条件性敲除小鼠

Mettl3条件敲除
Mettl3条件敲除是一种在特定条件下敲除或沉默Mettl3基因的技术，这种技术可以用来研究Mettl3基因在生物体内的生物学功能。

在研究中，通常使用基因敲除技术，如CRISPR-Cas9系统，来靶向特定的基因并导致其降解或失活。

通过在特定组织或发育阶段敲除Mettl3基因，可以研究其在发育、生理和疾病中的作用。

例如，在小鼠模型中，研究人员可以利用Mettl3条件敲除技术来研究Mettl3基因在生殖细胞（Vasa-Cre）或中枢神经系统（特异性敲除）中的生物学功能。

结果表明，Mettl3敲除会抑制小鼠精原干细胞分化和减数分裂起始过程，导致雄性小鼠不育；在中枢神经系统中特异地敲除Mettl3会导致小鼠表现出严重的运动功能障碍，并导致死亡。

此外，利用Mettl3条件敲除和敲除小鼠模型还建立了体内ESCC肿瘤模型，以研究Mettl3在ESCC进展中的作用。

结果表明，Mettl3基因敲除导致进展缓慢，肿瘤症状减轻，可见病变面积减少。

总之，Mettl3条件敲除是一种有效的技术，可以用来研究Mettl3基因在生物体内的生物学功能。

相关研究不仅有助于了解发育、生理和疾病过程中的基因调控机制，还可为疾病治疗和药物研发提供重要的理论基础和实验依据。

HEILONGJIANGMEDICINEANDPHARMACYDec.2017,Vol.40 No.6A L K2基因敲除小鼠的饲养繁育与基因型鉴定①高旭广1张雪2,刘麒麟2,郑嵘1孙宏晨2,吴立鹏1(1.佳木斯大学口腔医学院正畸科，黑龙江佳木斯154402;.吉林大学口腔医学院病理科，吉林长春130000)摘要：目的：为了繁育和鉴定体内ALK2基因被敲除的小鼠，特将从美国引进的A LK2基因敲除小鼠进行饲养繁育，继续 保种；以及初步探究激活素受体样激酶2(Alk2)功能缺陷对出生后小鼠在生存能力、繁殖能力、主要组织器官的生长状态等方面的影响。

方法：首先用C r e-l o p重组酶系统培育出ALK2条件基因敲除小鼠，通过基因型鉴定筛选出实验组（基因型：Osx- C re;A lk2f V f x)和对照组（基因型：Osx - C re;Alk2f V + )。

结果：成功饲养和繁殖出从美国引进的小鼠，并成功从中筛选出ALK2基因敲除小鼠。

结论：采用正确的饲养、繁殖及基因鉴定方法对筛选出基因敲除小鼠及继续保种意义重大；初步探究小鼠ALK2基因敲除后小鼠的变化为进一步深入研究小鼠的组织器官的生长发育方面的变化及机理奠定了基础。

关键词：A LK2;条件基因敲除；P C R;繁殖中图分类号：Q344. +10 文献标识码:A文章编号=1008 -0104(2017)06 -0000 -00在过去几十年里，学者们利用c e/l o p系统对ALIK在小鼠体内的表达做了具体研究，这使人们越来 越了解A L IK的功能，构建出条件基因敲除的小鼠模 型。

ALIK作为BMPS的膜蛋白受体，具有以下特点:(1)广泛表达于机体各个部位及机体发育的各个时期。

（2)具有功能特异性，ALIK在不同组织的作用也 不同，甚至在同种细胞的不同阶段也发挥着不同的作 用，可以和多种BMP结合，不同的结合方式发挥着不 同作用。

因此，采用正确的方法对引进的小鼠进行饲 养、繁育及筛选出ALK2基因敲除小鼠，对进一步深入研究ALK2基因被敲除对小鼠的生长发育变化的影响 及其变化机理是非常重要的[1’2]。

条件性基因敲除的基本原理Cre／loxP重组系统条件性基因敲除主要是通过Cre／10xP或者Ftp／FRT重组系统来实现的。

这两个系统都是位点特异性重组酶系统，已发展成为在体内、外进行遗传操作的有力工具。

这两个系统的应用，可以使靶基因的表达或缺失发生在试验动物发育的某一阶段或某一特定的组织器官。

此外，若与控制Cre或Flp表达的其他诱导系统相结合，还可以对某一基因同时实现时空两方面的调控。

1．Cre／loxP系统的原理Cre／loxP系统来源于F1噬菌体，可以介导位点特异的DNA重组。

该系统含有两种成分：①一段长34bp的DNA序列，含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。

这段34bp序列是重组酶识别的位点，被称为loxP位点(10cus of X—over in P1)。

②Cre重组酶(cyclizationrecombination)，它是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白，可以引发loxP位点的DNA重组。

任何序列的DNA，当其位于两个loxP位点之间的时候，在Cre重组酶的作用下要么被缺失(两个loxP 位点的方向相同)，要么方向发生倒转(两loxP位点的方向相反)，如图所示。

