大鼠脑皮质微血管内皮细胞的培养

生和发展都是以内皮细胞受损为基础，肺微血管内皮细胞在病理条件下，不仅是炎症反应的主要靶细胞，更是活跃的炎症细胞和效应细胞。

其功能和结构的完整性对于维持正常肺功能至关重要，这种特殊的细胞类型是研究肺功能不全及许多肺部疾病发生机制的理想细胞模型来源[4]。

近年，从生物化学、细胞生物学及分子生物学等方面探究内皮细胞生理功能的研究课题日益增多，有助于更全面认识PMVECs并了解其相关机制，进而可对相关疾病进行预防和治疗[5]。

近20年，国内外对PMVECs的研究取得众多成果，但其养困难、成本高、重复性差、易污染等问题，降低了培养成功率，因此建立完整高效的PMVECs培养方法意义重大。

本文总结了PMVECs培养的一般方法，具体流程，见图1。

图1 皮细胞培养一般流程1 肺微血管内皮细胞培养法1.1 原代培养肺微血管内皮细胞原代培养是指从活体生物中将肺组织取下进行培养，在完成首次传代培养之前的细胞都称为原代培养[6]。

国内外研究报道的肺微血管内皮细胞的方法主要有2种，一是组织块贴壁法[7-10]，二是酶消化法[11]。

2种方法各有利弊，组织块法操作简单、细胞成活率高、成本低、可减少因酶消化造成的细胞损伤，但是细胞迁出时间不好把握且组织块去除不彻底会造成其他杂细胞污染等。

酶消化法培养周期快、细胞生长速率快，但是消化时间和酶浓度不好控制，细胞成活率可能会因为消化时间过长受到影响。

1.1.1 组织块贴壁法组织块贴壁法是指将取自活体生物的组织，在无菌条件下剪成1×1×1 mm3小块，平铺在培养器皿中，加入含胎牛血清的培养基在37 ℃5%CO2条件下培养的方法。

组织块贴壁法的一般操作步骤：先去除组织胸膜，将去除胸膜的肺组织剪下1～3 mm左右的肺组织边缘，切成1×1×1 cm3组织块，用基础培养基DMEM清洗多次，至少3次，均匀地贴在25 cm2的培养瓶中，放入5% CO2 37 ℃的培养箱中培养1 h，等组织块贴壁后，加入完全培养基DMEM（20%FBS、ECGS、肝素钠、双抗等），放入培养箱中16 h以上，去除未贴壁的组织块，加入新的培养基，以后每2～3 d更换1次培养基。

大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代、试剂Poly-L-lysine (Sigma,P2636)DMEM (Invitrogen,11995-065)二、器械手术器械：眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显微镊x2 （金钟，WA3050）、显微剪x13ml 移液管( Biologix, 30-0138A1)南京军区总院神经内科实验室 许丽丽 2012-12-011) 2) 3) FBS (Invitroge,10099-141)4) HBSS, no Calcium, no Magnesium (Invitrogen, 14170-112)5) 0.25% Trypsin-EDTA ( Invitrogen, 25200-056)6) DPBS (HyClone ，SH30028.01B )7) dd H 2O8) 75％酒精1) 2) 100 ml 小烧杯3) 200 目不锈钢筛4) 细胞计数器（求精）5) 50ml 离心管( Corning ， 430828)、 15ml 离心管( Corning ， 430790)6) 25ml 培养瓶( Corning ， 430639)或 75ml 培养瓶( Corning ， 430641)7) 100ml 玻璃瓶（蜀牛）8) 直径为 60mm 的培养皿 LabServ,310109010)9)10) 过滤器( Millex-GP, SLGP033R)B11) 注射器：50ml、5ml 各112) Pipette and pipette tips13) 冰袋、手套、口罩Day 11、消毒1.1 将解剖器械、枪头高温高压消毒15 分钟，消毒结束后放入烘箱中烘干待第二天使用。

1.2 打开操作台紫外线灯消毒30 分钟。

2、包被培养板2.1 戴手套，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，点燃酒精灯。

2.2取PLL用DPBS将其稀释至100 pg/ml 。

2.3以PLL包被培养瓶，量以覆盖培养瓶底面为宜。

大鼠肺微血管内皮细胞培养及鉴定*谢　崧　杨晓静　钱桂生　王关嵩(第三军医大学新桥医院,　重庆　630037)摘要　取大鼠周边肺组织进行肺微血管内皮细胞培养。

将肺组织切成小块,用含有20%新生牛血清、肝素90L g/ ml、L-谷胺酰胺4mmol、青霉素100U/ml和链霉素100L g/m l的R PM I-1640培养基培养。

