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单克隆抗体技术的基本原理
单克隆抗体技术是一种通过体外合成获得具有单一抗体特异性的抗体的方法。
它的基本原理是将目标抗原注射到动物体内，使其免疫系统产生多种抗体。
然后，从动物的脾脏或骨髓中提取免疫细胞，并与癌细胞融合形成杂交瘤。
杂交瘤是一种具有细胞融合能力的免疫细胞，在体外环境中能够不断增殖，并持续产生抗体。
这些杂交瘤细胞称为“克隆”，每个克隆对应一种特定的抗体。
在获得这些抗体的克隆细胞后，科学家使用细胞培养和筛选技术，筛选出能够高效产生目标抗体的克隆细胞。
通过单克隆抗体技术，可以得到高纯度、高特异性的抗体。
这些抗体可以用于检测特定抗原的表达、分析细胞信号传导、研究蛋白质功能等领域。
与传统的多克隆抗体相比，单克隆抗体具有更好的重现性和稳定性，因此在医学诊断和生物学研究中有广泛应用。
单克隆抗体名词解释微生物学单克隆抗体是指由单一克隆的B细胞产生的抗体，它们具有相同的抗原结合部位。
在免疫系统中，当机体遭遇外来抗原时，B细胞会分化成浆细胞，产生大量的抗体来与抗原结合并中和病原体。
然而，B细胞群体的抗体可能存在多样性，因为它们可以产生不同的抗原结合部位来应对多种抗原。
为了获得单一克隆抗体，科学家们开发了一种技术叫做单克隆抗体制备。
这个过程涉及到从免疫动物（通常是小鼠）中采集抗体产生的B细胞，然后融合它们与癌细胞形成杂交瘤细胞，得到能够无限复制的杂交瘤细胞。
这些杂交瘤细胞称为单克隆细胞株，它们能够持续产生单一克隆抗体。
单克隆抗体在微生物学中有广泛的应用。
它们可以用于检测和诊断微生物感染，例如通过特定的单克隆抗体可以检测到病原微生物的存在。
此外，单克隆抗体还可以用于治疗微生物相关的疾病。
例如，通过结合病原微生物的抗原，单克隆抗体可以中和病原微生物，阻止其侵入宿主细胞，从而起到治疗作用。
此外，单克隆抗体还可以用于研究微生物的生物学特性和致病机制。
通过分析单克隆抗体与微生物抗原的结合方式，可以了解微生物的表位结构和抗原变异情况，从而深入了解微生物的分类和进化关系。
此外，单克隆抗体还可以用于研究微生物感染的免疫机制，揭示免疫系统对微生物的应对方式和抗体的作用机制。
总结来说，单克隆抗体是由单一克隆的B细胞产生的具有相同抗原结合部位的抗体。
它们在微生物学中有广泛的应用，包括检测和诊断微生物感染、治疗微生物相关的疾病以及研究微生物的生物学特性和致病机制。
这些应用使得单克隆抗体成为微生物学研究和临床实践中的重要工具。
一、实验目的1. 学习单克隆抗体的制备方法；2. 掌握单克隆抗体的鉴定技术；3. 了解单克隆抗体在免疫学研究和临床诊断中的应用。
二、实验原理单克隆抗体（Monoclonal Antibody，mAb）是由单个B细胞克隆产生的，具有高度特异性和亲和力。
单克隆抗体的制备通常采用杂交瘤技术，即将B细胞与肿瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，杂交瘤细胞既具有B细胞的抗体产生能力，又具有肿瘤细胞的无限增殖能力。
通过筛选和培养杂交瘤细胞，可以得到大量相同的单克隆抗体。
三、实验材料1. 实验动物：Balb/c小鼠；2. 抗原：目的蛋白；3. 细胞株：SP2/0（小鼠骨髓瘤细胞）；4. 培养基：IMDM培养基、DMEM培养基、RPMI-1640培养基；5. 试剂：FCS、HAT（Hypoxanthine-Aminopterin-Thymidine）、PEG（聚乙二醇）、兔抗小鼠IgG-HRP（辣根过氧化物酶标记）、羊抗兔IgG-FITC（荧光素异硫氰酸酯标记）；6. 仪器：CO2培养箱、倒置显微镜、酶标仪、流式细胞仪等。
四、实验方法1. 抗原免疫小鼠：将抗原注入Balb/c小鼠体内，免疫小鼠，制备抗体。
2. 细胞融合：收集免疫小鼠脾细胞，与SP2/0细胞按一定比例混合，加入PEG，诱导细胞融合。
