下载文档原格式
Mettl3条件敲除
Mettl3条件敲除是一种在特定条件下敲除或沉默Mettl3基因的技术，这种技术可以用来研究Mettl3基因在生物体内的生物学功能。
在研究中，通常使用基因敲除技术，如CRISPR-Cas9系统，来靶向特定的基因并导致其降解或失活。
通过在特定组织或发育阶段敲除Mettl3基因，可以研究其在发育、生理和疾病中的作用。
例如，在小鼠模型中，研究人员可以利用Mettl3条件敲除技术来研究Mettl3基因在生殖细胞（Vasa-Cre）或中枢神经系统（特异性敲除）中的生物学功能。
结果表明，Mettl3敲除会抑制小鼠精原干细胞分化和减数分裂起始过程，导致雄性小鼠不育；在中枢神经系统中特异地敲除Mettl3会导致小鼠表现出严重的运动功能障碍，并导致死亡。
此外，利用Mettl3条件敲除和敲除小鼠模型还建立了体内ESCC肿瘤模型，以研究Mettl3在ESCC进展中的作用。
结果表明，Mettl3基因敲除导致进展缓慢，肿瘤症状减轻，可见病变面积减少。
总之，Mettl3条件敲除是一种有效的技术，可以用来研究Mettl3基因在生物体内的生物学功能。
相关研究不仅有助于了解发育、生理和疾病过程中的基因调控机制，还可为疾病治疗和药物研发提供重要的理论基础和实验依据。
HEILONGJIANGMEDICINEANDPHARMACYDec.2017,Vol.40 No.6A L K2基因敲除小鼠的饲养繁育与基因型鉴定①高旭广1张雪2,刘麒麟2,郑嵘1孙宏晨2,吴立鹏1(1.佳木斯大学口腔医学院正畸科，黑龙江佳木斯154402;.吉林大学口腔医学院病理科，吉林长春130000)摘要：目的：为了繁育和鉴定体内ALK2基因被敲除的小鼠，特将从美国引进的A LK2基因敲除小鼠进行饲养繁育，继续 保种；以及初步探究激活素受体样激酶2(Alk2)功能缺陷对出生后小鼠在生存能力、繁殖能力、主要组织器官的生长状态等方面的影响。
方法：首先用C r e-l o p重组酶系统培育出ALK2条件基因敲除小鼠，通过基因型鉴定筛选出实验组（基因型：Osx- C re;A lk2f V f x)和对照组（基因型：Osx - C re;Alk2f V + )。
结果：成功饲养和繁殖出从美国引进的小鼠，并成功从中筛选出ALK2基因敲除小鼠。
结论：采用正确的饲养、繁殖及基因鉴定方法对筛选出基因敲除小鼠及继续保种意义重大；初步探究小鼠ALK2基因敲除后小鼠的变化为进一步深入研究小鼠的组织器官的生长发育方面的变化及机理奠定了基础。
关键词：A LK2;条件基因敲除；P C R;繁殖中图分类号：Q344. +10 文献标识码:A文章编号=1008 -0104(2017)06 -0000 -00在过去几十年里，学者们利用c e/l o p系统对ALIK在小鼠体内的表达做了具体研究，这使人们越来 越了解A L IK的功能，构建出条件基因敲除的小鼠模 型。
ALIK作为BMPS的膜蛋白受体，具有以下特点:(1)广泛表达于机体各个部位及机体发育的各个时期。
（2)具有功能特异性，ALIK在不同组织的作用也 不同，甚至在同种细胞的不同阶段也发挥着不同的作 用，可以和多种BMP结合，不同的结合方式发挥着不 同作用。
因此，采用正确的方法对引进的小鼠进行饲 养、繁育及筛选出ALK2基因敲除小鼠，对进一步深入研究ALK2基因被敲除对小鼠的生长发育变化的影响 及其变化机理是非常重要的[1’2]。
条件性基因敲除的基本原理Cre／loxP重组系统条件性基因敲除主要是通过Cre／10xP或者Ftp／FRT重组系统来实现的。
这两个系统都是位点特异性重组酶系统，已发展成为在体内、外进行遗传操作的有力工具。
这两个系统的应用，可以使靶基因的表达或缺失发生在试验动物发育的某一阶段或某一特定的组织器官。
此外，若与控制Cre或Flp表达的其他诱导系统相结合，还可以对某一基因同时实现时空两方面的调控。
1．Cre／loxP系统的原理Cre／loxP系统来源于F1噬菌体，可以介导位点特异的DNA重组。
该系统含有两种成分：①一段长34bp的DNA序列，含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。
