花药培养过程中， 培养基中附加12％一15％的蔗糖，其诱导愈伤组织的效果明显优于附 培养基中附加12％一15％的蔗糖，其诱导愈伤组织的效果明显优于附 加9％的蔗糖培养基，蔗糖浓度过低不利于诱导培养。毛刺槐的花培 中，蔗糖浓度从3％增至9 中，蔗糖浓度从3％增至9％时，愈伤组织诱导率也随之增加，当蔗糖 浓度增至12%时则愈伤组织诱导率显著降低。 浓度增至12%时则愈伤组织诱导率显著降低。 在小麦、大麦、小黑麦、 黑麦、燕麦和玉米等作物中，在诱导花粉形成胚状体或愈伤组织阶段， 应用麦芽糖代替蔗糖作为培养基的碳源有较好的效果。Ramon比较了 应用麦芽糖代替蔗糖作为培养基的碳源有较好的效果。Ramon比较了 辣椒花培中蔗糖、果糖、麦芽糖的培养效果，得出结论，麦芽糖做碳 源，胚的发生率最高。麦芽糖作碳源优于蔗糖的可能原因：(1)作为营 源，胚的发生率最高。麦芽糖作碳源优于蔗糖的可能原因：(1)作为营 养物，麦芽糖可分解为葡萄糖和葡萄糖一1 养物，麦芽糖可分解为葡萄糖和葡萄糖一1一磷酸；蔗糖分解为葡萄 糖和果糖，果糖可能对培养物有害。(2)作为渗压剂麦芽糖分解速度显 糖和果糖，果糖可能对培养物有害。(2)作为渗压剂麦芽糖分解速度显 著慢于蔗糖，可使培养物保持相对稳定的渗透压环境。