3. 融合细胞筛选：将融合细胞接种于96孔板，加入HAT培养基，培养7-10天，观察细胞生长情况，筛选出阳性克隆。
4. 阳性克隆扩大培养：将阳性克隆扩大培养，制备杂交瘤细胞。
5. 阳性克隆抗体检测：收集杂交瘤细胞培养上清，进行ELISA检测，鉴定阳性克隆。
6. 阳性克隆抗体纯化：将阳性克隆抗体进行亲和层析或蛋白A/G层析，纯化抗体。
7. 阳性克隆抗体鉴定：采用流式细胞术或免疫荧光技术，鉴定阳性克隆抗体。
五、实验结果1. 免疫小鼠制备抗体：免疫小鼠后，血清抗体水平明显升高。
2. 细胞融合：融合细胞生长良好，阳性克隆筛选成功。
3. 阳性克隆扩大培养：阳性克隆杂交瘤细胞生长旺盛。
单克隆抗体的名词解释单克隆抗体（Monoclonal Antibody）是一种由单一细胞克隆产生的抗体，具有高度的特异性和单一的免疫活性。
它是分子生物学和免疫学领域的一项重要研究成果，被广泛应用于医学、生物技术和药物研发领域。
1. 抗体的基本概念抗体，也被称为免疫球蛋白，是人体免疫系统中的一种主要成分。
它由免疫细胞分泌，用于识别和中和入侵机体的外来物质（抗原），包括细菌、病毒等。
抗体的结构由重链和轻链组成，形成Y型。
抗体通过与抗原结合，可以促使免疫细胞对其进行消灭。
2. 单克隆抗体的产生过程单克隆抗体的产生主要通过杂交瘤技术实现。
杂交瘤是一种由癌细胞和免疫细胞融合形成的细胞系，具有不同细胞系的特点。
通过将免疫细胞与癌细胞融合，形成杂交瘤细胞，可以实现对特定抗原的高产抗体。
然后，从杂交瘤细胞中筛选出目标抗体，进行克隆和扩增。
3. 单克隆抗体的优势相比于多克隆抗体，单克隆抗体具有以下优势：3.1 高度特异性单克隆抗体通过针对特定抗原进行筛选和克隆，保证了抗体的高度特异性。
这意味着单克隆抗体可以更准确地识别和结合目标抗原，提高了诊断和治疗的准确性和有效性。
3.2 稳定性由于单克隆抗体是由单一细胞克隆得到的，其产生的抗体都具有相同的结构和特性。
相比于多克隆抗体，单克隆抗体具有更高的稳定性，不易受到批次差异的影响。
3.3 大规模生产经过克隆与扩增后，单克隆抗体可以在体外大规模生产。
这种高通量的生产方式可以满足临床和科研的需要，为抗体药物的发展和临床应用提供了可行性。
4. 单克隆抗体的应用领域由于其优越的性能，单克隆抗体在医学和生物技术领域得到了广泛的应用。
4.1 诊断单克隆抗体作为特异性的识别分子，可以用于临床诊断，检测和鉴定疾病和感染的相关指标。
例如，肿瘤标志物检测中常用的抗体检测方法就是应用单克隆抗体。
4.2 治疗单克隆抗体也被应用于治疗领域，发展出了一类被称为抗体药物的新型治疗药物。
这些药物可以通过特异性地结合和中和靶标分子，实现对疾病的治疗。
单克隆抗体制备实验过程
抗体制备实验一般分为抗体克隆、筛选、纯化和表征四个步骤，其中
抗体克隆是抗体制备实验的前提步骤，克隆抗体是从雌配子小鼠体内得到
其对抗原的单克隆抗体，是抗体制备的关键步骤。
1. 合成抗原或者从天然资源中获取抗原：合成抗原包括多肽抗原
（如biotin-GSH等）和糖蛋白抗原（如活性细胞皮质激素等）；从天然
资源中获取抗原则包括病毒样本和免疫原，比如结核分枝杆菌的血清浆及
其他微生物。
2.接种抗原：根据抗原的不同，采用不同的接种方法，比如多肽抗原，可以采用皮下或肌肉注射的方法将抗原接种于雌配子小鼠身上，以致于小
鼠体内产生对抗原的抗体。
3.分离抗体：通过血液和胸腺组织中抗体的分离筛选，获取单克隆抗体。
4. 抗体克隆：从抗体分离所获得的抗体，经过细胞学的方法进行抗
体克隆。
克隆过程中，可以利用多肽抗原，利用细胞杂交的方法进行对单
克隆抗体的从cloned。
5.筛选单克隆抗体：利用免疫染色的方法进行抗体筛选和确认，以确
定抗体株。
6.抗体纯化：经过单克隆抗体筛选和确认后，可以利用离子交换柱等
方法进行抗体纯化，从而获得高纯度的抗体制剂。