这段34bp序列是重组酶识别的位点，被称为loxP位点(10cus of X—over in P1)。
②Cre重组酶(cyclizationrecombination)，它是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白，可以引发loxP位点的DNA重组。
任何序列的DNA，当其位于两个loxP位点之间的时候，在Cre重组酶的作用下要么被缺失(两个loxP 位点的方向相同)，要么方向发生倒转(两loxP位点的方向相反)，如图所示。
Cre／loxP系统的作用机制2．Cre／loxP系统优点Cre／10xP系统之所以在基因敲除中获得了非常广泛的应用，是由该系统的诸多优点决定的：①Cre重组酶与具有loxP位点的DNA片断形成复合物后，可以提供足够的能量引发之后的DNA重组过程，因此该系统不需要细胞或者生物体提供其他的辅助因子；②loxP位点是一段较短的DNA序列，因此非常容易合成；③Cre重组酶是一种比较稳定的蛋白质，因此可以在生物体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用；④Cre重组酶的编码基因可以置于任何一种启动子的调控之下，从而使这种重组酶在生物体不同的细胞、组织、器官，以及不同的发育阶段或不同的生理条件下产生，进而发挥作用，这一点也是该系统在应用过程中最为重要的一点。
38基于CRISPR/Cas9技术的TRPS1基因敲除小鼠模型的构建李腾雁，刘文杰，赵宏，蔡建强*（国家癌症中心/ 国家肿瘤临床医学研究中心/ 中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院肝胆外科，北京 100021）李腾雁 博士研究生中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院肝胆外科目的:基于CRISPR/Cas9技术构建敲除TRPS1基因的杂合子小鼠，并进行鉴定。
方法: C57BL/6N小鼠自行交配后，使用Cas9/sgRNA注射受精卵的方法构建基因敲除小鼠，对可遗传的小鼠基因型进行鼠尾检测，TRPS1杂合子敲除小鼠分别与野生型小鼠交配，获得具有稳定基因型的小鼠。
结果:本实验通过使用Cas9/sgRNA注射受精卵的方法，所有繁殖小鼠经鼠尾基因型鉴定，证实成功构建了18只TRPS1基因敲除的杂合子小鼠。
结论:基于CRISPR/Cas9技术成功构建了敲除TRPS1基因的杂合子小鼠。
关键词：CRISPR/Cas9；TRPS1；结直肠癌；基因敲除小鼠摘要基金支持：国家自然科学基金(81672461) ；国家自然科学基金(81972311) ；深圳市“医疗卫生三名工程”（SZSM202011010）首都卫生发展科研专项项目(2018-1-4021)；中国医学科学院医学与健康科技创新工程(2016-I2M-1-001,2017-12M-4-002) *通信作者：蔡建强************************Generation of TRPS1 knockout mice by CRISPR/Cas9-mediated gene targetingAbstractObjectives: This study aimed to construct and identify heterozygous mice knocked out of TRPS1 gene based on CRISPR/ Cas9 technology.Methods: After self-mating of C57BL/6N mice, TRPS1 knockout mice were constructed by injecting fertilized eggs with Cas9/sgRNA, and the mouse genotypes of heritable mice were detected by tail. TRPS1 heterozygous knockout mice were mated