㊀㊀2023年4月第38卷第2期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀JOURNAL OF LIGHT INDUSTRY㊀Vol.38No.2Apr.2023㊀收稿日期:2022-02-27基金项目:国家自然科学基金青年基金项目(31901682);广东省普通高校青年创新人才类项目(2018KQNCX259);广东省创新强校工程创新团队项目(2021KCXTD035)作者简介:邓莉梅(1996 ),女,四川省资阳市人,广东工业大学硕士研究生,主要研究方向为食品递送系统㊂E-mail :1176993285@通信作者:于泓鹏(1979 ),男,河南省商丘市人,广东工业大学副教授,博士,主要研究方向为油脂制备及安全㊂E-mail :yuh-peng@邓莉梅,刘宇佳,朱杰,等.甾醇分子差异对脂质体结构稳定性的影响[J].轻工学报,2023,38(2):33-40.DENG L M,LIU Y J,ZHU J,et al.Effect of sterol molecular difference on the structural stability of liposomes[J].Journal of Light Industry,2023,38(2):33-40.DOI:10.12187/2023.02.004甾醇分子差异对脂质体结构稳定性的影响邓莉梅1,2,刘宇佳2,朱杰2,于泓鹏11.广东工业大学轻工化工学院,广东广州510006;2.东莞理工学院化学工程与能源技术学院/中国轻工业健康食品开发与营养调控重点实验室,广东东莞523808摘要:通过添加胆固醇㊁β-谷甾醇和豆甾醇,采用乙醇注入法结合动态高压微流射技术制备甾醇脂质体,研究不同甾醇对脂质体膜结构稳定性的影响㊂结果表明:β-谷甾醇和豆甾醇的加入,使甾醇脂质体粒径从(48.35ʃ0.41)nm 分别增至(106.27ʃ0.90)nm 和(107.27ʃ0.59)nm ,Zeta 电位保持不变,均在-30mV 左右;电子显微镜观察发现,添加甾醇的脂质体形成了稳定的磷脂双分子层结构;甾醇可以使脂质体的盐稳定性和pH 稳定性增强,但对温度稳定性无显著影响;β-谷甾醇和豆甾醇的加入使脂质体膜的流动性㊁疏水性和微极性都显著减小,这表明脂质体磷脂双分子膜的结构变得更加致密㊂关键词:胆固醇;β-谷甾醇;豆甾醇;脂质体;结构稳定性中图分类号:TS201.1㊀㊀文献标识码:A㊀㊀文章编号:2096-1553(2023)02-0033-080 引言脂质体(Liposome)是由磷脂自组装形成的具有双分子层结构的闭合囊泡,尺寸分布可以在10nm到几μm 之间,是食品营养与健康领域一种非常重要的递送介质[1]㊂脂质体具有与生物膜类似的空间分子结构,因而具有良好的生物相容性㊁安全性㊁非免疫原性及缓释效果,在食品㊁医药㊁化妆品等领域都倍受关注[2-3]㊂目前,脂质体在乳制品[4]㊁饮料[5]㊁肉制品[6]㊁巧克力[7]等食品中的应用与研究较为广泛㊂脂质体是一种热力学不稳定体系,易受温度㊁pH 