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化学发光技术综述

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化学发光技术综述

化学发光免疫测定（CLIA）是将抗原与抗体特异性反应与敏感性的
化学发光反应相结合而建立的一种免疫检测技术。

（一）原理
化学发光免疫测定（CLIA）属于标记抗体技术的一种，它以化学发
光剂、催化发光酶或产物间接参与发光反应的物质等标记抗体或抗原，
当标记抗体或标记抗原与相应抗原或抗体结合后，发光底物受发光剂、
催化酶或参与产物作用，发生氧化还原反应，反应中释放可见光或者该
反应激发荧光物质发光，最后用发光光度计进行检测。

（二）特点
特异性高、敏感性高、分离简便、快速、试剂无毒、安全稳定、可
自动化。

（三）分类
1、从反应原理上，化学发光免疫技术主要分为直接化学发光和酶促
反应化学发光。

1.1直接化学发光
化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发
光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或
抗体。直接化学发光速度快、试剂稳定性好，但灵敏度略低于酶促发光。
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代表性的发光剂有：吖啶酯、三联吡啶钌。

1.1.1 吖啶酯
在碱性条件下被H2O2氧化时,发出波长为470nm的光，具有很高的
发光效率，其激发态产物N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。

这类化合物的发光为闪光型，加入发光启动试剂后0. 4s 左右发射
光强度达到最大，半衰期为0.9s左右。

特点：
①发光反应中在形成电子激发态中间体之前，联结于吖啶环上的不
发光的取代基部分从吖啶环上脱离开来，即未发光部分与发光部分分
离，因而其发光效率基本不受取代基结构的影响。

②吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物化学发光不需要催化剂，在有H2O2
的稀碱性溶液中即能发光。因此应用于化学发光检测具有许多优越性。

优点主要有：
①背景发光低，信噪比高；
②发光反应干扰因素少；
③光释放快速集中、发光效率高、发光强度大；
④易于与蛋白质联结且联结后光子产率不减少；
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⑤标记物稳定（在2-8 ℃下可保存数月之久）。

1.1.2.三联吡啶钌
三联吡啶钌 [RU(bpy)3]2+是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺
（TPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。

1.2 酶促反应化学发光
是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光，这一类需酶催
化后发光的发光剂 称为酶促反应发光剂。酶促化学发光灵敏度高，但
速度慢，酶活性容易受外界影响，其代表性的发光物质有鲁米诺及其衍
生物、AMPPD

1.2.1. 鲁米诺及其衍生物（HRP)
激活酶为辣根过氧化物酶（HRP)，鲁米诺体系的发光基本上为闪光
型且信号弱。但在使用增强剂的情况下，发光的持续时间可延到
30-60min，发光强度至少增加100倍以上。

现通常采用的体系是Luminol/H2O2/HRP体系，即用HRP标记抗原或
抗体，以鲁米诺或异鲁米诺及其衍生物作发光底物，对碘苯酚或对苯基
酚等作增强剂，用NaOH+H2O2作发光启动试剂，化学发光反应2min后，
光反射强度达到最高峰；20min后，光强度减少20%。

1.2.2. 异鲁米诺（ABEI）
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新产业的化学发光使用的发光剂，使用的是闪光非酶激活技术，加
入启动液后测试0.1-3s时间内的发光强度。

1.2.3． AMPPD (AP)
激活酶为碱性磷酸酶（AP）
AMPPD的特性：
(1) 在碱性环境下，AMPPD的非酶解性的水解程度低，即本底低；
(2) 热稳定性好，在pH=7.0的水中，30℃时的分解半衰期为142h；
(3) 发光为辉光型，波长为470nm，在15min时强度达到高峰，
15-60min内光信号强度维持一致，变化很小，即使在12h后仍能测定得
出正确结果；