Cre／loxP系统的作用机制2．Cre／loxP系统优点Cre／10xP系统之所以在基因敲除中获得了非常广泛的应用，是由该系统的诸多优点决定的：①Cre重组酶与具有loxP位点的DNA片断形成复合物后，可以提供足够的能量引发之后的DNA重组过程，因此该系统不需要细胞或者生物体提供其他的辅助因子；②loxP位点是一段较短的DNA序列，因此非常容易合成；③Cre重组酶是一种比较稳定的蛋白质，因此可以在生物体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用；④Cre重组酶的编码基因可以置于任何一种启动子的调控之下，从而使这种重组酶在生物体不同的细胞、组织、器官，以及不同的发育阶段或不同的生理条件下产生，进而发挥作用，这一点也是该系统在应用过程中最为重要的一点。

38基于CRISPR/Cas9技术的TRPS1基因敲除小鼠模型的构建李腾雁，刘文杰，赵宏，蔡建强*（国家癌症中心/ 国家肿瘤临床医学研究中心/ 中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院肝胆外科，北京 100021）李腾雁 博士研究生中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院肝胆外科目的:基于CRISPR/Cas9技术构建敲除TRPS1基因的杂合子小鼠，并进行鉴定。

方法: C57BL/6N小鼠自行交配后，使用Cas9/sgRNA注射受精卵的方法构建基因敲除小鼠，对可遗传的小鼠基因型进行鼠尾检测，TRPS1杂合子敲除小鼠分别与野生型小鼠交配，获得具有稳定基因型的小鼠。

结果:本实验通过使用Cas9/sgRNA注射受精卵的方法，所有繁殖小鼠经鼠尾基因型鉴定，证实成功构建了18只TRPS1基因敲除的杂合子小鼠。

结论:基于CRISPR/Cas9技术成功构建了敲除TRPS1基因的杂合子小鼠。

关键词：CRISPR/Cas9；TRPS1；结直肠癌；基因敲除小鼠摘要基金支持：国家自然科学基金(81672461) ；国家自然科学基金(81972311) ；深圳市“医疗卫生三名工程”（SZSM202011010）首都卫生发展科研专项项目(2018-1-4021)；中国医学科学院医学与健康科技创新工程(2016-I2M-1-001,2017-12M-4-002) *通信作者：蔡建强************************Generation of TRPS1 knockout mice by CRISPR/Cas9-mediated gene targetingAbstractObjectives: This study aimed to construct and identify heterozygous mice knocked out of TRPS1 gene based on CRISPR/ Cas9 technology.Methods: After self-mating of C57BL/6N mice, TRPS1 knockout mice were constructed by injecting fertilized eggs with Cas9/sgRNA, and the mouse genotypes of heritable mice were detected by tail. TRPS1 heterozygous knockout mice were mated with wild-type mice to obtain mice with stable genotypes.Results: In this experiment, the fertilized eggs were injected with cas9 / sgRNA, all breeding mice were identified by tail genotype, 18 TRPS1 knockout heterozygous mice were successfully constructed.Conclusion: In this study, we successfully constructed TRPS1 knockout heterozygous mice based on CRISPR / cas9 technology, which provided a research platform for further research on the role of TRPS1 in the occurrence, development and possible liver metastasis of colorectal cancer at the animal level.Keywords: CRISPR/Cas9; TRPS1; Colorectal cancer; Gene knockout mouseLi Tengyan, Liu Wenjie, Zhao Hong, Cai Jianqiang*(National Department of Hepatobiliary Surgery, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/ Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100021, China)我国结直肠癌（colorectal cancer，CRC）的发病率和死亡率均保持上升趋势。

巨噬细胞条件性Atg5基因敲除小鼠的构建及鉴定黄小荣; 黄衍恒; 叶霖; 杨陈; 汤济鑫; 安宁; 刘建兴; 刘华锋【期刊名称】《《中国实验动物学报》》【年(卷),期】2019(027)006【总页数】6页(P770-775)【关键词】巨噬细胞; Atg5基因; 基因敲除; 自噬; 基因型鉴定【作者】黄小荣; 黄衍恒; 叶霖; 杨陈; 汤济鑫; 安宁; 刘建兴; 刘华锋【作者单位】广东医科大学附属医院肾病研究所湛江市慢性肾脏病防控重点实验室湛江 524001【正文语种】中文【中图分类】Q95-33巨噬细胞属于单核吞噬细胞家族成员，既在固有免疫中起重要作用，也可通过招募其他免疫细胞如淋巴细胞产生适应性免疫反应，进而在机体免疫反应、组织损伤和修复中起关键作用[1]。

根据表型和功能不同，巨噬细胞可分为不同的亚类，一般可分为经典活化型M1促炎巨噬细胞(M1)和替代活化型M2抗炎巨噬细胞(M2)。

M1可大量分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-23、活性氧簇(ROS)等促炎细胞因子；而M2则可分泌IL-4、IL-13、IL-10、TGF-β1等炎症抑制因子，及成纤维细胞生长因子及血小板衍生因子等促纤维化因子[2-3]。