with wild-type mice to obtain mice with stable genotypes.Results: In this experiment, the fertilized eggs were injected with cas9 / sgRNA, all breeding mice were identified by tail genotype, 18 TRPS1 knockout heterozygous mice were successfully constructed.Conclusion: In this study, we successfully constructed TRPS1 knockout heterozygous mice based on CRISPR / cas9 technology, which provided a research platform for further research on the role of TRPS1 in the occurrence, development and possible liver metastasis of colorectal cancer at the animal level.Keywords: CRISPR/Cas9; TRPS1; Colorectal cancer; Gene knockout mouseLi Tengyan, Liu Wenjie, Zhao Hong, Cai Jianqiang*(National Department of Hepatobiliary Surgery, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/ Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100021, China)我国结直肠癌（colorectal cancer，CRC）的发病率和死亡率均保持上升趋势。
巨噬细胞条件性Atg5基因敲除小鼠的构建及鉴定黄小荣; 黄衍恒; 叶霖; 杨陈; 汤济鑫; 安宁; 刘建兴; 刘华锋【期刊名称】《《中国实验动物学报》》【年(卷),期】2019(027)006【总页数】6页(P770-775)【关键词】巨噬细胞; Atg5基因; 基因敲除; 自噬; 基因型鉴定【作者】黄小荣; 黄衍恒; 叶霖; 杨陈; 汤济鑫; 安宁; 刘建兴; 刘华锋【作者单位】广东医科大学附属医院肾病研究所湛江市慢性肾脏病防控重点实验室湛江 524001【正文语种】中文【中图分类】Q95-33巨噬细胞属于单核吞噬细胞家族成员，既在固有免疫中起重要作用，也可通过招募其他免疫细胞如淋巴细胞产生适应性免疫反应，进而在机体免疫反应、组织损伤和修复中起关键作用[1]。
根据表型和功能不同，巨噬细胞可分为不同的亚类，一般可分为经典活化型M1促炎巨噬细胞(M1)和替代活化型M2抗炎巨噬细胞(M2)。
M1可大量分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-23、活性氧簇(ROS)等促炎细胞因子；而M2则可分泌IL-4、IL-13、IL-10、TGF-β1等炎症抑制因子，及成纤维细胞生长因子及血小板衍生因子等促纤维化因子[2-3]。
几乎所有类型的急性肾损伤和进行性慢性肾脏病都可在肾小球及肾间质中检测到巨噬细胞浸润[4]，且根据肾脏微环境变化，巨噬细胞可在促炎表型和抗炎促纤维化表型之间进行转化[5]，从而在肾小管-间质损伤、修复和纤维化各阶段中发挥着不同作用[4, 6-8]，显著影响肾小管-间质损伤的最终转归。
近年来，自噬通路在肾小管-间质损伤进程中的作用越来越受关注；而目前对自噬的研究主要集中在TECs上[9-10]，免疫细胞自噬在肾脏疾病的作用研究尚涉及甚少。
现研究认为，自噬可影响免疫细胞的增殖、凋亡、迁徙、分化、活化以及炎症因子分泌[11]。