单克隆抗体技术单克隆抗体的克隆化方法经过抗体测定的阳性孔，可以扩大培养，进行克隆，以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体。
克隆的时间一般说来越早越好。
因为在这个时期各种杂交瘤细胞同时旺盛生长，互相争夺营养和空间，而产生指定抗体的细胞有被淹没和淘汰的可能。
但克隆时间也不宜太早，太早细胞性状不稳定，数量少也易丢失。
克隆化的阳性杂交瘤细胞，经过一段时期培养之后，也还会因为细胞突变或特定染色体的丢失，使部分细胞丧失产生抗体的能力，所以需要再次或多次克隆化培养。
克隆化次数的多少由分泌能力强弱和抗原的免疫性强弱而决定。
一般说，免疫性强的抗原克隆次数可少一些，但至少要3～5次克隆才能稳定。
克隆化的方法很多，包括有限稀释法、显微操作法、软琼脂平板法及荧光激活分离法等。
（一）有限稀释法1．材料（1）微量培养盘，盘内各孔于克隆化前一天培养小鼠腹腔细胞（即饲养细胞）每孔2万～4万。
（2）HT培养基2．操作方法（1）取出抗体阳性孔细胞，用HT培养液制成细胞悬液。
并取样进行台盼兰染色，计数。
（2）用HT培养液将细胞稀释成200个/ml、40个/ml、20个/ml和的悬液。
（3）用吸管将细胞悬液分别种入微量培养盘，每孔0.05ml，细胞含量分别为10个/孔、2个/孔、1个/孔和0.5个/孔。
（4）5％CO2饱和湿度，37℃培养。
（5）每天用倒置显微镜观察克隆生长情况，选择只有一个集落生长的孔，弃掉两个以上和没有细胞生长的孔。
（6）克隆大量繁殖后，布满孔底的1/3～1/2时，测培养液抗体。
（7）抗体阳性孔细胞，移到有饲养层的组织培养瓶中，并传2～4代就可以脱离饲养细胞，建成克隆株。
（二）软琼脂克隆化借助撒在软琼脂上单个细胞定位生长，而达到克隆化，具体操作如下：1．配2.5％的琼脂糖30ml，水浴溶化后，移入45℃水浴中。
2．将117ml完全DMEM液和3ml 10倍浓度的DMEM液混合，置45℃水浴预热。
3．将琼脂糖与DMEM液混合，即为含0.5％琼脂糖的完全DMEM液，并加75×108 脾细胞。
4．每块平皿加10ml，于室温中凝固。
5．DMEM中的细胞与DMEM—琼脂1:1混合，将细胞琼脂混合物2ml铺于凝固的平板上，使其全部覆盖。
6．放入CO2箱饱和湿度，37℃培养10天。
7．用PBS配制0.6％琼脂糖，于沸水浴溶解后，置45℃，在保温情况下取一试管，迅速加入0.1ml 25％羊红血球，0.2ml豚鼠补体，2.7ml 0.6％琼脂糖。
8．用3ml琼脂糖—羊红血球混合液覆盖克隆。
于37℃CO2箱孵育1h~2h。
从克隆上部溶解羊红血球的溶血范围，可筛选抗羊红血球Ig。
（三）显微镜操作法在直径6cm培养皿中，加入1ml 1.0×108细胞悬液放置5％CO2饱和湿度，37℃温箱中放置30min以上，倒置显微镜下，寻找那些与周围相距甚远的单个细胞，将毛细管口（一头有直角弯头毛细管，一头连接一尺长乳胶管，用口控制液体进入）水平置放于液面上，左右微动，直到看见管口，对准细胞，吸入毛细管，将管中细胞移到预先加有2.0×104~5.0×104饲养细胞96孔板内，培养后，即可获得单个细胞形成的克隆。
（四）荧光激活分离法用一种荧光激活细胞分类器（Fluorescein Activafed Cell Sorter，FACS）。
其基本原理是：将细胞经荧光抗体染色后，经喷嘴形成单个细胞的线形液滴，在莱塞光激发下，荧光素发射荧光，此信号由光电倍增管接收，再结合细胞形态大小产生光散射信号，经电脑处理，产生信号并与预定的信号对比，根据细胞荧光强度及细胞大小不同，将细胞分成不同级别，在电场中发生偏离，而分别收集于不同容器中。
单克隆抗体的制备（一）杂交瘤细胞的大量繁殖克隆化的细胞可以在体外进行大量培养，收集上清液而获得大量的单一的克隆化抗体。
不过体外培养法得到的单克隆抗体有限，其不能超过特定的细胞浓度，且每天要换培养液。
而体内杂交瘤细胞繁殖可以克服这些限制。