值㊁离子强度等因素影响而引发膜结构破裂㊁磷脂层降解㊁包封物泄露等问题,限制了其在复杂食品体系中的推广与应用㊂为了改善脂质体结构的稳定性,通常采用的物理处理方法包括超声[8]㊁均质[9]㊁动态高压微射流[10]等,也可以通过化学方法对脂质体膜进行修饰,其中,甾醇[11]㊁多糖[12]㊁人工高聚物[13]㊁聚乙二醇[14]㊁蛋白质[15]等作为脂质体双层磷脂膜的修饰成分得到了广泛关注㊂甾醇的分子结构属于类异戊二烯衍生物,是细胞膜的主要构成成分,对细胞膜的结构和功能起着㊃33㊃㊀2023年4月第38卷第2期㊀重要作用㊂但在脂质体形成过程中,甾醇本身无法形成囊泡,通常需要以相对较高的浓度将其结合到磷脂的双分子层膜中,以调节磷脂膜的流动性和通透性[16]㊂与其他脂质体相比,甾醇脂质体制备工艺简单,容易实现规模化生产,并已应用于医药行业㊂目前,胆固醇(Cholesterol)在脂质体的制备过程中是最常使用的甾醇之一,然而胆固醇摄入过多会增加人体患心脑血管疾病和动脉粥样硬化的风险[17]㊂随着人们对食品品质和健康需求的提高,以及对功能性食品的逐渐重视,对人体健康更加有益的植物甾醇逐渐受到业界青睐㊂植物甾醇具有与胆固醇类似的分子结构,其中,β-谷甾醇(β-sitosterol)和豆甾醇(Stigmasterol)具有降低心脑血管疾病风险㊁抗癌㊁抗炎镇痛等功效[18]㊂此外,β-谷甾醇和豆甾醇分子结构不同于胆固醇,两者在C24上的侧链均为乙基基团,而豆甾醇在C22上还具有双键结构[11]㊂但这种结构上的差异对脂质体制备与贮藏过程中磷脂双分子层结构稳定性的影响尚不明确㊂基于此,本研究拟制备包含胆固醇㊁β-谷甾醇及豆甾醇的3种甾醇脂质体,通过测定甾醇脂质体的平均粒径和Zeta电位,结合电镜图像分析,对比不同甾醇对所制备甾醇脂质体微观结构的影响;采用荧光法测定甾醇脂质体磷脂膜的流动性㊁疏水性及微极性,并通过红外光谱探讨甾醇与磷脂的相互作用关系;最后测定不同甾醇脂质体在盐溶液㊁温度㊁pH值等环境因素胁迫下的稳定性,旨在为制备能够替代胆固醇的植物甾醇脂质体用于构建新型健康食品脂质递送体系提供理论支持和数据参考㊂1㊀材料与方法1.1㊀材料与试剂大豆卵磷脂(SPC,纯度90%)㊁二甲基亚砜(DMSO,纯度99%),上海阿拉丁生化科技股份有限公司产;胆固醇(纯度98%)㊁β-谷甾醇(纯度98%),上海源叶生物科技有限公司产;豆甾醇(纯度90%)㊁1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(DPH,纯度98%)㊁芘(纯度97%)㊁8-苯氨基-1-萘磺酸(ANS,纯度97%),上海麦克林生化科技有限公司产;无水乙醇㊁吐温-80㊁丙酮㊁HCl㊁NaOH㊁NaCl,均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司产㊂1.2㊀主要仪器与设备M-110EH30型高压微射流均质机,美国Mic-fofluidics公司产;Nicolet IS50型红外光谱仪,美国赛默飞公司产;F-7100型荧光光谱仪,日本日立高新技术公司产;Zetasizer Nano-ZS90型激光粒度分析仪,英国Malvern公司产;Spark型多功能微孔板检测仪,瑞士TECAN公司产;Sigma-500型场发射扫描电镜,德国蔡司公司产㊂1.3㊀实验方法1.3.1㊀甾醇脂质体的制备㊀采用乙醇注入法结合动态高压微射流技术,制备胆固醇脂质体(Choles-terol Liposome,Chol-LP)㊁β-谷甾醇脂质体(β-sitos-terol