有研究表明在眼色素层炎[12]、高脂饮食诱导肥胖小鼠[13]、半乳糖胺联合LPS诱导的急性肝损伤[14]等诸多炎症模型中，特异性阻断巨噬细胞自噬通路，可引起巨噬细胞炎症体降解受阻而分泌大量炎症因子IL-1阻和IL-18，加剧疾病相关器官的炎症反应及损伤严重程度[12]。
基因敲除小鼠的PCR鉴定一、实验目的：通过PCR扩增程序及琼脂糖凝胶电泳方法鉴定凝血因子IX基因敲除小鼠的基因型。
二、实验原理：真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因DNA。
真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。
提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。
1.PCR原理：PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：1) 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；2) 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3) 引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍2.琼脂糖凝胶电泳原理：在pH8.0~8.3的缓冲液中，核酸分子带负电荷，向正极移动。
由于不同大小和构象的核酸分子电荷密度大致相同，因此在自由泳动时，各种核酸分子的迁移率相似，无法分开。
然而，在浓度适当的凝胶中，由于分子筛效应，使大小和构象不同的核酸迁移率出现差异，从而把它们分开。
核酸在凝胶中的迁移率取决于其分子大小、高级结构、胶浓度和电场强度，与分子的碱基组成及电泳温度（4~30℃之间）无明显关系。
C56BL/6N与129S6/SvEvTac差异C56BL/6N及129S6/SvEvTac。
他们的区别在于： 129来源的ES培养相对容易，有较强的GLT潜力，即容易得到可遗传的F1代flox杂合子。
但是，129品系的亚系非常多，遗传背景差异大，因此表型差异也比较大，有研究证明129品系不适合做神经学、免疫学等方面的研究。
因此，用129背景做出来的敲除模型一般都需要回交到C57BL/6等清晰的近交系背景，这需要5-10代，也就是2年左右的时间。
C57BL/6是应用最为广泛的近交系，遗传背景也很清晰，因此，在实验中的反应和表型更一致，得到的结果重复性也会更好。
但是，相对于129品系，C57BL/6来源的ES培养要求更高，而且GLT的能力较弱，比129背景更难得到可遗传的F1代杂合子。
C57BL/6来源的敲除模型直接与C57BL/6回交就是纯的近交系，不需要像129那样回交5-10代，因此，会节省时间。
C56BL/6J与B6CBF1差异C56BL/6J及B6CBF1。
他们的区别在于：B6CBF1是杂合背景，有杂交优势，生殖能力比较好；B6是纯背景的近交系，繁育能力要弱一些，对于我们来说B6背景在制作转基因小鼠上技术难度会大一些，所以费用也相对贵一些。
我们认为杂合背景可能对某些基因的表达会有一定影响，而纯背景对基因表达的反应程度比较均一，也就是说不同背景对某些基因的表达的反应程度应该是不一样的，后期出现的表型可能也有区别。
B6背景是目前国际上运用的最广泛的小鼠，遗传背景非常清楚，公共数据库中的小鼠基因组全序列也是用 C57BL/6基因组为模板测出来的，您可以根据您的实验来选择品系背景。
常规敲除（Traditional KO或Conventional KO）常规敲除（Traditional KO或Conventional KO）是通过同源重组技术，将基因组上的目的片段替换成一个Antibiotic SelectionMarker，如PGK-Neomycin等。
基因敲除小鼠的实验流程1.设计基因敲除小鼠实验方案在开始实验之前，需要明确研究目的，确定需要敲除的基因，并设计相应的实验方案。
一般可以使用 CRISPR-Cas9 系统来实现基因敲除，在设计基因敲除实验方案时，需要选择合适的 sgRNA 序列，以及设计恰当的引物用于检测突变。