杂交瘤细胞具有从亲代淋巴细胞得来的肿瘤细胞的遗传特性。
如接种到组织相容性的同系小鼠或不能排斥杂交瘤的小鼠（无胸腺的裸鼠），杂交瘤细胞就开始无限地繁殖，直至宿主死亡。
产生肿瘤细胞的小鼠腹水和血清中含有大量的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，这种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的100~1 000倍。
利用免疫抑制剂，如降植烷、液体石蜡、抗淋巴细胞血清等，可以加速和促进肿瘤的生长。
1．材料（1）经高压灭菌的降植烷。
（2）Balb/c鼠：5~8周龄。
（3）杂交瘤细胞：取对数生长期的细胞。
（4）RPMI—1640培养液（5）新生牛血清2．操作方法(1) 于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，注射后１～９周内种植细胞。
(2) 收取对数生长期的杂交瘤细胞，用５％FCS—1640液洗涤一次，1 000r/min离心10min。
(3) 取样，用台盼兰染色，计活细胞数，重新用５％FCS—1640液配成1.0×107细胞/ml的悬液。
(4) 给注射了降植烷的小白鼠接种杂交瘤细胞，每只腹腔注射1ml（含1.0×107个细胞/ml）。
(5) 接种后10天左右时间肿瘤体积最大，此时可由腹腔抽取腹水，每隔1~3天取1次，可取10次。
血清可由腋下动脉或心脏采血后分离。
（二）单克隆抗体的提纯1．材料(1) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液20 mMol/L NaCl(2) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液40mMol/L NaCl(3) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液80 mMol/L NaCl(4) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液(5) 饱和硫酸铵液(6) DEAE—纤维素柱2．操作方法（1）小鼠腹水用冷PBS液稀释4倍后，于1.00×105转离心30min，去沉淀。
（2）在4℃于上清中缓缓滴加饱和硫酸铵液，边加边搅拌，使溶液最终为50％硫酸铵浓度。
（3）此溶液置冰中30min~60min，然后5 000r/min离心10min，去上清。
（4）将沉淀溶于Tris－HCl缓冲液（40mMol/L NaCl）中（溶液可能混浊）。
（5）装入透析袋于Tris－HCl缓冲液（20 mMol/L NaCl）中透析除盐。
（6）离心去沉淀。
（7）溶液稀释（1:100或更高倍稀释）后，于280nm测蛋白含量，估计蛋白质含量1A 280unit=0.8mg蛋白质一般每ml腹水中，含有总蛋白约25mg~36mg。
（8）过DEAE—纤维素柱：纤维素柱高40cm，以20mMol/L NaCl Tris缓冲液平衡。
透析样品以Tris 缓冲液等量稀释。
样品进入柱床速度为1ml~2ml/min，以NaCl线形梯度洗脱。
大部分单克隆IgG于40 mMol/L和80mMol/L NaCl洗脱，也有极少例外的单克隆抗体于120 mMol/L ~150 mMol/L NaCl洗脱。
测OD280nm收集蛋白峰，单克隆IgG保存备用。
杂交瘤产生各种免疫球蛋白，但主要是IgG和IgM，究竟是哪种为主，则决定于抗原的免疫程序。
免疫一次，且3天后就取脾，多为产生IgM的B淋巴细胞。
免疫多次的多为IgG。
（三）单克隆抗体的鉴定1．杂交瘤细胞染色体的检查采用秋水仙素裂解法进行。
2．单克隆抗体的类型、亚型的测定：购买兔抗小鼠Ig类型和亚型的标准抗血清，采用琼脂扩散法或ELISA夹心法测定单抗的Ig类型和亚型。