Liposome,Sit-LP)和豆甾醇脂质体(Stigmasterol Liposome,Sti-LP),以空白脂质体(Liposome,LP)为对照㊂方法如下:将磷脂和甾醇以物质的量比3ʒ1溶于无水乙醇中,用注射器匀速缓慢地注入含有吐温-80(质量分数为0.2%)的去离子水中,乙醇和水的体积比为1ʒ8;以750r/min的转速在室温下搅拌60min,使磷脂充分水化,将混合溶液转移至茄形瓶中,40ħ旋转蒸发20min,至乙醇全部除去;将粗脂质体溶液经动态高压微射流18000psi循环1次,得到磷脂质量浓度为10mg/mL的脂质体溶液㊂1.3.2㊀脂质体微观结构表征㊀使用激光粒度分析仪测定脂质体的粒径和Zeta电位㊂为避免多次散射引起测量误差,将待测样品用去离子水稀释10倍后加入聚苯乙烯比色皿中,在25ħ下平衡120s,折光系数为1.490,检测器角度为90ʎ,每个样品至少平行测量3次,结果取平均值㊂将样品滴在硅片上自然晾干并喷金处理30s,将喷金后的样品放入电镜仓中,以3kV的加速电压在场发射扫描电镜下观察脂质体的微观形貌㊂1.3.3㊀脂质体膜的流动性测定㊀采用DPH荧光探针法研究脂质体膜的流动性[19]㊂用去离子水将脂质体稀释10倍后与DPH-DMSO(2μmol/L)溶液以5ʒ1的体积比混合,避光孵育60min㊂孵育后的样品在激发波长360nm㊁发射波长430nm的条件下记录荧光强度,通过公式②计算荧光偏振度(P):G=I90,0/I90,90①㊃43㊃㊀邓莉梅,等:甾醇分子差异对脂质体结构稳定性的影响P=(I0,0-GˑI0,90)/((I0,0+GˑI0,90)②其中,I0,0和I0,90分别为平行的发射光偏振为激发光的荧光强度;I90,0和I90,90分别为垂直的激发光偏振为发射光的荧光强度;G为光栅校正系数㊂P与膜的流动性成反比,P越大,脂质体膜的流动性越小㊂1.3.4㊀脂质体膜的疏水性测定㊀脂质体膜的疏水性采用ANS荧光探针法测定[20]㊂将脂质体稀释10倍后与ANS(8mmol/L)水溶液混合,样品与ANS的体积比为50ʒ1,混合物在室温下避光孵育30min㊂荧光测量的激发波长为350nm,发射光谱采集范围为375~600nm,PTM电压为600V,狭缝宽度均为5nm㊂由于ANS对疏水腔具有较高的亲和力,同时在水环境中没有荧光信号,故荧光强度反映了ANS 的吸收量,用于表示分子的有序程度㊂1.3.5㊀脂质体膜的微极性测定㊀参考芘荧光探针法研究脂质体膜的微极性[20]㊂将脂质体稀释10倍后与芘-丙酮(2mmol/L)溶液混合,样品与芘-丙酮溶液的体积比为50ʒ1,将混合物置于4ħ冰箱避光孵育12h㊂荧光测量的激发波长为338nm,发射光谱采集范围为350~450nm,电压为600V,狭缝宽度均为2.5nm㊂记录芘荧光光谱第1个峰(I1)和第3个峰(I3)的荧光强度,并计算I1/I3㊂1.3.6㊀傅里叶变换红外光谱(FTIR)测定㊀将冻干的样品放置在红外光谱仪样品台上,应用ATR模式研究不同甾醇与磷脂的分子间相互作用,每个样品扫描32次并计算平均值,扫描范围为400~ 