细胞周期同步化
在细胞培养过程中,细胞多处于不同的细胞周期时相中,其中有少数细胞在进行有丝分裂活动,其余细胞分别处于G1、S与G2各期。不同时相的细胞对药物干预存在不同反应,会影响实验的重复性,因此,需要获得周期一致性的细胞。利用细胞同步化技术可使细胞大量的处
于同一细胞时期,并可获得该时期大量的物质,如细胞中期时的染色体。细胞周期同步化(synchronization)就是指为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、基因表达或凋亡,借助某种自然或人为的实验手段,使细胞群体中处于细胞周期不同时相的细胞停留在同一时相( 除了G0期的细胞)的现象。细胞同步化本质上包括用一定的方法获得一定数量的同步化细胞群与使细胞进入同步化生长的两层含义。
DNA 合成抑制法就是通过抑制DNA合成将细胞同步于同一时期的方法。高浓度TdR(胸腺嘧啶核苷)双阻断法就是目前常用的抑制DNA 合成的同步化方法。它可逆地抑制DNA 合成,而不影响其她时期细胞的转运,最终可将细胞群阻断在S 期或G1 /S 交界处。其原理就是: TdＲ就是细胞DNA 合成不可缺少的前体,但向培养基中加入过量TdＲ,可形成过量的三磷酸腺苷,后者能反馈抑制其她核苷酸的磷酸化,从而抑制DNA 合成。它将细胞同步于G1 /S期交界处,同步化程度高,适用于任何培养体系,可将几乎所有的细胞同步化,但就是容易产生非均衡生长,个别细胞体积增大。TdＲ双阻断法因为简单易行且可逆,在肿瘤药理方面对细胞周期同步化的实验中得到了广泛的应用。羟基脲、5-氟脱氧尿嘧啶、阿糖胞苷、氨甲蝶呤与高浓度ADR、GDR也属于DNA合成抑制剂,它们与TdR作用相似,均可通过抑制DNA 合成达到同步化的目的。
中期阻断法就是利用破坏微管的药物将细胞阻断在M期从而得到同一时期细胞的方法,常用的药物有秋水仙素等。秋水仙素通过抑制微管的聚合,进而抑制有丝分裂装置的形成,将细胞阻断于有丝分裂中期然后再释放使细胞达到同步化。中期阻断法非平衡生长问题不明显,但可逆性比较差,当阻断时间过长时,许多细胞产生异常分裂。过去研究中也发现,同步后的细胞的生长能力明显不如撤去阻断剂后得到的S期细胞旺盛。秋水仙胺、Nocodazole 也就是目前常用的中期阻断剂。
经过同步化之后的细胞可以通过流式细胞术对其周期进行分析。将细胞用PI(碘化丙啶)染液进行染色,使用流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定,可分析细胞周期各时相的百分比。由于细胞的DNA含量在不同时期有显著的差异,因此可以将细胞分成G1/G0期(1倍),S期(1-2倍)与G2/M期(2倍)。流式细胞仪可以根据DNA含量在不同时间内的变化,从而确定细胞周期的长短,也可以直接标记DNA复制(放射性同位素标记),统计细胞数量与标记细胞的百分比,对细胞周期进行综合分析、
连续分裂的细胞从上一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的整个过程为细胞周期(cell cyc1e)。细胞周期包含四个阶段:①G1期(first gap),又称合成前期,指前一次有丝分裂完成到DNA复制前的一段时期;②S期(synthesis phase),即DNA合成期,为真核细
胞分裂(cell pision)间期中进行DNA合成的阶段;③G2期(second gap),为DNA合成后期,指DNA合成结束至有丝分裂开始之间的一个阶段;④M期 (mitosis or pision) ,又称D期,就是染色体真正开始分离时期。细胞周期又可分为有丝分裂期(M期)与分裂间期(即G1→S →G2)两个时期。尽管细胞周期中各期的持续时间因不同细胞类型而异,但相对而言M期最短,S期较长。流式细胞仪(flow cytometer;FCM)的工作原理就是在样品管中放入待测细胞,在气体的压力下使待测细胞进入充满鞘液的流动室。在细胞流动室里单细胞悬液被鞘流液包绕通过流动室内一定孔径的孔,形成细胞柱。然后通过对流动液体中单列的细胞进行逐一检测,得到单个细胞的光散射与荧光指标,在功能水平上定量分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等的物理、化学特征等多个参数。流式细胞仪不仅可以根据不同时间内DNA含量的变化来确定细胞周期的长短,还可以直接用放射性同位素标记DNA复制,
通过统计细胞数目与比较各时相细胞的百分比来检测就是否达到预期目的,从而对细胞周期各时相进行综合分析。流式细胞分析法与传统的荧光镜检查相比,具有速度快、精度高、准确性好等优点,已成为当代最先进的细胞定量分析技术。
Hela细胞周期时间为21 h,其中G1期为10 h,S期为7 h,G2期为3 h,M期为1 h。
一、S期同步化方法 (胸腺嘧啶核苷双阻断法,两次可让细胞同步化到G1/S期)
胸腺嘧啶核苷(TdR)双阻断法:在处于对数生长期细胞的培养基中首次加入过量的DNA合成抑制剂TdR,能可逆地抑制S期细胞的DNA生成,而不作用其她细胞阶段的运转,导致大多数细胞群被同步化于G1/S期交界处,但仍有部分细胞处于S期范围;移去胸腺嘧啶核苷,细胞再培养一段比S期较长而短于G2、M、G1三期总与的时间,让它们完全越过S期,但又不使按周期发展最快的细胞进入下一个S期。第二次胸腺嘧啶核苷处理,当细胞继续运转至
G1/S交界处时,被过量的胸腺嘧啶核苷抑制而停止。细胞则于G1/S期边界汇集,再次撤掉胸腺嘧啶核苷,加入完全培养基,使细胞继续生长,则细胞同时启动于S期。5-氟脱氧尿嘧啶、羟基脲、阿糖胞苷、氨甲蝶呤、高浓度AdR与GdR等DNA合成抑制剂均可抑制DNA合成使细胞同步化,由于高浓度胸腺嘧啶核苷对S期细胞的毒性较小,因此常用胸腺嘧啶核苷双阻断法诱导细胞同步化。其优点就是同步化程度高,适用于任何培养体系。几乎可将所有的细胞同步化,缺点就是造成非均衡生长,个别细胞体积增大。
二、M期同步化方法(振荡收集法)
该法利用M期细胞变圆易脱落的特点。在处于对数增殖期的单层贴壁细胞(分裂活跃,M期多)中加入Nocodazole。一段时间后,多数细胞被阻滞与M期,轻轻振荡或拍击培养瓶,M期细胞则与瓶壁脱离,悬浮在培养液中,收集培养液,之后再加入新鲜培养液,按照此法继续收集,可得到一定数目的M期细胞。振荡收集法操作简单,同步化程度高并且细胞不受药物伤害,能够真实反映细胞周期状况,缺点就是由于M期较短,被分离出的细胞很少,只能应用于贴壁细胞。收集到的有丝分裂期的细胞可以贮存在冰上,然后处理其余的培养瓶。
三、实验用品
1、材料:Hela细胞。
2、试剂:0、25%胰蛋白酶液、无血清细胞培养液、DAPI试剂、Hank’s液、2mmol/L TdR、70％乙醇(保存于4℃)、RNase-A(10mg/ml,-20℃保存)、PI(650 g/ml,避光保存于-20℃)、PBS (pH 7、4保存于4℃)、秋水仙胺、秋水仙素。
3、器材:培养瓶、移液器、枪头、5ml注射器、试管、离心管、封口膜、微量移液器、Tips、烧杯、废液缸、细胞培养设备、倒置显微镜、台式离心机、水浴、4℃冰箱、二氧化碳培养箱、N2罐、流式细胞仪、超净工作台。
四、实验步骤
(一)S期同步化方法(TdR双阻断法)
(1) 取指数生长期细胞。
(2) 第一次阻断:将对数生长期细胞的培养基换成含2mmol/L的新鲜TdR培养液。