3．单抗的特异性鉴定可以采用各种方法，如免疫荧光法、ELISA法、间接血凝和免疫印迹技术等，同时还需做免疫阻断试验等。
4．单抗的效价测定可采用凝集反应、ELISA或放射免疫测定。
不同的测定方法效价不同。
培养上清液的效价远不如腹水的效价。
采用凝集反应，腹水效价可达5×104。
而采用ELISA检查，腹水效价可达1.0×106。
单抗的效价以培养上清和腹水的稀释度表示。
5．必要时还可以测定单抗的亲和力和识别抗原表位的能力测定。
单克隆抗体技术抗原提纯与动物免疫对抗原的要求是纯度越高越好，尤其是初次免疫所用的抗原。
如为细胞抗原，可取1×107个细胞作腹腔免疫。
可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化，如为聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原，可将抗原所在的电泳条带切下，研磨后直接用以动物免疫。
选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠龄在8～12周，雌雄不限。
为避免小鼠反应而不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。
免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同，因动物、抗原形式、免疫途径不同而异，以获得高效价抗体为最终目的。
免疫间隔一般2～3周。
一般被免疫动物的血清抗体效价越高，融合后细胞产生高效价特异抗体的可能性越大，而且单克隆抗体的质量（如抗体的浓度和亲和力）也与免疫过程中小鼠血清抗体的效价和亲和力密切相关。
末次免疫后3～4天，分离脾细胞融合。
骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备选择瘤细胞株的最重要的一点是与待融合的B细胞同源。
如待融合的是脾细胞，各种骨髓瘤细胞株均可应用，但应用最多的是Sp2/0细胞株。
该细胞株生长及融合效率均佳，此外，该细胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链。
细胞的最高生长刻度为9×105/ml，倍增时间通常为10～15h。
融合细胞应选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞（活性应大于95％）。
骨髓瘤细胞株在融合前应先用含8-氮鸟嘌呤的培养基作适应培养，在细胞融合的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为2105/ml，次日一般即为对数生长期细胞。
在体外培养条件下，细胞的生长依赖适当的细胞密度，因而，在培养融合细胞或细胞克隆化培养时，还需加入其他饲养细胞（feedercell）。
常用的饲养细胞为小鼠的腹腔细胞，制备方法为用冷冻果糖液注入小鼠腹腔，轻揉腹部数次，吸出后的液体中即含小鼠腹腔细胞，其中在巨噬细胞和其他细胞。
亦有用小鼠的脾细胞、大鼠或豚鼠的腹腔细胞作为饲养细胞的。
在制备饲养细胞时，切忌针头刺破动物的消化器官，否则所获细胞会有严重污染。
饲养细胞调至1×105/ml，提前一天或当天置板孔中培养。
细胞融合细胞融合是杂交瘤技术的中心环节，基本步骤是将两种细胞混合后加入PEG使细胞彼此融合。
其后吧培养液稀释PEG，消除PEG的作用。
将融合后的细胞适当稀释，分置培养板孔中培养。
融合过程中有几个问题应特别注意。
①细胞比例：骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可从1:2到1:10不等，常用1:4的比例。
应保证两种细胞在融合前都具有较高活性。
②反应时间：在两种细胞的混合细胞悬液中，第1min滴加4.5ml 培养液；间隔2min滴加5ml培养液，尔后加培养液50ml。