4000cm-1,分辨率为4cm-1㊂1.3.7㊀脂质体稳定性测定㊀1)盐稳定性:参考K.D.Tai[19]的方法,将NaCl(100~1000mmol/L)溶液加入到脂质体悬浮液中,NaCl溶液与脂质体悬浮液的体积比为9ʒ1㊂混合液在室温下孵育1h,通过激光粒度分析仪测定脂质体的粒径㊂粒径大小变化程度用ΔS表示:ΔS=孵育后的粒径-初始粒径初始粒径ˑ100%③㊀㊀2)pH稳定性:配制pH值为2.0~12.0的缓冲液并加入到脂质体悬浮液中,缓冲液与脂质体悬浮液的体积比为9ʒ1㊂混合液在室温下孵育1h,通过激光粒度分析仪测定脂质体的粒径㊂粒径大小变化程度用ΔS表示㊂3)温度稳定性:使用激光粒度分析仪的trend 模式测量温度对脂质体粒径的影响㊂温度范围为25~65ħ,测量间隔温度为10ħ,平衡时间为2min㊂粒径大小变化程度用ΔS表示㊂1.4㊀统计分析所有实验至少完成3次平行实验,结果以(平均值ʃ标准差)表示㊂数据使用SPSS19.0软件进行统计分析,当P<0.05时,认为差异具有统计学意义㊂2㊀结果与分析2.1㊀甾醇对脂质体微观结构的影响分析甾醇对脂质体微观结构与粒径分布的影响如图1所示㊂由图1a)和1b)可知,甾醇的加入使脂质体粒径显著增大(P<0.05)㊂未添加甾醇时,脂质体粒径为(48.35ʃ0.41)nm,脂质体溶液呈无色透明状;添加甾醇后,Chol-LP㊁Sit-LP和Sti-LP的粒径分别增加至(98.24ʃ1.21)nm㊁(106.27ʃ0.90)nm和(107.27ʃ0.59)nm,脂质体溶液变为乳白色状㊂K.D.Tai等[21-23]在研究中也发现,甾醇的加入会使脂质体粒径显著增大(P<0.05)㊂这可能是由于甾醇的加入使磷脂排列更紧密,增强了膜的刚性,使脂质体在均质时不易被破碎,且易形成较大的囊泡结构㊂但甾醇对脂质体的Zeta电位没有显著影响,所有脂质体的Zeta电位值均在-30mV左右㊂这可能是由于甾醇不带电荷,且甾醇的加入未引起磷脂头部基团发生剧烈的变化[24]㊂甾醇的加入对脂质体的分散性具有明显的影响㊂由图1c) f)可知,未添加甾醇的脂质体粒径呈双峰分布,甾醇的加入使脂质体粒径呈明显的单峰分布,且单分散系数显著减小(P<0.05),这表明添加甾醇会使脂质体粒径分布更均一㊂未添加甾醇时,空白脂质体没有形成磷脂双分子层结构(见图1c)),只形成了均匀球形的单室脂质囊泡;添加甾醇后,所有脂质体样品都呈现出规则的磷脂双分子层结构,双分子层厚度约为100nm㊂这是由于在使用场发射扫描电镜制样过程中,脂质体从原来的球形结构变成扁平结构,增加了粒径观察尺寸㊂该结果表明,甾醇在脂质体制备过程中对脂质体的结构稳定性具有重要意义㊂㊃53㊃㊀2023年4月第38卷第2期㊀图1㊀甾醇对脂质体微观结构与粒径分布的影响Fig.1㊀Effects of sterols on the microstructure and particle size distribution of liposomes2.2㊀甾醇对脂质体磷脂膜结构稳定性的影响分析㊀㊀采用3种结合在磷脂膜不同部位的荧光探针研究甾醇对脂质体磷脂膜结构稳定性的影响㊂DPH是一种疏水性极强的荧光探针,易进入脂质体膜烃链中间的疏水核心区域,其长轴通常与脂肪酸酰基链平行排列,常被用于测量膜的流动性和微黏度[25]㊂当磷脂膜流动时,DPH会产生不同程度的倾斜,经荧光激发可产生水平和垂直方向不同的偏振分量,从而反映脂质体膜的流动性㊂甾醇对脂质体磷脂膜结构稳定性的影响如图2所示㊂由图2a)可知,添加甾醇后,脂质体的偏振度显著增加,即膜流动性显著降低(