(3) 37℃、5%CO 二氧化碳培养箱中培养12h
(4) 第一次释放:弃去含有胸腺嘧啶核苷的培养基,用Hanks液对贴壁细胞漂洗2～3
次,并更换不含TdR的新鲜培养基,继续培养16h。
(5) 第二次阻断:弃去培养液,再加入浓度为2mmol/LTdR的新鲜培养基,37℃、5%CO
培养12h。
(6) 第二次释放:重复第(4)步骤,此时的细胞大部分出去G1/S期边界,同步化细胞随
时间推移逐渐进入S期。
(二)M期同步化方法(振荡收集法)
(1) 取生长于占瓶底面积60%～80%的细胞一瓶,轻轻摇晃或拍击培养瓶,使松动细胞脱
落而悬浮在培养液中,并用离心管收集。
(2) 用Hank洗涤2次,漂洗液收集到离心管。
(3) 600rpm离心5分钟,并用培养液将细胞浓度调整为2、5×105个/ml接种于培养
瓶。
(三)利用流式细胞术分析细胞周期时相
(1) 将细胞传代培养至指数生长期,吸弃细胞培养上清,用Hanks液洗涤细胞一次,胰酶
消化细胞,完全培养基终止,收集细胞。1200rmp 5min离心,弃去上清。
(2) 4℃预冷的PBS漂洗细胞沉淀2次,1500rmp离心5分钟,收集细胞。
(3) 快速将细胞悬液注入预冷的70%乙醇中,封口膜封口。4℃固定过夜(可长至2
周)。
(4) 1500rmp 离心5分钟去固定液,收集固定细胞,用0、4mL PBS使细胞重悬并转至试
管中吹打均匀(防止细胞破碎)。PBS漂洗2次。
(5) 细胞染色液配制:40×加碘化丙啶(PI)母液(2 mg/ml):100×RNA酶A母液(10
mg/ml):1×PBS =25:10:1000。
(6) 细胞染色:根据细胞量,加入一定体积的细胞染色液(1～1、5ml)重悬,使上机时细
胞通过率为200～350 Cell/s。
(7) 用300目(孔径40～50 m)的筛网过滤于流式上机管中,上机检测。
(8) 样品分析测定及打印。
(四) 秋水仙素阻抑法
(1)将细胞培养至指数生长期。
(2)加入秋水仙素,使培养基最终浓度为0、25～0、5μg/mL,作用6～7小时。
(3)收集细胞,800rpm离心5～10分钟,弃去上清,沉于管底的细胞即为M期细胞。
(五)N2阻断法
(1)将细胞传代培养至指数生长期。
(2)将培养瓶置于N2罐中并通入适量CO2(约相当于罐中体积的5％)。
(3)关闭N2罐,连接N2管子与压力表,慢慢向罐中充入氮气直到压力为80～90磅／英
寸为止。
(4)将N2装置放在37℃培养箱中10～16小时。次日取出,然后缓缓放出N2(最好放出
窗外)。
(5)取出细胞观察同步化效果,并用振荡法收集细胞于离心管中。
(6)800rpm离心10分钟,收集细胞。
(六)G1期与G2期细胞的获得
1.G2期细胞的获得
根据细胞周期测定的数值,使用胸腺嘧啶核苷双阻断法使细胞同步化于G1/S期交界处后,使细胞释放胸腺嘧啶核苷后继续培养。其培养时间应大于S期时间并小于S期与G2期总与的时间。然后先用振荡收集法使已进入M期的细胞脱落瓶壁,弃去上清培养基;再用胰酶消化,加入新鲜培养基制成细胞悬液,离心收集细胞,即为G2期细胞。
2.G1期细胞的获得
(1)向用胸腺嘧啶核苷双阻断法获得的细胞中加入一定量的培养基,继续培养大于
S+G2+M期小于一个周期的时间即可获得G1期细胞。
(2)向细胞中加入缺乏异亮氨酸的培养基进行培养,培养时间超过一个细胞周期,即可获
得G1期细胞。
Common methods for mammalian cell cycle synchronization、
Chemical/pharmacol
ogical inhibition of
DNA
replication/synthesis
or mitotic spindle
formation
Lovastatin Inhibition of HMG-CoA reductase (cholesterol synth esis) and the proteasome Early G1 Mimosine
Inhibition of thymidine, nucleotide biosynthesis, inhibition of Ctf4/chromatin binding Late G1; G1/S Thymidine
TdR
Excess thymidine-induced feedback inhibition of DNA replication G1/S Aphidicolin Inhibition of DNA
polymerase-α and DNA
polymerase-δ
G1/S Hydroxyurea Inhibition of ribonucleotide reductase
G1/S Colchicine Colcemide Inhibition of microtubule
polymerization
G2/M Nocodazole Inhibition of microtubule
polymerization
G2/M Mitogen or growth factor withdrawal
Serum starvation Growth restriction –induced
quiescence
G0/G1 Amino acid starvation Growth restriction –induced
quiescence
G0/G1
桂林市初中生物七年级上册第二单元第一章第三节动物细胞同步练习 姓名:________ 班级:________ 成绩:________ 一、选择题 (共15题；共30分) 1. （2分） (2018七上·慈利期中) 关于动物细胞的说法，下列哪一项不正确（） A . 动物细胞没有细胞壁 B . 动物细胞里的能量转换器只有线粒体一种 C . 动物细胞能生长、分裂和分化 D . 动物细胞分裂时细胞质最先分裂成两份 2. （2分）在制作人的口腔上皮细胞的装片时，需要往载玻片上滴加（） A . 清水 B . 0.9﹪的生理盐水 C . 9﹪的盐水 D . 碘液 3. （2分）观察口腔上皮细胞临时装片时，我们看到细胞中染色最深的是（） A . 细胞壁 B . 细胞膜 C . 细胞质 D . 细胞核 4. （2分） (2015七上·辽宁期中) 在显微镜下观察自己制作的洋葱鳞片叶内表皮细胞临时装片，看不见的结构是（） A . 细胞壁 B . 细胞膜 C . 细胞核 D . 细胞质 5. （2分）观察人的口腔上皮细胞时，必须将取出的口腔上皮细胞放在生理盐水中，原因是（） A . 使细胞维持正常的形态 B . 避免细胞干燥 C . 避免细胞缺水死亡 D . 使细胞透明便于观察 6. （2分） (2017七上·龙岗期中) 细胞膜由脂质、蛋白质、糖类组成，下列关于其成分和功能的说法正确的是（） A . 脂质丰富的细胞膜功能复杂
