植物花药和花粉培养

教学目的：掌握花药培养和花粉培养技术，掌握花药和花粉培养在单倍体育种中的重要应用，了解我国单倍体育种成就。

职业教学技能点：具有进行花药培养和花粉培养的基本能力，具有单倍体育种认知，初步具备查阅资料收集信息基础能力。

教学时间：4学时教学重点：花药培养方法，花粉培养方法，单倍体育种上应用教学难点：花药培养与花粉培养的取材时期，单倍体植物缩短育种年限教学内容：第一节花药培养和花粉培养技术一、概念1．概念花药培养其外植体是植物雄性生殖器官的一部分，就培养方法和技术来讲，属于器官培养的范畴。

花粉培养的精确定义是：将处于一定发育阶段的花粉从花药中分离出来，再加以离体培养。

有时花粉培养也称为小孢子培养(microspore culture)。

从培养方法和技术方面来讲，它属于细胞培养的范畴。

二、花药培养首先报道通过花药培养获得单倍体植株成功的是印度学者Guha、Maheshwari (1964, 1966)。

目前已有250多种植物花药培养成功。

目前，花药培养获得单倍体的技术途径已在禾本科作物、茄科作物、十字花科作物的育种中广泛应用。

花药培养可诱导花粉发育形成单倍体，快速获得纯系；缩短育种周期，利于隐性突变体筛选、提高选择效率；与二倍体融合成体-配杂种。

花药培养的基本程序是：外植体选择－外植体(花蕾)预处理—外植体消毒—剥取花药—接种—诱导培养—分化培养（一）花药培养方法1、材料的选取：大多数植物的花药培养，成功率最高的是单核期或单核中晚期。

花粉发育时期的检测一般将植物的花药置于载玻片上压碎，加醋酸洋红1～2滴染色，再进行镜检以确定花粉发育时期。

水稻等植物的花粉，处于单核期时尚未积累淀粉，在进入三核期后的花粉开始积累淀粉，因此可用碘—碘化钾染色鉴定。

花粉发育时期与花蕾或幼穗大小、颜色等特征之间有一定的对应关系。

花药培养的成功与供试材料的遗传背景、供试材料的生理状态、花粉的发育时期有关。

花粉发育时期图示如下：四分体—小孢子—单核花粉—双核花粉最适期2、材料与处理与灭菌3-5℃低温处理3-10天-（大花蕾将萼片剥掉）-酒精几秒-0.1%升汞10min-无菌水冲洗。

第五章花药和花粉培养一、概况1.概念花粉培养：指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉作为外植体培养，形成花粉胚或愈伤组织，最终发育成花粉植株（单倍体）的技术.花药培养:指应用植物组织培养技术，把花粉发育到一定时期的花药接种到人工培养基上，以改变花药内花粉的发育途径，形成花粉胚或花粉愈伤组织，随后由胚状体直接发育成植株或由愈伤组织分化形成植株的培养方式异同点区别: 花药培养属于器官培养范畴，花粉培养属于细胞培养范畴共同点:在培养过程中都是花粉发育，均可获得单倍体细胞系或单倍体植株2.发展概况1964年印度Gula和Maheshwari成功地从毛叶曼陀罗花药培养获得许多胚状体，并证明胚状体直接起源于花粉粒，最终从胚状体进一步发育得到单倍体植株日本、法国、丹麦、德国等相继开展花培研究工作，目前已有10个科，24个属、34个种、250多种高等植物的花药培养获得成功花粉培养始于50年代，Tulecke首先培养银杏的成熟花粉粒得到愈伤组织，随后人们进行了很多研究，在许多植物上进行花粉培养，同时随着培养技术的逐步完善（看护培养、条件培养…)，获得愈伤组织、胚状体、有的还获得单倍体植株我国花培发展概况始于70年代，将花培与传统育种手段相结合，先后培育出一大批具有研究和应用价值的品种。

如烟草、小麦、玉米、甜椒等花培新品系、品种1974年，中科院植物所与山东烟草研究所合作，成功育成烟草新品种，并大面积推广，这是世界上第一个用单倍体方法培养出来的新品种国际公认，我国的花培工作处于国际领先水平。