(4) 加入增强剂如聚氯苄乙烯苄基二甲基铵(BDMQ)或BSA等，能明
显增强AP酶解AMPPD的发光强度，增强因素达100-100000倍。

现通常采用的体系是Dioxetane/AP/Enhance System，即用碱性磷
酸酶(AP)标记抗原或抗体，用(金钢烷)-1，2-二氧乙烷或其衍生物作发
光底物，在发光底物中加入增强剂。

使用此系统的有美国DPC公司的Immulite System和Beckman
Coulter公司Automated Immunoassay System等，迈瑞的化学发光所使
用的底物基本上属于AMPPD。
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2、从固相载体上，一般分为板式分离和磁珠分离

2.1 板式分离技术：
将抗原/抗体包被在微孔板上，反应时，待检物质通过抗原抗体反应
结合于包被板上，通过洗涤液数次洗涤，实现结合部分和未结合部分的
分离，后加入底物、启动试剂，用光电倍增管检测发出的光信号。

此分离技术和酶联免疫分析技术（ELISA）一致,只是将最后的显色
剂改为发光剂得以实现，多数手工法检测，及部分半自动仪器使用这种
分离技术，由于抗原抗体结合在反应孔中，反应面积有限，所以为达到
充分反应，孵育时间一般比较长。常为0.5h~2h。

手工法化学发光最常用的发光体系是鲁米诺/H2O2/增强剂，规格和
ELISA基本一致，为48T/96T。

2.2 磁珠分离技术
超顺磁珠是一种表面带有特定活性基团、大小均匀、 球形、具有超
顺磁性及保护壳的微粒。超顺磁珠在有外磁场存在时表现出磁力而发生
聚集，无磁场时又失去磁力而分散开来。

通过一定的方法可将抗原/抗体等活性物质和磁珠表面的活性基团
结合而包被于磁珠上面，检测时，将待检物和包被有抗原/抗体的磁珠
在一定条件下孵育，通过抗原抗体反应结合，后通过增加外部磁场，磁
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珠产生磁性而聚集在一起，即可进行洗涤，实现结合部分和未结合部分
的分离，最后加入底物、启动试剂，用光电倍增管检测发出的光信号。

使用磁珠法分离，由于反应时磁珠均匀分布于整个液体中，反应面
积较大，更容易充分反应，故孵育的时间较短。

（四）一些自动化仪器使用的方法原理：

项目 LIAISON Byk-Sangtec) Axsym (雅培） Acess （贝克曼） Immulite 2000 (DPC） ELECSYS 2010
（罗氏）

ACS180

（拜耳）

固相 超顺磁珠 塑胶微粒 超顺磁珠 塑料球，离心 超顺磁珠
超顺磁
珠

发光方式 异鲁米诺 酶促发光 离子捕获 AP/4-MUP 酶促发光 AMPPD 酶促发光
AMPPD

电发光

三联吡啶钌 吖啶酯

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鲁米诺化学发光分析法研究进展

鲁米诺化学发光分析法研究进展

鲁米诺化学发光分析法研究进展
邵晓东;李瑛
【期刊名称】《化学研究》
【年(卷),期】2010(021)001
【摘要】从化学发光反应机理和应用进展两个方面对鲁米诺-过氧化氢、鲁米诺-铁氰化钾、鲁米诺-碘化物、鲁米诺-高锰酸钾和鲁米诺-溶解氧等化学发光体系进行了综述;指出鲁米诺化学发光体系是应用最为广泛的一类化学发光体系,同时对鲁米诺化学发光分析法的发展方向进行了展望.
【总页数】11页(P102-112)
【作者】邵晓东;李瑛
【作者单位】中国石油天然气集团公司,管材研究所,陕西,西安,710065;西安热工研究院有限公司,陕西,西安,710032
【正文语种】中文
【中图分类】O65
【相关文献】
1.纳米材料在鲁米诺体系化学发光分析应用中的研究进展∗ [J], 徐开恩;姚曼文;方湘怡
2.人心肌肌钙蛋白I鲁米诺化学发光酶免疫分析法的建立 [J], 李文丽;余鹃;向军俭;王宏
3.基于电还原鲁米诺电化学发光分析法测定水样中钼(Ⅵ) [J], 郑行望;章竹君;王琦;丁红春
4.纳米粒子参与的鲁米诺化学发光分析研究进展 [J], 王奕璇
5.碳点在鲁米诺和草酸酯化学发光体系中的研究进展 [J], 沈成龙;娄庆;单崇新因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