B . 蛋白质种类和数量多的细胞膜功能复杂 C . 糖类的多少决定着细胞膜功能的复杂程度 D . 脂质含量达 50%，对细胞膜的功能起决定性作用 7. （2分）(2017·呼和浩特) 如图是由3个圆所构成的相关概念间包含关系图，其中Ⅰ为大圆，Ⅱ和Ⅲ分别为大圆之内的小圆，符合这种所属关系的是（） A . Ⅰ细胞质、Ⅱ细胞核、Ⅲ线粒体 B . Ⅰ内心泌腺、Ⅱ垂体、Ⅲ卵巢 C . Ⅰ种子植物、Ⅱ孢子植物、Ⅲ被子植物 D . Ⅰ原核生物、Ⅱ细菌、Ⅲ病毒 8. （2分） (2016八下·李沧期中) “风吹草低见牛羊”．下列有关草和羊的描述．正确的是（） A . 草的细胞内都有叶绿体，羊的细胞都没有细胞壁 B . 羊的血管和草的筛管都属于输导组织 C . 草的营养器官中都含有分生组织、保护组织、结缔组织和输导组织 D . 羊的身体由呼吸、运动、消化、循环、泌尿、神经、内分泌、生殖等系统构成 9. （2分）制作人体口腔上皮细胞临时装片的正确顺序是（） ①在载玻片中央滴一滴清水②在载玻片中央滴一滴生理盐水 ③用消毒牙签从口腔侧壁处轻轻刮几下④把牙签放在载玻片的液滴中均匀地涂抹几下⑤滴加碘液染色⑥盖上盖玻片 A . ①③④⑥⑤ B . ②③④⑥⑤ C . ①③④⑤⑥ D . ②③④⑤⑥ 10. （2分）小明用显微镜观察了洋葱表皮细胞和人的口腔上皮细胞作了如下记录，其中正确的是（） ①洋葱表皮细胞中央有较大的液泡 ②口腔上皮细胞由细胞膜、细胞质、细胞核构成 ③洋葱表皮细胞中有叶绿体 ④视野中有气泡，可能是盖盖玻片时操作不当造成的 ⑤视野中光线过强时应调节反光镜和光圈
细胞周期同步化 借助某种实验手段(自然地或经人为地),使细胞群体中处于细胞周期不同时相的细胞停留在同一时相的现象。 细胞周期同步化分：自然同步化和人工同步化。 自然同步化：是自然界存在的现象, 在动、植物细胞都有发现。它们不受人为条件的干扰, 因而有可能在接近自然的条件下进行观察, 但自然同步化的细胞群体受到诸多条件的限制, 对结果有很大的影响。 人工同步化：是利用细胞培养的方法, 用各种理化因素处理获得的同步化生长的细胞。常用的细胞人工同步化的方法分为选择同步化、诱导同步化或者两者的结合。 同步化分类及方法 （一）自然同步化 1．多核体 如粘菌只进行核分裂，而不发生胞质分裂，形成多核体。数量众多的核处于同一细胞质中，进行同步化分裂，使细胞核达108，体积达5~6cm。疟原虫也具有类似的情况。 2．某些水生动物的受精卵 如海胆卵可以同时授精，最初的3次细胞分裂是同步的，再如大量海参卵受精后，前9次细胞分裂都是同步化进行的。 3．增殖抑制解除后的同步分裂 如真菌的休眠孢子移入适宜环境后，它们一起发芽，同步分裂。 （二）人工同步化 1．选择同步化 1) 有丝分裂选择法：使单层培养的细胞处于对数增殖期，此时分裂活跃，分裂指数高,MI高。有丝分裂细胞变圆隆起，与培养皿的附着性低，此时轻轻振荡，M期细胞脱离器壁，悬浮于培养液中，收集培养液，再加入新鲜培养液，依法继续收集，这样每隔1h摇一次并收获一次，倾出培养液贮存于2~4℃冰箱中保存可连续收集24h，则可获得一定数量的中期细胞。其优点是，操作简单，同步化程度高，细胞不受药物伤害，缺点是获得的细胞数量较少。（分裂细胞约占1%～2%） 2）细胞沉降分离法：不同时期的细胞体积不同，而细胞在给定离心场中沉降的速度与其半径的平方成正比，因此可用离心的方法分离。其优点是可用于任何悬浮培养的细胞，缺点是同步化程度较低。 2．诱导同步化 1）DNA合成阴断法：选用DNA合成的抑制剂，可逆地抑制DNA合成，而不影响其他时期细胞的运转，最终可将细胞群阻断在S期或G/S交界处。5-氟脱氧尿嘧啶、羟基脲、阿糖胞苷、氨甲蝶呤、高浓度ADR、GDR和TDR，均可抑制DNA合成使细胞同步化。其中高浓度TDR 对S期细胞的毒性较小，因此常用TDR双阻断法诱导细胞同步化：
细胞固定化技术的发展历程和主要应用 早在 1 9世纪初叶，人们发现某些微生物细胞具有一种吸附在固体物质表面的天然倾向和特殊功能，并以这种方式被束缚和固定起来。从20世纪印年代开始，国际上固定化酶的研究迅速发展起来;到70年代，作为发酵源的微生物菌体本身的固定化，即固定化微生物，也引起了人们极大的关注。固定化技术是将酶或细胞通过物理或化学方法固定在不溶性或水溶性的膜状、颗粒状、管状的载体上，一般能明显地提高酶对热和酸碱度的稳定性。固定化技术在连续反应过程中不会流失，可用简单的方法回收再生，可使生产连续化，具有节约能耗、降低成本、简化环保措施等诸多优点，使其在生产中被迅速推广。 固定化细胞在食品工业中的应用 目前，世界各国都把固定化细胞研究的成果很快地运用于工业生产过程中，其应用范围远远超出食品加工、轻化工业和制药工业，现已扩展到化学分析、环境保护,能源开发等领域。 一、生产果葡萄糖浆利用微生物的a一淀粉酶和葡萄糖淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖，再用葡萄糖异构酶将葡萄糖转变为较蔗糖更甜的果糖。经提纯、浓缩，即可制得替代蔗糖的新糖源，即含葡萄糖、果糖的果葡糖浆。 1966年日本在工业规模上利用微生物菌体生产果葡糖 浆，首次获得成功，并正式投人生产。1969年又采用菌 体热固法制成的固定化细胞，实现了生产的连续化，产量 达11万t,1978年产量达到100万t以上。其制得的固 定化异构酶微生物生物反应器半衰期289 d1131。 二、柑桔类果汁的脱苦柠檬苦素类脱苦酶，其最适PH值都偏向碱性，而影响其在柑桔加工中的使用，但可以将产生这些酶的细菌细胞固定化，以用于柑桔果汁的脱苦。球形节杆菌含有柠檬苦素D一环水解酶和柠檬酸A一环内醋脱氢酶，可将柠檬苦素转化成17一脱氢柠檬酸A一环内醋;球形节杆菌n含有柠檬苦素醇脱氢酶，可将柠檬苦素转化成柠檬苦素醇.2001年，张惟广等研究了用于柑桔汁脱苦的固定化醋酸杆菌细胞的特性，研究表明，固定化细胞脱苦最佳供氧为:摇床转速160r./min，最适声为4.5,最适温度为25℃;而游离细胞脱苦的相应条件分别为160 r/min,州为5.5，最适温度为25℃。低浓度NaCl对固定化细胞和游离细胞的脱苦都有强烈的抑制作用;固定化细胞在柠碱浓度达到30 mg/纯后，柠碱降解速度趋于饱和，而游离细胞的柠碱浓度则为35mg/kg，固定化细胞的热稳定性比游离细胞好。 三、酱油生产采用固定化细胞技术生产酱油，生产周期缩短。酱油风味改善，速酿优质酱油。Iwasaki等人比较研究了海藻凝胶、圆柱陶瓷和陶瓷颗粒等3种固定化细胞体系在分批发酵过程中的性能。发现3种固定化细胞的产酸能力大致相同，分别为5.2, 5 .3和 4.8k g/衬·d，高于游离细胞的0.5一1.0 kg/衬"d。并提出了一种新的酱油生产工艺，将细胞截留在一个搅拌罐反应器与超滤装置相结合的膜生化反应器中〔161。结果表明，通过膜装置连续移出发酵，产品风味良好，生产效率提高。在酱油的制作过程中，结合酵母和假丝酵母发酵产生多种重要的风味物质，赋予大豆酱油独特的风味。北京金狮酿造六厂选用聚乙烯醇作