2.获得基因敲除小鼠的胚胎干细胞为了实现基因敲除，需要获得基因敲除小鼠的胚胎干细胞。
一种常用的方法是利用胚胎干细胞对外源DNA的高度易感性，将敲除基因的质粒DNA转染到小鼠胚胎干细胞中。
3.筛选敲除基因的胚胎干细胞株系将转染了敲除基因的胚胎干细胞以悬浮培养的方式进行培养，培养一段时间后，利用一定的筛选条件来筛选出含有敲除基因的胚胎干细胞株系。
筛选条件可包括对抗生素的使用或筛选标记基因的表达。
4.制备敲除基因小鼠的固定胚胎干细胞系通过体外培养，将敲除基因的胚胎干细胞系定植在培养皿上，培养数代以后，将其冻存，以备后续的实验使用。
5.实施敲除基因小鼠的胚胎干细胞基因改造将固定的胚胎干细胞系重新激活，转染 Cas9 和 sgRNA，利用CRISPR-Cas9 系统使这些细胞具有敲除基因的突变。
6.识别敲除基因的胚胎干细胞阳性克隆株对转染了 Cas9 和 sgRNA 的胚胎干细胞进行筛选，通过 PCR、Western blot、Southern blot等技术方法识别出敲除了目标基因的阳性克隆株。
7.将敲除基因的胚胎干细胞注入小鼠的早期胚胎取出已受精的小鼠卵母细胞，利用显微操作将敲除基因的胚胎干细胞注入到小鼠的早期胚胎中。
利用体外受精或者通过体内或体外的胚胎移植方式将基因敲除干细胞注入受体小鼠。
8.制备基因敲除小鼠的嵌合小鼠将已注入敲除基因的胚胎干细胞的受体小鼠进行嵌合以产生基因敲除小鼠。
嵌合可以通过体内或体外的胚胎移植方式进行。
9.筛选识别基因敲除小鼠对产生的嵌合小鼠进行筛选，确认敲除基因是否成功。
可以通过 PCR、Western blot、Southern blot等技术方法对小鼠体细胞或组织进行分析。
条件性敲除小鼠定义：条件性基因敲除小鼠（也叫Flox小鼠）是指在目的基因中含有成对的loxp位点的小鼠，与Cre工具小鼠交配后可在特定的组织或细胞中敲除目的基因。
CKO如何实现？重组酶系统（如：Cre-loxP）介导的位点特异性重组技术。
Cre是重组酶（38kDa），可识别34bp 长的DNA 序列loxP。
loxP 两侧各13bp 构成回文结构，中间8bp为非回文结构，因此loxp具有方向性。
（当DNA 分子上存在两个同向loxP 序列时，Cre可将两个loxP 序列之间的DNA 片段切出并环化，同时将loxP 两侧的序列进行连接；当DNA 分子上存在两个方向相反的loxP 序列时，Cre 可导致loxP 之间的序列发生反转。
）CKO敲除的是什么？条件性基因敲除的靶基因中必须带有可以被Cre 重组酶识别的loxP 序列，这种基因称为floxed gene。
带有floxed 靶基因的小鼠称为flox 小鼠。
在这种小鼠中，通常采用DNA 同源重组方法，在拟敲除基因片段的两侧分别放置一个同向的loxP 位点。
loxP 位点的存在应不影响该基因的功能，故选择对照为flox/flox小鼠CKO敲除何时何地发生？除了flox 小鼠以外，重组酶系统介导的条件性基因敲除还需要另一类重要的基因工程小鼠的参与——Cre 工具鼠。
Cre 工具鼠中，将Cre 重组酶的编码序列置于特定的基因启动子下，Cre 的表达特性决定了靶基因何时何地发生敲除。
Cre 在哪一种组织细胞中表达，靶基因的敲除就发生在哪种组织细胞；Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率；使用诱导型Cre 重组酶可以通过给予诱导剂，决定在特定的发育时期或疾病发生阶段，定时地进行基因敲除。
（范衡宇老师课件）实验时，将flox 小鼠和Cre 工具鼠进行交配，最后获得flox 纯合且Cre 杂合的小鼠。
在这类小鼠中，凡是表达Cre 的细胞，两个loxP 之间的序列被切除，从而实现组织特异性基因敲除。
（参考资料：南方模式生物官网）交配策略将获得的flox杂合子小鼠（geneflox/+）分成两部分：1. flox/+小鼠与Cre小鼠交配，同时获得flox阳性且Cre阳性小鼠（该小鼠简写为：geneflox/+；Cre+），flox阳性且Cre阴性小鼠（geneflox/+）；2. flox小鼠自交，获得flox纯合（该小鼠简写为：geneflox/flox）和flox杂合小鼠（geneflox/+）。