P<0.05)㊂这是由于甾醇的加入使磷脂形成了更有序更紧密的膜结构,使DPH的运动受到了限制㊂值得注意的是,3种甾醇脂质体磷脂膜的偏振度无显著性差异,表明胆固醇㊁β-谷甾醇和豆甾醇都使脂质体形成了致密的膜结构㊂杨贝贝等[22,26]研究表明,β-谷甾醇对磷脂膜排序程度大于豆甾醇,这可能与甾醇添加量有关㊂当甾醇添加量过多时,甾醇会在磷脂膜中聚集㊁析出,从而使磷脂膜的流动性增加㊂K.D.Tai等[20]研究发现,当β-谷甾醇的添加量大于33%时,脂质体的偏振度开始降低㊂ANS是一种对微环境极性变化高敏感度的荧光探针,常用来测量脂质双分子层中磷脂分子极性头基的迁移程度及磷脂膜的疏水性,其水相中没有荧光信号,与脂质体结合后荧光强度会显著增强[27]㊂图2b)显示了不同甾醇脂质体在484nm处的ANS荧光强度及其发射光谱,由此可知,甾醇的加入使脂质体的ANS荧光强度显著降低(P<0.05)㊂研究[27]表明,ANS结合发生在磷脂膜与水相的交界处,即磷酸基附近㊂脂质体的荧光强度降低,表明甾醇的加入使进入磷脂膜的ANS荧光探针减少了㊂这可能是因为磷脂头部基团与甾醇之间形成了分子间相互作用,阻碍了ANS与磷脂膜的结合㊂同时,3种甾醇脂质体的ANS荧光强度之间存在显著差异(P<0.05),表明不同甾醇分子结构与磷脂产生了不同强度的分子间作用力㊂芘的荧光发射光谱在370~430nm范围内具有5个特征振动峰,其绝对强度㊁相对强度㊁宽度和位置取决于微环境的极性[28]㊂I1与I3的比值常被用来研究脂质体磷脂膜的微极性,I1/I3越小,表明芘所处微环境的微极性越弱[29]㊂由图2c)可知,甾醇的加入显著降低了脂质体磷脂膜的微极性(P<㊃63㊃㊀邓莉梅,等:甾醇分子差异对脂质体结构稳定性的影响0.05),表明甾醇的加入使脂质体磷脂膜的结构更图2㊀甾醇对脂质体磷脂膜结构稳定性的影响Fig.2㊀Effects of sterols on stability ofliposome membrane structure加紧密,水分子较难进入磷脂双分子层中㊂Sit-LP和Sti-LP 的微极性显著低于Chol-LP,这可能是由于β-谷甾醇和豆甾醇的烷基链比胆固醇多一个乙基,这增加了磷脂分子与甾醇分子间的空间位阻,使芘不易进入磷脂膜的疏水区域㊂2.3㊀甾醇与磷脂的相互作用分析不同甾醇脂质体的FTIR 图如图3所示㊂由图3可知,甾醇的加入没有引起脂质体膜发生剧烈的变化㊂所有脂质体在3306~3319cm -1范围内都出现了宽而强的峰,这是O H 的伸缩振动峰㊂此外,CH 2的不对称拉伸振动峰(2923cm -1)㊁C O 的拉伸振动峰(1735cm -1)㊁PO 2-的不对称伸缩振动峰(1230cm -1)和C O C 的不对称拉伸振动峰(1140cm -1)在所有脂质体均有出现㊂Sit-LP 和Sti-LP 的CH 2对称拉伸振动峰(2853cm -1)向高频有微小的移动㊂Sit-LP 和Chol-LP 的PO 2-对称伸缩振动峰(1030cm -1)和N + CH 3的不对称拉伸振动峰(987cm -1)都向低波数迁移,O H 的弯曲振动峰(1652cm -1)也有较大的迁移,表明β-谷甾醇和胆固醇的OH -与磷脂的PO 2-形成了氢键㊂由此可知,甾醇的加入对磷脂的尾链影响较小,对磷脂的头部基团影响较大㊂图3㊀不同甾醇脂质体的FITR 