细胞周期同步化 在细胞培养过程中，细胞多处于不同的细胞周期时相中，其中有少数细胞在进行有丝分裂活动，其余细胞分别处于G1、S和G2各期。不同时相的细胞对药物干预存在不同反应，会影响实验的重复性，因此，需要获得周期一致性的细胞。利用细胞同步化技术可使细胞大 量的处于同一细胞时期，并可获得该时期大量的物质，如细胞中期时的染色体。细胞周期同步化(synchronization)是指为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、基因表达或凋亡，借助某种自然或人为的实验手段,使细胞群体中处于细胞周期不同时相的细胞停留在同一时相( 除了G0期的细胞)的现象。细胞同步化本质上包括用一定的方法获得一定数量的同步化细胞群和使细胞进入同步化生长的两层含义。 DNA 合成抑制法是通过抑制DNA合成将细胞同步于同一时期的方法。高浓度TdR(胸腺嘧啶核苷)双阻断法是目前常用的抑制DNA 合成的同步化方法。它可逆地抑制DNA 合成，而不影响其他时期细胞的转运，最终可将细胞群阻断在S 期或G1 /S 交界处。其原理是: TdＲ是细胞DNA 合成不可缺少的前体，但向培养基中加入过量TdＲ，可形成过量的三磷酸腺苷，后者能反馈抑制其他核苷酸的磷酸化，从而抑制DNA 合成。它将细胞同步于G1 /S 期交界处，同步化程度高，适用于任何培养体系，可将几乎所有的细胞同步化，但是容易产生非均衡生长，个别细胞体积增大。TdＲ双阻断法因为简单易行且可逆，在肿瘤药理方面对细胞周期同步化的实验中得到了广泛的应用。羟基脲、5-氟脱氧尿嘧啶、阿糖胞苷、氨甲蝶呤和高浓度ADR、GDR也属于DNA合成抑制剂，它们与TdR作用相似，均可通过抑制DNA合成达到同步化的目的。 中期阻断法是利用破坏微管的药物将细胞阻断在M期从而得到同一时期细胞的方法，常用的药物有秋水仙素等。秋水仙素通过抑制微管的聚合，进而抑制有丝分裂装置的形成，将细胞阻断于有丝分裂中期然后再释放使细胞达到同步化。中期阻断法非平衡生长问题不明显，但可逆性比较差，当阻断时间过长时，许多细胞产生异常分裂。过去研究中也发现，同步后的细胞的生长能力明显不如撤去阻断剂后得到的S期细胞旺盛。秋水仙胺、Nocodazole也是目前常用的中期阻断剂。 经过同步化之后的细胞可以通过流式细胞术对其周期进行分析。将细胞用PI（碘化丙啶）染液进行染色，使用流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。由于细胞的DNA含量在不同时期有显著的差异，因此可以将细胞分成 G1/G0期（1倍），S期（1-2倍）和G2/M期（2倍）。流式细胞仪可以根据DNA含量在不同时间内的变化,从而确定细胞周期的长短,也可以直接标记DNA复制（放射性同位素标记）,统计细胞数量与标记细胞的百分比,对细胞周期进行综合分析. 连续分裂的细胞从上一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的整个过程为细胞周期(cell cyc1e)。细胞周期包含四个阶段：①G1期(first gap),又称合成前期，指前一次有丝分裂完成到DNA复制前的一段时期；②S期(synthesis phase),即DNA合成期，为真核细胞分裂(cell pision)间期中进行DNA合成的阶段；③G2期(second gap),为DNA合成后期，指DNA合成结束至有丝分裂开始之间的一个阶段；④M期 (mitosis or pision) ,又称D期，是染色体真正开始分离时期。细胞周期又可分为有丝分裂期（M期）和分裂间期(即G1→S→G2)两个时期。尽管细胞周期中各期的持续时间因不同细胞类型而异，但相对而言M期最短，S期较长。流式细胞仪（flow cytometer；FCM）的工作原理是在样品管中放入待测细胞，在气体的压力下使待测细胞进入充满鞘液的流动室。在细胞流动室里单细胞悬液被鞘流液包绕通过流动室内一定孔径的孔，形成细胞柱。然后通过对流动液体中单列的细胞进行逐一检测，得到单个细胞的光散射和荧光指标，在功能水平上定量分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等的物理、化学特征等多个参数。流式细胞
鸡胚成纤维细胞培养 1、准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、 75%酒精擦拭手至肘部。 2、布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3、选胚：取9-10日龄鸡胚，（注：鸡胚日龄越小，形成细胞活力越好，但产量较低）用新 洁尔灭消毒蛋壳10分钟后放净化台。用碘酒、酒精消毒蛋壳。用镊子打开气室。 4、用另一套镊子将壳膜打开将鸡胚夹起去头、爪、眼，放灭菌生理盐水中。 5、把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先 置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 6、剪切：用眼科剪把组织切成1~2毫米大小的块，以便于消化。 7、处理组织：将已剪碎的组织碎片倒入一个带玻璃珠的灭菌三角瓶中，其中加入0.25%的 胰酶，10个胚约7ml，或加组织消化液，一个胚1ml（组织消化液以及胰酶的配置见微生物指导）结扎瓶口或塞以胶塞。 8、消化：将其置入37℃水浴箱中或用恒温水浴，消化中应不停摇动，如用电磁恒温搅拌器 消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。消化10－15分钟。一般约12分钟。视鸡胚日龄大小而定。越小消化时间越短。见组织松软即可。一般不可消化时间太长否则容易导致细胞活力不足。 9、分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织 已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，加入0.5％的含5％犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液少许。（制法见微生物试验实习指导），用力震摇，或用吸管吹打。 使细胞分散，脱落。然后用纱布过滤或随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清（可以不离心吸掉上清），加入适量含有血清的培养液。 10、计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培 养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。分装在细胞培养瓶中。视细胞多少而定加入培养基。 培养基为0.5％的含5％犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液. 11、将其置入co2细胞培养箱中，37度。瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易 生霉菌，每次换液时需要换新塞。培养24小时进行观察。一般在24－48小时可形成单层细胞。 传代 1. 倾倒培养瓶内旧培养液。 2. 向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液少许，以能覆满瓶底为限。 3. 置温箱中2~5分钟，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化。 4. 吸除消化液，向瓶内注入Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉。注意加Hanks液冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液冲洗，直接加入培养液。 5. 用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。 6. 计数板计数后，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，置温箱中培养。