为获得flox纯合且Cre阳性的小鼠，可有两种繁育方法选择：1. 将获得的flox和Cre双阳性杂合子小鼠（geneflox/+：Cre+）与flox杂合子小鼠（geneflox/+）交配，最终获得flox纯合且Cre阳性的实验组小鼠（该小鼠简写为：geneflox/flox；Cre+，该小鼠所占后代比例为：1/8）和flox纯合且Cre阴性的对照组小鼠（geneflox/flox，该小鼠所占后代比例为：1/8）；2. 将获得的flox和Cre双阳性杂合子小鼠（geneflox/+：Cre+）与flox纯合子小鼠（geneflox/flox）交配，最终获得flox纯合且Cre阳性的实验组小鼠（geneflox/flox；Cre+，该小鼠所占后代比例为：1/4）和flox纯合且Cre阴性的对照组小鼠（geneflox/flox，该小鼠所占后代比例为：1/4）。
后续实验（实验组：geneflox/flox；Cre+，对照组：实验组：geneflox/flox）为快速获得上述所需小鼠，可将geneflox/flox；Cre+小鼠与geneflox/flox小鼠杂交小鼠基因型鉴定小鼠编号原则Flox小鼠基因型鉴定（用于鉴定flox纯合、杂合和野生型）PCR鉴定引物位置示意图（可选择P1,P2引物对，或P3,P4，P1,P4引物对）目的基因组织特异性敲除效果验证（1）DNA水平cre活性验证通常是取一小块表达Cre的组织，抽提基因组DNA，通过PCR的方法对flox区域进行扩增，通过flox区域的有无，定性判断Cre是否发挥作用。
（2）RNA水平cre敲除效率验证通常是取一小块表达Cre的组织，抽提RNA，反转录成cDNA后，通过Realtime-PCR的方法，利用Cre作用后的mRNA ，所设计的引物无法扩增出PCR产物的原理，定量判断Cre作用效率。
（3）蛋白水平cre敲除效率验证目的组织western blot或免疫组化检测。
原理：表达cre的组织无法检测到目的蛋白。
动物组织DNA抽提1) 250ul 裂解液+2.5ul proteinase K(10mg/ml) 直接消化组织，放于55℃恒温热浴过夜2) 加入同体积（250ul）苯酚：氯仿：异戊醇混合物（使用前摇晃瓶身混匀），上下剧烈震荡15s，12000rpm,15min常温离心3) 转移上清于新的EP管（期间可能会吸起白色絮状物，无妨）4) 加入等体积的异丙醇，上下剧烈震荡15s,12000rpm,15min常温离心5) 倒掉上清（也可用真空泵吸，小心底部沉淀），用75%乙醇（400ul），7500rpm, 5min（可多清洗2遍）6) 将管壁内部及管盖上的残留乙醇吸干，沉淀相对较干，根据不同体积加入ddH2O注：因没加RNA酶，可能会残余RNA，A260/280会居于1.9以上，但PCR无妨lysis buffer配制（裂解液）：先加水500ml，再加各种成分，最后定容到1L成分配置（1L）1M Tris 8.0-100x 10mL5M Tris 8.0-50x 20mL0.5M EDTA-20x 50mL10% SDS 50mL小鼠饲养及繁殖期间遇到的问题Q：小鼠合笼后，很久都不怀孕？A：考虑换雌鼠或雄鼠，重新交配Q：小鼠合笼后，雄鼠和雌鼠比例及年龄选择？A：雄：雌一般1：2或1：3，不要太多雌鼠。
雄鼠至少8w，9-10w更为合适；而雌鼠一般选择6w及以上。
Q：什么时候分笼？A：大小鼠的哺乳期是20-22d，3周龄可离乳独立生活，因此出生3周后即可将幼鼠与母鼠分开，独立生活。
视小鼠生长情况，可多哺乳几天。
有时为避免笼盒中同时存在两胎幼鼠，导致新生的幼鼠被上一胎幼鼠踩踏致死的情况，在19d左右即可将其分笼。
分笼时需要标记新生小鼠，选择减脚趾，或打耳钉（耳钉一定要订的足够好，否则后续会被小鼠抓掉）雌鼠4周龄阴腔开张，雄鼠5周龄睾丸降落至阴囊，开始形成精子。
因此，4周龄前一定要进行分笼，以免发生交配Q：母鼠吃仔怎么办？A：1. 雌鼠与雄鼠合笼交配后，雄鼠可以一直与孕鼠一起生活，这样有利于孕鼠整个妊娠过程的稳定以及仔鼠的出生与哺乳。