我国有30多种植物进行花培试验，20多种获得了花粉植株，有一大部分是我国首创，同时在花培方法，机理等方面作了深入研究德著名学者Melchers：“花药培养起始于印度，而首先却在中国广泛应用，就花药培养的单倍体育种的应用而言，中国在世界上处于领先地位”3.意义a.基础理论研究方面研究减数分裂，花粉生长机制的重要方法用来进行生理、生化、遗传等基础理论的研究花粉粒体积小，数量多，形状、内含物成份基本一致，是比较均一的起始材料，便于在人工控制条件下研究它们的生长、分化、遗传等变化过程b.遗传育种=单倍体育种中的意义可获得纯合二倍体，大大缩短育种周期具有选择效率高的优点用于远缘杂交育种，克服杂种不育性便于隐性突变体的筛选，大大提高突变育种的工作效率二、培养方法1.途径愈伤组织再分化形成植株(脱分化到再分化，变异率提高，混倍现象明显取决于培养基中激素的种类、浓度配比) 花粉植株通过胚状体形成植株花粉植株()2.花粉培养优点:不存在体细胞干扰，没有混倍现象缺点:培养技术难度大花粉分离自然散落法：机械挤压法：优点⏹操作简便⏹适于双子叶植株，不适于禾谷类，易损伤花粉粒缺点⏹花粉中易混有体细胞⏹悬浮液中花粉密度不易控制注意：液体培养基中加蔗糖或甘露醇，调节渗透压，避免花粉吸水胀裂三、影响花培成功的因素有些难培养植物诱导频率很低，有些植物（裸子植物）至今没有获得真正的花培植株花药培养虽然是一项成功的技术，但要获得良好的效果，还需克服许多困难诱导植株成功与否以及诱导频率受多种因素影响（一）供试材料1.材料的基因型材料的遗传背景不同，诱导难易程度不同茄科番茄、蔓陀罗、烟草易成功禾本科水稻优于小麦亚种水稻粳亚种(40-80%)优于籼米亚种(2%)花药培养力是可以遗传的，且为显性或超显性2.植株的生理状态和年龄年幼植株花培成功率高开花始期成功率高烟草开花始期时花药比开花后期的更易产生花粉植株烟草开花期第6天，诱导率最高与植株的营养和生长条件有关N饥饿>高N水稻高温，高N下，诱导率下降，白化苗提高3.花粉发育时期——是影响花培成败的最关键因素之一四分体时期单核期---早、中、晚期双核期三核期#不同植物最适诱导期不同曼陀罗、烟草属、水稻---单核早期、双核期均可诱导，以单核中、晚期效果最好小麦、玉米---只有单核中期才能诱导大麦---单核晚期最佳一般采用单核中-晚期的花粉培养不同植物花培的合适花粉发育时期处于单核期的花粉培养最有利于诱导成苗小孢子发育第三期是胚胎形成的临界期，超过了这一时期胚状体就不能形成在小孢子发育过程，花药内激素水平正在不断改变，由于花药的成熟使激素平衡变得不适合，或为花粉发育所必需的其他一些养分已经耗尽，从而影响了诱导率培养前应确定花粉发育时期镜检：醋酸-洋红、I-KI染色（禾本科、茄科）、焙花青-烙矾法（木本、番茄）利用相应的形态学指标对于花培没有成功的植物最好选取花粉发育各个时期的花粉进行培养，确定最佳时期4.材料的预处理——试验证明，有几种预处理方法能有效提高诱导率低温预处理烟草：7-9℃，7-14天番茄：6-8 ℃，8-12天水稻：10℃，2-14天小麦、黑麦：1-3 ℃，2-20天常温下N饥饿预处理乙烯、高糖、离心预处理（二）培养基1.基本培养基MS应用最多，N6、B5、Nitsch也有应用不同植物种类，适用的培养基不同双子叶：Nitsch、MS十字花科、豆科：B5水稻等禾谷类：N62.碳源蔗糖应用最广，既是最好的碳源，又起调节渗透压的作用不同植物种类、不同诱导时期最适碳源浓度不同，通常以2-5%为宜烟草：2%诱导胚状体小麦：8-10%愈伤；5-8%分化水稻：4-6%愈伤；2-3%分化玉米：12-15%愈伤3.激素关键决定于激素种类、浓度、配比实例小麦：2mg/L 2.4-D 愈伤；< 2mg/L 胚状体4.其它添加物有机附加物、水解乳蛋白、水解酪蛋白、酵母提取物、肌醇、谷氨酰胺等活性炭（0.5-1%)吸附了琼脂中不利于细胞生长的某些杂质吸附了培养基高压灭菌蔗糖产生5-羟甲基糠醛吸附了激素，降低了激素水平（三）培养方法和培养条件1.材料的接种保证完全无菌条件、注意接种密度（104-105粒/ml为好），花药组织分泌的活性物质相互作用有利于诱导密度太高，养分消耗太快；密度太低，诱导率下降。