第三节动物细胞基础巩固 一、选择题 1.在制作人的口腔上皮细胞临时装片的过程中，不需要用到的器具是（）A． B． C． D． 2.关于“观察人的口腔上皮细胞”实验的叙述，不正确的是（） A.在载玻片中央滴加生理盐水 B.碘液染色有利于观察 C.应先用低倍镜进行观察 D.能观察到细胞壁 3.如图是用显微镜观察人的口腔上皮细胞临时装片看到的视野，导致这一结果的操作可能是（）
A.涂抹不均 B.盖盖玻片不当 C.染色不均 D.放大倍数过大 4.在“制作洋葱鳞片叶内表皮细胞临时装片”和“制作人的口腔上皮细胞临时装片”的实验操作中，相关叙述错误的是（） A.制片前，都需用干净的纱布把载玻片和盖玻片擦拭干净 B.制片时，在载玻片中央滴加的液体分别是清水和生理盐水 C.染色时，都是先用碘液处理实验材料，然后再盖上盖玻片 D.盖盖玻片时，都是使盖玻片的一侧先接触液滴，然后缓缓放平 5.如图是某学生制作人的口腔上皮细胞临时装片的操作步骤和观察装片的过程，下列描述正确的是（） A.制作人的口腔上皮细胞临时装片的正确操作步骤是a、b、c、d B.观察装片时甲为镜筒上升，乙为镜筒下降 C.欲将视野右上角的细胞移至视野中央，装片应向右上方移动
D.该同学觉得看到的细胞太小，就转动转换器，又觉得太暗，继而换成平面镜 6.依据图①~③，下列说法错误的是（） A.图示①②虽然形态不同，但其基本结构相同 B.图示①②③的基本结构中都有线粒体和叶绿体 C.图示②③主要区别是③有细胞壁、液泡，②没有 D.图示①②③都是构成生物体的基本单位 二、实验探究题 7.下列图1、图2分别是口腔上皮细胞、番茄果肉细胞结构示意图，据图回答下列问题： （1）图1中，口腔上皮细胞基本结构：A是_____；C是_____。 （2）图2中，D和E是植物细胞不同于动物细胞的结构，D是_____；E是_____，主要功能是_____和_____。 （3）切开梨、西瓜等水果时，会流出一些汁液，这些汁液来自细胞中的_____。
成纤维细胞生长因子及其与受体作用机制 的研究进展1 姜媛媛，任桂萍，王文飞，郝建权，李德山 东北农业大学生命科学学院生物制药教研室，哈尔滨（150030） E-mail：deshanli@https://www.doczj.com/doc/a416730532.html, 摘要：成纤维细胞生长因子(FGF)是一类多肽类物质，其中大多数成员可与肝素结合发挥作用。目前已知FGF至少包括23个因子，即FGF1～23。部分FGF家族成员N末端有大约3O个氨基酸残基组成的典型信号肽序列，可以分泌到细胞外。FGF家族成员是一类生理功能较广泛的生长因子，功能包括促进细胞有丝分裂、趋化与血管生成、促进中胚层和神经外胚层细胞的存活与生长等。本文根据最近的研究成果对 FGF因子及其受体研究进展做一综述，并主要对FGF因子特征及其研究趋势进行了探讨。 关键词：FGF，FGF受体，肝素 中图分类号:Q74 引言： 成纤维细胞生长因子最早是从脑和垂体的提取液中发现的，该物质是一种能促进成纤维细胞生长的多肽类活性物质，可以通过与细胞膜特异性受体结合对细胞生长进行调节。从70年代中期到目前已进行了大量广泛的研究，目前已知FGF至少包括23个因子，它们在一级氨基酸序列上有一定的同源性，并有类似的生物学功能，且广泛存在于体内多种组织中。FGF对中胚层和神经外胚层来源的细胞具有十分明显的促细胞分裂增殖作用，并且在机体内的胚胎发育、细胞生长分化、创伤组织愈合及肿瘤发生发展中起着十分重要的作用。 1. 成纤维细胞生长因子（FGF）家族 成纤维生长因子（Fibroblast growth factor, FGF）又被称为肝素亲和生长因子(Heparin binding growth factor, HBGF)，是一类通过与细胞膜特异性受体结合发挥作用的多肽分子。现已知FGF家族至少包括23个成员，即FGF1～FGF23。FGF家族成员之间的氨基酸序列同源性约为25%～50%，其每个成员都有140个氨基酸的中轴，该中轴在不同的成员中有高度的同源性。结构分析表明，此中轴折叠成12条逆向平行的β链，它们又进一步形成圆柱状的结构。部分FGF家族成员N末端有大约3O个氨基酸残基组成的典型信号肽序列，使得它们可通过内质网一高尔基复合体的经典(即自分泌和旁分泌)途径被分泌到细胞外，但其中也有部分FGF则因本身缺乏信号肽结构，不能向外分泌，只能在细胞受损时释放[1]。多数FGF（如FGF3～8、10、15、17～19、21～23）的N末端具有典型的信号肽序列。而FGF16和FGF20虽然没有明确的信号肽序列却也能高效地分泌到细胞外[12]。FGF1 和FGF2也缺乏信号肽序列和正常的分泌途径，却也能出现在胞外基质，推测两者可能来自受伤的细胞，或者通过与内质网-高尔基体通路不同的细胞脱颗粒机制释放至胞外的。此外，FGF 11～14没有典型的信号肽序列，因此认为这些FGF是在胞内发挥作用[13]。由于FGF家族成员之间的氨基酸序列有25％～50％的同源性，分子结构有一定的共性，故FGF不同分子之间的生物学效应既有相似性，又有各自的特点[1-3]。 FGF1(aFGF)和FGF2(bFGF)是最先被发现，也是迄今为止研究最充分的两个成员，因其1本课题得到黑龙江省科技厅重点攻关项目（编号：2006G0461-00）的资助。
Cell synchronization of Drosophila cell line Cell synchronization of Drosophila Kc cells Kc cells were cultured in 15-cm plates at a density of 1×106cells/mL in Schneider’s Media (Invitrogen 11720034) supplemented with 10% FCS and penicillin/streptomycin. The cells were arrested in G2 by the addition of the hormone Ecdysone (Sigma H5142, 蜕皮激素, C27H44O6) at a final concentration of 1.7 μM. To arrest the cells at the G1/S transition, the cells were released from Ecdysone into 1 mM HU. For replication timing, cells were pulsed with 50 μg/mL BrdU (Roche 280 879) for 1 h at either 0 or 6 h following release from HU. For identification of early origins, cells were released from G2 into medium containing both BrdU and HU at the same concentrations as above. Cell cycle progression was monitored by FACS. Molecular formula of Ecdysone Cell synchronization of Drosophila S2 cells: Briefly, log-phase (2x106/ml) cells were first incubated with 0.2 nM ponasterone (甾酮A, C27H44O6) A for 24 h to obtain G2 cells. Cells were then rinsed with phosphate-buffered saline (PBS) three times, resuspended in fresh Schneider’s Drosophila medium (GIBCO) containing 5% each of Fetal Bovine Serum and Bovine Calf Serum (JRH Biosciences), along with 1.5 mM hydroxyurea (HU, 羟基脲, CH4NO), and cultured for 18 h to obtain G1/S cells. Afterwards, these cells were rinsed with PBS three times, cultured in the above-specified medium without HU and harvested at various time points for analyses. Molecular formula of ponasterone BrdU-FACS or FACS analyses : Cells grown in 6-well plates were treated with BrdU (10 μM) for 45-60 min, fixed with 80% cold ethanol, treated with 3N HCl, washed and incubated with anti-BrdU MAb (Becton Dickinson) for 60 min. After washing, cells were incubated with Alexa Fluor ? 488 goat anti-mouse IgG (Invitrogen) for 30 min. These cells, or ethanol-fixed cells (for direct FACS assays), were treated with propidium iodide and RNase A for 30 min before FACS analyses. Reference: Lee et al.,2010, JBC. Drosophila Octamer Elements and Pdm-1 Dictate the Coordinated Transcription of Core Histone Genes. David M. MacAlpine., 2004, Genes Dev., Coordination of replication and transcription along a Drosophila chromosome.
固定液配方（细胞免疫组化，用的是4%多聚甲醛固定的）： 我们用的4%多聚甲醛是先配制成12.5%的，然后再用0.1m PB稀释的。 0.1m PB配方（PH值7.4）1000ml 磷酸氢二钠48.693g 磷酸二氢钠 5.023g 三蒸水1000ml 12.5%多聚甲醛（PH值7.4）1000ml 多聚甲醛125g 三蒸水1000ml 磁力搅拌器加热搅拌，温度控制在60℃以下，如仍不溶，加NaOH （三蒸水先放800ml，10小时左右，再补加200ml） 4%多聚甲醛（PH值7.4）1000ml 12.5%多聚甲醛320ml 0.1m PB 680ml 步骤： 1 将已消毒的20mm盖玻片置于90mm培养皿中，按2*104/ml的细胞密度将细胞接种于培养皿中进行细胞爬片，5天后进行免疫细胞组织化学染色鉴定。 2 PBS清洗标本3次各1 min。 3 冰丙酮固定15 min。 4 空气干燥5min。 5 PBS清洗标本3次各2 min。
6 0.5%Triton X-100( DPBS配) 孵育1次20 min。 7 PBS清洗标本3次各2 min。 8 3%H2O2孵育15 min。 9 DPBS清洗标本3次各2 min。 10 封闭血清孵育（5%正常二抗血清DPBS液）20min。 11一抗孵育（PBS配，滴度1：200，湿盒）4OC 过夜或37OC 60 min。阴性对照最好用一抗来源血清，否则用PBS液 12 PBS清洗标本3次各5 min。 13 二抗工作液孵育（湿盒）37OC 30 min。 14 PBS清洗标本3次各5 min。 15 C液（湿盒）37O C30 min。 16PBS清洗标本3次各5 min。 17DAB显色（避光，镜下观察至棕色）约3~10min。 18蒸馏水洗2次1 min。 19苏木素复染0.5~1min。 20自来水洗30min。 21树胶封片。 注意事项： 1、良好的细胞爬片是进行免疫组织细胞的基础，要获得良好细胞爬片须注意以下： （1）对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达5天以上，这样细胞爬片才较牢固，冲洗时不易脱片； （2）接种的细胞密度适中，以2*104/ml为宜，若细胞密度太高，5天后细胞连接成片冲洗时易脱片； 2、冰丙酮固定后玻片可密闭保存于4O C冰箱，冰丙酮固定时会使细胞收缩，可用80%冰丙酮或2%多聚甲醛固定。 3、冲洗时只须轻轻振荡培养皿，（不可用吸管太用力吹，易脱片） 4、加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜 5、Triton X-100（屈立通）表面活性剂，脱去细胞膜中最主要的成分脂质，对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用，对于抗原表达在胞浆者时间要控制好，使其破坏细胞膜而核膜破坏较少。
细胞生物学实验报告 细胞原代培养 姓名： 学号： 班级： 专业： 同组成员： 一、实验原理
细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。 原代培养的方法： 1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。用Hanks 液洗涤2—3次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。将组织块贴于培养瓶进行培养。 2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的%的胰蛋白酶。370C磁棒搅拌消化20－30分钟。然后终止消化。用几层无菌纱布过滤。取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。 取材注意事项： 取材要注意新鲜和保鲜。取材应严格无菌。取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。 二、实验目的 1、理解细胞原代培养原理 2、熟悉细胞原代培养方法与过程 3、了解细胞原代培养的应用 4、独立进行细胞原代培养操作 三、实验材料 手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。 动物：9-12日龄的鸡胚蛋 四、实验步骤