2. 怀孕的雌鼠（一般两只）一起生活，或将怀孕及未怀孕的雌鼠在一起。
然而，绝对不要在雌鼠分娩前几天再在笼舍中加入新的雌鼠，这样会打扰到孕鼠以及新生仔鼠；要等仔鼠断奶（21天）后才能再将雄鼠放入繁殖笼内。
3. 第一胎分娩或太过于年轻的新手母鼠育成仔鼠的成功率比有经验或较为年长的雌鼠要低。
仔鼠出生第一天尽量不要打扰母鼠与幼仔，到第二天母鼠就比较能容忍被打扰的状况了。
4. 若一直持续吃鼠，选择换孕鼠。
Q：如何准确知道小鼠怀孕天数？A：傍晚5-6点将雌鼠雄鼠合笼，第二天早晨8点检查雌鼠是否有阴道栓（下图所示）。
有阴道栓的当天中午算为胚胎第0.5天。
检栓后，未见到栓的雌雄鼠分开，至下午再进行合笼。
不过，观察到阴道栓只能说明发生了交配行为，并不能完全作为怀孕的标志，见到栓以后仍可能发生未怀孕的情况。
小鼠表型观测参考点：体型差异、毛发、体重、活动能力，最关键还是要结合敲除或敲入基因的具体功能常见的肝癌模型1. 诱发性肝癌模型：DEN, DEN+CCl4，HFD+CD+CCl42. 移植性肝癌模型：异位移植即皮下成瘤，原位移植（肝脏，经脾脏）3. 基因敲除鼠（如HBV-TG, PTEN, APC, miR-122肝特异性敲除, Myc肝特异性过表达）4. 高压尾静脉HTVI诱发性肝癌模型20mg/kg DEN C57BL-male 12day 8month-8.5month20mg/kg DEN C57BL-female 12day 9month-10monthDENDEN+CCl420mg/kg DEN, injected at day 12 of C57BL mice.1ul/g of 20% of CCL4 (diluted by Olive), start from week 4 of mice, once a week, for 14-18 weeks (Male-16week, female-17week)移植性肝癌模型皮下成瘤subcutaneous tumor formation注意点（1）肿瘤细胞系选择（2）小鼠品系选择：Nude, NOD/SCID, NSG（3）接种部位：腋下、腹股沟、侧腹部及颈背部（血管丰富且易操作部位）操作步骤（1）肿瘤细胞的传代扩增确保肿瘤细胞的活力和良好的生长状态（病毒感染可选择再传代扩增；若siRNA或质粒转染处理细胞不建议传代扩增，质粒转染24小时，保证最大效率。
siRNA取决于平时做实验的经验。
）（2）计算细胞接种量结合文献来确定细胞接种量，在找不到相关资料的情况下，最高就用到1000万/0.1ml，不可再高（因为细胞悬液已达饱和状态）。
并且提前计算确定细胞数量，一般注射40只小鼠，至少需要准备50只小鼠的细胞量。
（3）准备裸鼠一般选择5-6W裸鼠，小于4W动物可能不耐受而过早死亡，大于6W免疫力会增强，不易成瘤；雌雄均可（4）操作步骤①预准备：matrigel 4℃过夜融化，若1人操作可选择使用呼吸麻醉仪，去鼠房前可考虑打一盒冰和带上移液器和枪头，用注射器不好重悬细胞②接种时选择好部位进针，建议接种前酒精棉球擦拭消毒进针位置（实验室选择以后腿股）；③向前方穿行，注射前针头稍微动一动，能动说明在皮下，否则可能在皮内或者肌肉内；④针头在皮下走一段再注射，速度不可太快，一般体积为100-200μL（PBS或者无血清培养基稀释细胞，若不易成瘤可添加matrigel促进成瘤），可看见明显的鼓包；⑤接种点离进针点尽量较远，减少漏液和污染的可能；⑥注射完毕后，缓慢旋转退出针头（Z字型扭），尽量避免漏液；⑦细胞需一直置于冰上，使细胞处于比较低的代谢状态，一般2h之内不会有问题。
（5）后续实验安排①分组：一般来说皮下荷瘤主要用于抗肿瘤药物的检测，因此我们一般分为对照组，阳性药物组，低剂量、中剂量及高剂量药物组等；②数量：荷瘤时每组不少于10只，考虑到小鼠成瘤率和死亡原因，最终实验应至少可以获取6个有效数据；③给药时间：一般接种7-10天后便可看到肿瘤长起，便可分组实验（鼠源细胞系会更快）；④人道终点：动物伦理学规定，小鼠肿瘤重量不可超过小鼠体重10%，平均肿瘤直径不超过20mm，并且如果出现溃烂，造成感染或坏死时，应该中止实验且对动物施行安乐死。