第二章(10)植物花药(花粉)培养1 花药培养是将花粉发育至一定阶段的花药接种到人工培养基上进行培养，以形成花粉胚或愈伤组织进而分化成植株的技术。

2 花粉培养是将花粉从花药中分离出来,接种到人工培养基上进行培养，以形成花粉胚或愈伤组织进而分化成植株的过程。

3 花药培养过程3.1 预处理低温冷藏是最常用的方法。

烟草7～9℃，7～14d；黑麦1～3℃，7～14d。

3.2 表面消毒用70%酒精喷洒或擦拭花器或包被着麦穗的叶鞘表面，即可以达到灭菌的要求。

3.3 接种在无菌的条件下把雄蕊上的花药从花丝上摘下，水平地放在培养基上进行培养。

不要使花药受到损伤，否则会刺激花药壁形成二倍体愈伤组织。

接种的“密度效应”，要有一个合理的群体数量。

3.4 培养形成花粉植株。

花粉---愈伤组织---苗；花粉---胚状体---苗。

培养方式：①琼脂固化培养基表面培养；② 30%Ficoll的液体培养基表面漂浮培养；③固-液双层培养。

4 花药培养脱毒1974年日本：花药培养可以脱除草莓病毒；4.1花药采取时期单核期：花蕾4～6mm，花药1mm.4.2花药诱导愈伤组织培养基MS+IAA4mg/L+BA2mg/L+KT2mg/L+蔗糖30g+琼脂7g/L4.3增殖分化培养基MS+GA1mg/L+IBA0.2mg/L+BA1mg/L+蔗糖30g+琼脂7g/L4.4生根培养基1/2MS+IBA0.2mg/L+活性炭3g/L+蔗糖20g+琼脂7g/L5 单倍体植株染色体加倍的方法5.1 自然加倍花粉细胞核有丝分裂或核融合，染色体可自然加倍，获得纯合二倍体。

5.2人工加倍用秋水仙素处理单倍体植物，可使染色体加倍（溶液浸苗、处理愈伤组织和用含0.4%秋水仙素的羊毛脂涂抹单倍体植株的顶芽、腋芽，可得到能结实的二倍体植株）5.3将单倍体植株诱导的愈伤组织反复继代培养，再分化可得到二倍体植株。

6 花药和花粉培养的应用6.1克服后代分离，缩短育种周期；6.2有利于筛选隐性突变体，选择效率高;6.3有利于隐性基因控制性状的选择;6.4快速获得自交系的超雄株.本节小结：在单倍体细胞中只有1个染色体组，表现型和基因型是一致的，一旦发生突变，无论是显性还是隐性，在当代都可以表现出来，因此单倍体是体细胞遗传研究和突变育种的理想材料。

花粉和花药培养的比较花药和花粉培养：指在合成培养基上，改变花粉的发育途径，使其不形成配子，而像体细胞一样进行分裂、分化、最终发育成完整植株。

该发育途径被称为“花粉孢子体发育途径”或“雄核发育”。

小麦花药胚状体发生一、植物花药和花粉培养的概念（一）花药培养通过无菌操作技术，把发育到一定阶段的花药，接种在人工培养基上，进行诱导、分化，最终形成完整植株的技术。

草莓花药愈伤组织,花药植株（二）花粉培养将处于一定发育阶段的花粉从花药中分离出来，再加以离体培养，也叫小孢子培养。

1964年：Guha&Maheshwari南洋金花花药培养发育成胚；1967年：Bourgin&Nitsch花药培养获得烟草植株；1973年：我国首次报道了小麦花药培养获得再生植株；目前：许多农作物及经济植物通过花粉培养都能诱导成植株。

二、花药培养历史通过花药培养育成的甜椒新品种：海花三号相同点：培养目的相同，均获得小孢子植株。

不同点：（一）花药培养离体操作技术简单，而且，药壁组织有时可作为条件因子促进小孢子的发育。

辣椒花药吊竹花粉粒三、两者的异同点花粉培养没有药壁组织干扰；可计数小孢子产胚率；可观察雄核发育的全过程；单倍体产量高。

但技术更复杂。

（二）花药培养属于组织培养；而花粉培养属于细胞培养。

1.花药培养容易受药壁、花丝、药隔等体细胞组织的影响，再生的植株中会出现不同倍性的个体，所以花药培养在诱导单倍体方面有一定的局限性，而分离的花粉粒培养可以克服这一不足。

2.由于去除了药壁和其它连接组织的干扰，因此能更好地调节控制雄核发育的各种因子，而且能直接从单细胞开始观察整个雄核发育的过程。

四、花粉培养的优点3.花粉是真正的单细胞单倍体，均能匀质地接受各种化学的、物理的因子处理，是突变体筛选及外源基因导入研究的有用材料，对育种有很大的意义。

4.一个花药中就有成千上万个小孢子，从花粉培养能得到更多的花粉植株。

七叶树花粉粒思考题1.简述花粉和花药培养的概念；2.花粉培养的特点是什么？3.花药培养的特点是什么？参考文献与网站Thank You!。