2.1.3 动物细胞 基础达标卷 1.在观察人的口腔上皮细胞时,如果在显微镜视野中出现了血细胞,则说明( ) A.口没有漱干净 B.牙签刺伤了口腔壁 C.载玻片没有擦拭干净 D.碘液用量过多 2.在制作动物细胞模型时,塑料袋、果脯、琼脂分别相当于细胞的哪些结构?( ) A.细胞膜、细胞核、细胞质 B.细胞膜、细胞质、细胞核 C.细胞核、细胞质、细胞膜 D.细胞核、细胞膜、细胞质 3.下列能正确表示动物细胞内各结构之间位置关系的是( ) 甲乙丙丁 A.图甲 B.图乙 C.图丙 D.图丁 4.水稻叶肉细胞和人体口腔上皮细胞都有的结构是( ) ①细胞壁②细胞膜③细胞质④细胞核⑤液泡 A.②③④ B.②③⑤ C.①③④⑤ D.①③⑤ 5.在光学显微镜下可以观察到的结构是( ) A.人口腔上皮细胞的细胞壁 B.洋葱表皮细胞的细胞膜 C.洋葱表皮细胞的叶绿体 D.黄瓜表层果肉细胞的叶绿体 6.在制作人的口腔上皮细胞、洋葱鳞片叶内表皮细胞临时装片时,在载玻片上分别滴加的液体和它们染色共用的液体依次是( ) A.碘液、清水、清水 B.生理盐水、清水、碘液 C.清水、生理盐水、碘液 D.碘液、生理盐水、碘液 7.下图是某同学在显微镜下所观察到的口腔上皮细胞临时装片的一个视野,其中有细胞、气泡、杂质,请回答下列问题。 (1)图中①②③分别是、、。 (2)如果视野内③过多,而玻片又是清洁干净的,则可能是因为在刮取口腔上皮细胞前。 (3)因口腔上皮细胞的透明度较高,观察时应将视野调(填“明”或“暗”),方法是。 8.下图中甲和乙所示为“观察人的口腔上皮细胞临时装片”实验的部分操作,丙为显微镜,丁为显微镜下观察到的人的口腔上皮细胞。请根据图回答下列问题。
不同浓度秋水仙素和nocodazole对绒山羊成纤维细胞周期同步化的影响 杨惠茹，肖红梅，蔡婷，俎红丽，于新蕾，刘志红，李金泉，王志新 （内蒙古农业大学动物科学学院动物遗传育种与繁殖重点实验室，呼和浩特 010018 ） 摘要：本文旨在探索更加优化的条件，使绒山羊成纤维细胞经处理后更多的处于有丝分裂G2/M 期。本研究分别采用秋水仙素和nocodazole （诺考达唑）试剂对绒山羊成纤维细胞进行周期同步化处理，用流式细胞仪检测G2/M 期的细胞数量进行比对，观测最佳作用浓度。结果表明，秋水仙素的使用浓度不宜过大；其次，添加秋水仙素时间的不同也会对试验结果产生明显的影响。另外在相同条件下，经nocodazole处理的绒山羊成纤维细胞周期同步化效果比秋水仙素好，最优的处理条件是300 ng/mL nocodazole处理成纤维细胞24 h，所得G2/M期的细胞所占比例为15.10%。结果提示对于绒山羊的成纤维细胞来说，细胞周期同步化处理时，选择nocodazole更好一些。 关键词：绒山羊；成纤维细胞；秋水仙素；nocodazole（诺考达唑）；细胞周期同步化；流式细胞仪 Dolezel等（2011) 报道随着测序技术的发展，使用流式细胞仪分离单条染色体，将拓展测序技术应用的领域，对于山羊这种大基因组动物更有广泛的应用价值。流式细胞术可以分选出指定的染色体，能快速精确地检测染色体数目和结构的畸变，以及非整倍体和染色体缺失。目前已在l7个植物物种中利用流式细胞术对染色体进行分析与分选。Macas等（1993）利用FCM对碗豆的流式核型进行分拣，结合PCR技术对其DNA进行物理定位，成功实现了USP基因、碗豆球蛋白基因和假基因在相应染色体区域上的定位。施家琦等 (1998) 在人类的染色体分选研究中，通过采用流式细胞技术分离染色体实现对人二倍体成纤维细胞的单分散染色体核型的分析及分选。最近的研究中，Yang等（2011) 通过流式技术分离出单个染色体已经完成了基因组的测序工作。翟中和等（1992) 采用流式分离单条染色体工作的核心在于富集足量同步化的中期染色体的细胞核型，因此细胞同期化的处理是研究中最基础最为重要的一步。细胞周期时间长短的主要差别在G1期，而S期、G2期和M 期的总时长相对恒定，尤其是M期持续的时间更为恒定，常常仅持续半小时左右。通过添加有丝分裂抑制剂，来阻滞细胞的有丝分裂使其停滞在G2/M 期，人工调控增加G2/M期的细胞数量，为单条染色体分选做前期准备。目前，秋水仙素是一种最为常用的有丝分裂抑制剂，起作用机理在于抑制中期纺锤体的形成。nocodazole是一种类似于秋水仙素的细胞微管抑制剂,也可阻止微管蛋白聚合和纺锤体形成,使细胞同步于M期,从而使大部分细胞的发育停滞在G2/M期和M期，与秋水仙素试剂相比毒性较低。Tanaka等（1995）研究表明采用nocodazole处理法对大鼠进行同期化处理后，M 期细胞的数量显著增加。因此，本研究将采用这两种试剂对成纤维细胞同期化的最优化条件做探索。 1 材料和方法 1.1材料 1.1.1 试剂耗材和动物 秋水仙素、nocodazole、胎牛血清（Hyclone）、，0.25%胰酶（Gibco）、DMEM/F12培养基（Hyclone）、无水乙醇（国产）、DPBS（Hyclone）、青链霉素（Gibco）、PI(碘化丙啶)、15 mL离心管（corning）、50 mL离心管（corning）、细胞培养瓶（corning）25 cm2、塑料吸管。 本研究选用绒山羊公羊耳源组织，来自于内蒙古鄂尔多斯农场。 1.1.2 主要仪器设备 流式细胞仪( Beeton Diekinson FACSCalibur )、CO2恒温培养箱 ( Galaxy A，RXBiotech) 、
免疫细胞化学常用试剂 一、固定剂 大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。 目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。 1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3） 试剂：多聚甲醛40g 0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml 配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L 磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。 该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。 2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠 试剂：A液：多聚甲醛40g 蒸馏水400ml B液：Na2HPO4·2H2O16.88g 蒸馏水300ml C液：NaOH 3.86g 蒸馏水200m