植物中活性氧的检测方法

植物中活性氧的检测方法

·技 术 与 方 法·
生物技术通报
ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＢＵＬＬＥＴＩＮ
２００７ 年第 ５ 期
植物中活性氧的检测方法
祁艳 王冬梅
（ 河 北 农 业 大 学 生 命 科 学 学 院 ， 保 定 ０７１００１）
摘 要： 主要对超氧阴离子自由基（ Ｏ ２－·） 、过氧化氢（ Ｈ２Ｏ ２） 等活性氧的检测方法， 包括化学发光法、分光光度法、荧 光染色法， ＥＰＲ 波谱学方法、ＤＡＢ 组织染色法和电子显微技术检测法等进行了综述， 并简单介绍了最近发展起来的一些新 技术。
１．３ 荧光染色法 运用荧光染色技术可进行活体和离体亚细胞水
平的 Ｈ２Ｏ２ 检测。常用的荧光染料有 ２＇ ， ７＇ －二氯氢化荧 光 素 二 乙 酯 （ ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ， ＤＣＦＨＤＡ） 、 ４－ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ、７－羟－６ 甲 基 香 豆 素 （ ｓｃｏｐｏｌｅｔｉｎ） 、 Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ（ Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－３， ７－ｄｉｈｙｄｒｏｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ） 及 高 香 草 醛 酸 （ ｈｏｍｏｖａｎｉｌｌｉｃ ａｃｉｄ） 等 。在 辣 根 过 氧 化 物 酶 的 催 化 下 ， Ｈ２Ｏ２ 可 氧 化 这 些 物 质 生 成 极 易 检 测 的 发 荧 光 的 物 质 ， 此 法 简 便 有 效 ， 应 用 广 泛 。有 研 究 者 用 荧 光染色法检测了豌豆（ Ｐｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍ） 叶片衰老过程中 线 粒 体 、过 氧 化 物 酶 体 中 的 Ｈ２Ｏ２［１０］及 萝 卜 （ Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ） 种 子 在 萌 发 过 程 中 经 光 照 、ＧＡ、ＡＢＡ 调 控 下 Ｈ２Ｏ２ 的 释 放 ［１１］。 Ｏｒｏｚｃｏ－Ｃａ′ｒｄｅｎａｓ 等 ［１２］曾 用 Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ 定 量 检 测 了 番 茄 （ Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ） 叶 片 提 取 液 中 的 Ｈ２Ｏ２。 本 研 究 室 陈 晓 波 ［１３］以 激 发 子－原 生质体简化实验系统模拟叶锈菌侵染小麦叶片的 互 作 体 系 ， 利 用 荧 光 探 针 ＤＣＨＦＤＡ 标 记 Ｈ２Ｏ２， 并 借 助 激 光 扫 描 共 聚 焦 显 微 镜 （ ＣＬＳＭ） 来 研 究 植 物 抗 病 过 程 中 微 丝 骨 架 与 ＲＯＳ 的 关 系 ， 取 得 了 良 好 效 果 ； 笔者用该法成功检测了受叶锈菌侵染的小麦叶片 中 ＲＯＳ 的 变 化 （ 待 发 表 ） 。
一种液相色谱检测器—抑制化学发光检测器