血细胞立即从肺组织周围游出。

继而是肺微血管内皮细胞。

成纤维细胞及其他细胞72h才游出。

培养60h后取出肺组织块,培养瓶中只有微血管内皮细胞和血细胞。

后者可通过传代除去。

获得的肺微血管内皮细胞具有规律的鹅卵石样形态和对异植物血凝素结合试验及八因子相关抗原免疫荧光染色均阳性。

关键词　大鼠　肺循环　微循环　内皮细胞　细胞培养　肺微血管在生理和病理情况下都起着重要作用,如与成人呼吸窘迫综合征、肺动脉高压[1]等的发生有关。

目前仅限于肺动脉内皮细胞的研究,而肺微血管和大血管之间据文献报道在表型和功能有着显著的不同[2]。

故有培养和研究肺微血管内皮细胞的必要。

虽然肺有大量的血管内皮细胞,但同时存在40多种类型的细胞尤其成纤维细胞和平滑肌等细胞的迅速生长,使内皮细胞生长受抑制。

分离和培养纯的肺微血管内皮细胞较为困难。

国内未见肺微血管内皮细胞培养的报道。

本文采用简单的方法成功地分离和培养出大鼠肺微血管内皮细胞。

1　材料和方法1.1　主要试剂　RPM I-1640培养基为美国Gibco 公司产品。

新生牛血清由华西医科大学公共卫生学院生产。

兔抗人八因子相关抗原抗血清为DAKO公司产品,华美分装。

荧光标记异植物血凝素为Sigm a 公司产品。

荧光标记羊抗兔1gG由卫生部上海生物制品研究所生产。

抗菌素为青霉素钠盐和硫酸链霉素。

L-谷氨酰胺为第二军医大学分装。

胰蛋白酶和肝素钠均为上海生化试剂商店提供。

大鼠肺动脉内皮细胞按本研究所建立的方法[3]培养。

1.2　取材　选重200-300g健康雄性Wistar大鼠,10%乌拉坦(10L l/mg)腹腔麻醉。

血管内皮细胞培养方法全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：血管内皮细胞（vascular endothelial cell，VEC）是血管内膜上的一种细胞，它们起着维持血管结构和功能的重要作用。

近年来，血管内皮细胞的培养方法逐渐成为生物医学领域的研究热点之一。

良好的血管内皮细胞培养方法不仅有助于研究心血管疾病的发生机制，还可以为新药的研发提供重要参考依据。

本文将详细介绍血管内皮细胞培养的方法和技巧，希望对相关研究人员和医学工作者有所帮助。

一、血管内皮细胞来源血管内皮细胞可以从多种来源获得，包括人类或动物的血管组织。

通常情况下，从人体的脐带血、外周血或组织中分离得到的血管内皮细胞具有较高的纯度和活性，适合于体外培养。

一些商业生物技术公司也提供血管内皮细胞的原代细胞培养服务，可以方便地购买到高质量的细胞用于研究。

二、血管内皮细胞培养基的选择血管内皮细胞培养基是培养血管内皮细胞的基本营养液，不同类型的细胞需要不同种类的培养基。

一般来说，常用的血管内皮细胞培养基包括Eagle's minimum essential medium（EMEM）、Dulbecco's modified Eagle's medium（DMEM）和Medium 199等。

这些培养基通常含有必需氨基酸、维生素、矿物质、生长因子、胎牛血清等营养成分，可以提供适宜的环境促进细胞生长。

1、原代细胞的分离和培养将采集到的组织样本进行酶消化处理，分离出血管内皮细胞，并通过贴壁法或悬浮培养法将其传代培养。

在传代培养的过程中，需要定期更换培养基、观察细胞的形态和数量变化，以确保细胞的健康生长。

2、细胞的传代和冻存随着细胞的传代次数增加，细胞的增殖能力和活性逐渐下降，需要进行细胞的传代和冻存。

传代前需要对细胞进行细胞数计数和活力检测，传代后要及时观察细胞的形态和生长情况，确保细胞的健康状态。

3、细胞的实验处理在进行实验前，需要对培养的细胞进行处理，如细胞分裂抑制（如丙酮酸、羟基脲等）、细胞增殖刺激（如VEGF、EGF等）等。