配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1n NaOH 或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存备用。 该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5%～1%。该固定剂较温和，适于组织的长期保存。组织标本于该固定液中，4℃冰箱保存数月仍可获得满意的染色效果。 3．Bouin’s液及改良Bouin’s液 试剂：饱和苦味酸 40%甲醛250ml 冰醋酸50ml 配制方法：先将饱苦味酸过滤，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后存于4℃冰箱中备用。冰醋酸最好在临用前加入。改良Bouin’s液即不加冰醋酸。 该固定液为组织学、病理学常用固定剂这一，对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整。但因偏酸（pH为3～3.5），对抗原有一定损害，且组织收缩较明显，故不适于组织标本的长期保存。此外，操作时，应避免吸入或与皮肤接触。 4．Zamb oni’s(Stefanini’s)液 试剂：多聚甲醛20g 饱和苦味酸 150ml Karasson-Schwlt’s PB至1000ml 配制方法：称取多聚甲醛20g，加入饱和苦味酸150ml，加热至60℃左右，持续搅拌使充分溶解、过滤、冷却后，加Karasson-Schwlt’s PB至1000ml充分混合（Karasson –Schwlt’s磷酸缓冲液的配制配制方法见后）。 该固定液适于电镜免疫细胞化学，对超微结构的保存较纯甲醛为优，也适于光镜免疫细胞化学研究，为实验室常用固定剂之一。我们在应用中，常采用2.5%的多聚甲醛和30%的饱和苦味酸，以增加其对组织的穿透力和固定效果，保存更多的组织抗原。固定时间为6～18h。 5．PLP液PLP液即过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液 （Periodate-Lysine-paraform-alde－hyde fixative）
一、鸡胚成纤维细胞的体外培养 鸡胚成纤维细胞在病毒学研究中十分常用。孵化8－12d的鸡胚可用作培养的材料来源。 （一）实验材料 1. 鸡胚：孵化10d的受精蛋数个。孵化方法是将受精蛋放到38.5℃孵卵箱或恒温箱中，静置。每日翻动1—2次，以防止鸡胚粘连到蛋壳上影响发育。箱内湿度(40～70％)可通过在箱底放一盛水盘来维持。鸡胚的孵化期为2ld。孵化前，如遇蛋壳表面污物较多，可用刀片等器具刮除，不要用湿布擦拭，更不能用酒精棉球消毒或者用水洗蛋。孵育前可将受精蛋保存在10℃左右，保存期一般不超过10d。也有人将受精蛋保存在4℃冰箱中。 2. 消化液：含0.25％胰蛋白酶、青霉素100 1U／ml、链霉素100 μg/ml混合消化液。用Hanks 液或HEPES液配制。 3. 培养液：DMEM培养液，添加10％－20％的胎牛血清（FCS）、青霉素100 IU/ml、链霉素100 μg/mL。 4. 其它培养用品：手术器械、平皿、三角瓶或15ml血清瓶、离心管、100目不锈钢筛网、培养瓶或培养板、振荡水浴箱、离心机等。 （二）操作步骤 1)取孵化10d的鸡胚，分别用碘酒与酒精棉球擦拭消毒，晾干。用一已消毒金属器具将受 精蛋大头端击破，用镊子小心夹去破碎蛋壳，然后撕去气室外面的膜，暴露出尿囊绒膜及附着的血管。开口大小以受精蛋内容物不溢出为宜，但不宜太小。用镊子轻轻夹住鸡胚的颈部，小心取出鸡胚，放于无菌培养皿中，除去头部、四肢、内脏和皮肤。 2)胚体用Hanks液或生理盐水清洗3次，切成1－2 mm3的小块，然后转移到容积适中的 三角瓶或15ml血清瓶内。 3)加入适量消化液，一般每10个鸡胚加20 m1消化液，用胶塞密封瓶口。 4)在振荡水浴箱上37℃慢速搅拌5－10 min。加入少量血清钝化胰蛋白酶。然后通过100 目不锈钢筛网，制备细胞悬液，将细胞悬液转移到离心管中。 5)离心（800 rpm，10 min），弃上清液，将细胞沉淀用培养液洗2次。 6)加入培养液，用吸管吹打制成细胞悬液。用血球计数板计数细胞。 7)以0.2～1X06个细胞/ml的密度接种细胞。于37℃、5％CO2培养箱中培养。每2－3d换 液1次。待细胞汇合成片后，可行传代培养。 （三）结果 在倒置显微镜下观察，用8～12d龄鸡胚培养的细胞主要为具有长突起的梭形、星形或三角形的成纤维细胞。用I型和Ⅲ型胶原的抗体作免疫细胞化学分析，培养物以呈阳性反应的成纤维细胞为主。 （四）讨论 鸡胚成纤维细胞在普通培养液中具有生长优势，一般不需特殊处理，经几次传代后就可逐渐排除其它细胞，得到较纯的成纤维细胞。体外培养的胚胎细胞的形态与所取鸡胚的胚龄有关。若用体节前期的胚胎，培养的细胞不是典型的长的或星形的成纤维细胞，而为宽扁的细胞，这可能与胚胎细胞的分化状态有关。
梧州市初中生物七年级上册第二单元第一章第三节动物细胞同步练习 姓名:________ 班级:________ 成绩:________ 一、选择题 (共15题；共30分) 1. （2分）(2019·北部湾) 如图为动植物细胞结构模式图，对它们结构和功能的叙述，正确的是（） A . 图甲可表示人的血液中成熟的红细胞，结构①的功能是控制物质出入细胞 B . 图乙所示的细胞长时间放在清水中会涨破 C . 西瓜清甜多汁，主要与图乙所示细胞中的结构②有关 D . 甲乙所示的细胞中都有细胞生活所需的能量转换器﹣叶绿体和线粒体 2. （2分）在制作人的口腔上皮细胞的装片时，需要往载玻片上滴加（） A . 清水 B . 0.9﹪的生理盐水 C . 9﹪的盐水 D . 碘液 3. （2分）观察口腔上皮细胞临时装片时，我们看到细胞中染色最深的是（） A . 细胞壁 B . 细胞膜 C . 细胞质 D . 细胞核 4. （2分） (2019七上·高州期中) 绿色植物能够利用光能制造有机物，这与细胞中的哪一个结构有关系（） A . 细胞膜 B . 液泡 C . 叶绿体 D . 线粒体 5. （2分）观察人的口腔上皮细胞时，必须将取出的口腔上皮细胞放在生理盐水中，原因是（） A . 使细胞维持正常的形态 B . 避免细胞干燥 C . 避免细胞缺水死亡 D . 使细胞透明便于观察
6. （2分）下列哪项，不是酵母菌和斑马的共同点（） A . 具有细胞结构 B . 要进行呼吸作用 C . 细胞内具有细胞核 D . 属于消费者 7. （2分） (2017七上·龙岗期中) 细胞膜由脂质、蛋白质、糖类组成，下列关于其成分和功能的说法正确的是（） A . 脂质丰富的细胞膜功能复杂 B . 蛋白质种类和数量多的细胞膜功能复杂 C . 糖类的多少决定着细胞膜功能的复杂程度 D . 脂质含量达 50%，对细胞膜的功能起决定性作用 8. （2分） (2019八上·铜陵期末) 依据图中四种结构示意图①～④，下列说法错误的是（） A . 图示①、②分别是植物细胞、动物细胞结构示意图 B . 图④示生物营寄生生活，没有细胞结构也没有自己的遗传物质 C . 图③也是一个细胞，它有细胞壁却没有成形的细胞核 D . ①与②的主要区别是①有细胞壁、液泡和叶绿体等 9. （2分）制作人体口腔上皮细胞临时装片的正确顺序是（） ①在载玻片中央滴一滴清水②在载玻片中央滴一滴生理盐水 ③用消毒牙签从口腔侧壁处轻轻刮几下④把牙签放在载玻片的液滴中均匀地涂抹几下⑤滴加碘液染色⑥盖上盖玻片 A . ①③④⑥⑤ B . ②③④⑥⑤ C . ①③④⑤⑥ D . ②③④⑤⑥ 10. （2分）小明用显微镜观察了洋葱表皮细胞和人的口腔上皮细胞作了如下记录，其中正确的是（） ①洋葱表皮细胞中央有较大的液泡 ②口腔上皮细胞由细胞膜、细胞质、细胞核构成 ③洋葱表皮细胞中有叶绿体