一种液相色谱检测器—抑制化学发光检测器

到很大 限制 如 何将 高灵 敏 的化 学发光 法与 高选择性 的物理 或化 学手段 相结合 ， 是 ２ 纪 鲫 年代 以 这 ０世
来人们非常关注的问题 ． 目前 ， 化学发光已用于酶反应、 免疫分析 以及液相色谱相结合的检测技术． 鲁米诺化学发光已用于检测柱后分离的金属催化荆、 抑制荆 ， 以及能与金属离子催化剂络台而减弱
介绍 ．
１ 基 于抑 制 过 氧 化 草 酸酯 化 学发 光 的检 测 器
过氧化 草酸 酯化学 发光反 应是 已知 的最有效 的非酶化 学 发光反应 ， 量子 产率 高达 ２ ％ ５
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收稿 日期 １０ ０ ５ ６ ２ ０ —０ —１ 作者 简介 ： 王越（９ ６ １６ 一 ） 女 ． ， 陕西西安人 ， 西安联 合大学化学与生命科 学系讲师
度小， 以及采用 固体试剂具有床寿命短等缺点 ， 因此 Ｔ Ｐ Ｃ Ｏ不适于水相分离系统 而后 ２ Ｏ［ ２ － ＮＰ 双（一 硝 基苯基 ） 草酸酯 ］ 在极性 溶剂 中溶解度较 大， 乙腈 中的溶解度较 Ｔ Ｐ 在 Ｃ Ｏ大 ６倍 ， 而且 ２Ｎ Ｏ与０ １ －Ｐ Ｉ］２ ２ ＶＨ０ 的混 合液 可稳 定至 少 ６ｈ 因此 可 预先 混合 ， Ｉ ， 仅用 一个试 剂泵 即可 此 外 ， ２ＮＰ 体 系 中检测 在 － Ｏ
Ｚｏ ｅ 等在研究基于固态 Ｔ Ｐ Ｅ ２４ ６三氯苯基） ｏｌｎ ｌ Ｃ Ｏ 双（ ，，， 草酸酯］ 化学发光反应器的 Ｈ 检测器时 ２
化学发光免疫类体外诊断试剂(盒)产品技术审评要求规范(2017版)1204(可编辑修改word版)

化学发光免疫类体外诊断试剂(盒)产品技术审评要求规范(2017版)1204(可编辑修改word版)

化学发光免疫类体外诊断试剂（盒）产品技术审评规范（2017 版）本规范旨在指导注册申请人对化学发光免疫类体外诊断试剂(盒)产品注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。

本规范是对化学发光免疫类体外诊断试剂(盒)产品的一般要求，申请人应依据具体产品的特性对注册申报资料的内容进行充实和细化，并依据产品特性确定其中的具体内容是否适用。

本规范是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要提供详细的研究资料和验证资料。

应在遵循相关法规的前提下使用本规范。

本规范是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本规范相关内容也将进行适时调整。

一、适用范围本规范适用于利用化学发光免疫分析技术对被测物质进行定量检测的第二类体外诊断试剂（包括以微孔板、管、磁颗粒、微珠和塑料珠等为载体的酶促及非酶促化学发光免疫分析测定试剂）的注册技术审查。

依据《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第 5 号，以下简称《办法》）、《食品药品监管总局关于印发体外诊断试剂分类子目录的通知》（食药监械管〔2013〕242 号）化学发光免疫类体外诊断试剂(盒)产品分类代号为 6840。

二、注册申报资料要求（一）综述资料综述资料主要包括产品预期用途、临床意义、产品描述、有关生物安全性的说明、研究结果的总结评价以及同类产品上市情况介绍等内容，应符合《办法》和《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》（国家食品药品监督管理总局公告 2014 年第44 号）的相关要求。

（二）主要原材料研究资料（如需提供）主要原材料（例如各种天然抗原、重组抗原、单克隆抗体、多克隆抗体以及多肽类、激素类等生物原科，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等标记用酶、磁微粒及其他主要原料）的选择、制备、质量标准及实验验证研究资料；校准品、质控品的原料选择、制备、赋值过程及试验资料；校准品的溯源性文件，包括具体溯源链、实验方法、数据及统计分析等详细资料。