图Fig.3㊀FITR spectroscopy of different sterol liposomes2.4㊀甾醇对脂质体环境稳定性的影响分析脂质体的环境稳定性研究对进一步考查脂质体在复杂食品体系中的应用情况至关重要㊂不同甾醇对脂质体环境稳定性的影响如图4所示㊂由图4a)可知,甾醇的加入对脂质体的盐稳定性有较大提升㊂当盐浓度超过200mmol /L 时,LP 的粒径增加明显,在800mmol /L 时粒径达到最大值㊂LP粒径增大可能是由于LP 的磷脂膜没有甾醇的支㊃73㊃㊀2023年4月第38卷第2期㊀撑,在高盐浓度下,磷脂的过度堆积使膜更易塌图4㊀不同甾醇对脂质体环境稳定性的影响Fig.4㊀Effects of different sterols onenvironmental stability of liposomes陷,随后聚集形成更大的囊泡[30]㊂而对于Chol-LP㊁Sit-LP和Sti-LP,盐的加入使脂质体的粒径明显减小,且粒径基本不随盐浓度的增加而增加,整体较为稳定㊂在盐溶液中,脂质体粒径变小可能是由于盐浓度增加可使脂质体外的渗透压增加,脂质体脱水,粒径减小㊂由图4b)可知,LP的粒径在低于65ħ时无明显变化,在65ħ时急剧增加,可能发生了膜的破裂和聚集㊂Sit-LP对温度变化较为敏感,其粒径随温度的上升逐渐增加㊂Sti-LP和Chol-LP的温度稳定性较好,在实验温度范围内,Sti-LP与Chol-LP的粒径无显著变化㊂由如4c)可知,甾醇的加入使脂质体的pH稳定性有一定程度的提高(P<0.05)㊂未添加甾醇的LP粒径受pH值的影响较大,在pH值<5及pH值>9时,粒径均有明显的增加,这可能是由于高浓度的H+㊁OH-引起了膜融合㊂在较低pH值下,磷脂易被质子化,从而破坏磷脂间的相互作用,脂质体稳定性降低[31]㊂在较高pH值下,OH-诱导磷脂头基取向发生改变,膜结构被破坏[24]㊂甾醇与磷脂形成的氢键抑制了头基的改变及质子化,因此,添加甾醇的脂质体其粒径基本不随pH值的改变而改变㊂但甾醇脂质体粒径整体较处理前都明显减小,可能是受离子强度改变的影响㊂综上所述,甾醇的加入使脂质体的环境稳定性有所增强,这对脂质体在复杂食品体系中的应用具有重要意义㊂3 结论本文研究了不同甾醇对脂质体结构稳定性的影响,通过对脂质体微观结构㊁磷脂膜结构稳定性及甾醇与磷脂分子间相互作用进行考查,发现,甾醇的加入使脂质体的粒径显著增大,但对脂质体的Zeta电位基本没有影响;胆固醇㊁β-谷甾醇和豆甾醇的加入对脂质体的盐稳定性和pH稳定性都有较显著的提升,但对温度稳定性基本没有改善㊂此外,通过脂质体膜微观结构研究发现,β-谷甾醇和豆甾醇均能使磷脂膜结构更加致密,且β-谷甾醇脂质体的膜稳定性明显优于胆固醇脂质体,具有可替代胆固醇制备脂质体的潜力㊂本研究深入探讨了不同甾醇对脂质体结构稳定性的影响,可为制备能够替代胆固醇的植物甾醇脂质体用于构建新型健康脂质递送体系提供新的研究思路㊂㊃83㊃㊀邓莉梅,等:甾醇分子差异对脂质体结构稳定性的影响参考文献:[1]㊀AKHAVAN S,ASSADPOUR E,KATOUZIAN I,et al.Lipid nano scale cargos for 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