几乎所有类型的急性肾损伤和进行性慢性肾脏病都可在肾小球及肾间质中检测到巨噬细胞浸润[4]，且根据肾脏微环境变化，巨噬细胞可在促炎表型和抗炎促纤维化表型之间进行转化[5]，从而在肾小管-间质损伤、修复和纤维化各阶段中发挥着不同作用[4, 6-8]，显著影响肾小管-间质损伤的最终转归。

近年来，自噬通路在肾小管-间质损伤进程中的作用越来越受关注；而目前对自噬的研究主要集中在TECs上[9-10]，免疫细胞自噬在肾脏疾病的作用研究尚涉及甚少。

现研究认为，自噬可影响免疫细胞的增殖、凋亡、迁徙、分化、活化以及炎症因子分泌[11]。

有研究表明在眼色素层炎[12]、高脂饮食诱导肥胖小鼠[13]、半乳糖胺联合LPS诱导的急性肝损伤[14]等诸多炎症模型中，特异性阻断巨噬细胞自噬通路，可引起巨噬细胞炎症体降解受阻而分泌大量炎症因子IL-1阻和IL-18，加剧疾病相关器官的炎症反应及损伤严重程度[12]。

基因敲除小鼠的PCR鉴定一、实验目的：通过PCR扩增程序及琼脂糖凝胶电泳方法鉴定凝血因子IX基因敲除小鼠的基因型。

二、实验原理：真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因DNA。

真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。

提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。

1.PCR原理：PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：1) 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；2) 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3) 引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍2.琼脂糖凝胶电泳原理：在pH8.0~8.3的缓冲液中，核酸分子带负电荷，向正极移动。

由于不同大小和构象的核酸分子电荷密度大致相同，因此在自由泳动时，各种核酸分子的迁移率相似，无法分开。

然而，在浓度适当的凝胶中，由于分子筛效应，使大小和构象不同的核酸迁移率出现差异，从而把它们分开。

核酸在凝胶中的迁移率取决于其分子大小、高级结构、胶浓度和电场强度，与分子的碱基组成及电泳温度（4~30℃之间）无明显关系。

C56BL/6N与129S6/SvEvTac差异C56BL/6N及129S6/SvEvTac。

他们的区别在于： 129来源的ES培养相对容易，有较强的GLT潜力，即容易得到可遗传的F1代flox杂合子。

但是，129品系的亚系非常多，遗传背景差异大，因此表型差异也比较大，有研究证明129品系不适合做神经学、免疫学等方面的研究。

因此，用129背景做出来的敲除模型一般都需要回交到C57BL/6等清晰的近交系背景，这需要5-10代，也就是2年左右的时间。

C57BL/6是应用最为广泛的近交系，遗传背景也很清晰，因此，在实验中的反应和表型更一致，得到的结果重复性也会更好。

但是，相对于129品系，C57BL/6来源的ES培养要求更高，而且GLT的能力较弱，比129背景更难得到可遗传的F1代杂合子。

C57BL/6来源的敲除模型直接与C57BL/6回交就是纯的近交系，不需要像129那样回交5-10代，因此，会节省时间。

C56BL/6J与B6CBF1差异C56BL/6J及B6CBF1。

他们的区别在于：B6CBF1是杂合背景，有杂交优势，生殖能力比较好；B6是纯背景的近交系，繁育能力要弱一些，对于我们来说B6背景在制作转基因小鼠上技术难度会大一些，所以费用也相对贵一些。

我们认为杂合背景可能对某些基因的表达会有一定影响，而纯背景对基因表达的反应程度比较均一，也就是说不同背景对某些基因的表达的反应程度应该是不一样的，后期出现的表型可能也有区别。

B6背景是目前国际上运用的最广泛的小鼠，遗传背景非常清楚，公共数据库中的小鼠基因组全序列也是用 C57BL/6基因组为模板测出来的，您可以根据您的实验来选择品系背景。

常规敲除（Traditional KO或Conventional KO）常规敲除（Traditional KO或Conventional KO）是通过同源重组技术，将基因组上的目的片段替换成一个Antibiotic SelectionMarker，如PGK-Neomycin等。

基因敲除小鼠的实验流程1.设计基因敲除小鼠实验方案在开始实验之前，需要明确研究目的，确定需要敲除的基因，并设计相应的实验方案。

一般可以使用 CRISPR-Cas9 系统来实现基因敲除，在设计基因敲除实验方案时，需要选择合适的 sgRNA 序列，以及设计恰当的引物用于检测突变。

2.获得基因敲除小鼠的胚胎干细胞为了实现基因敲除，需要获得基因敲除小鼠的胚胎干细胞。

一种常用的方法是利用胚胎干细胞对外源DNA的高度易感性，将敲除基因的质粒DNA转染到小鼠胚胎干细胞中。

3.筛选敲除基因的胚胎干细胞株系将转染了敲除基因的胚胎干细胞以悬浮培养的方式进行培养，培养一段时间后，利用一定的筛选条件来筛选出含有敲除基因的胚胎干细胞株系。

筛选条件可包括对抗生素的使用或筛选标记基因的表达。

4.制备敲除基因小鼠的固定胚胎干细胞系通过体外培养，将敲除基因的胚胎干细胞系定植在培养皿上，培养数代以后，将其冻存，以备后续的实验使用。

5.实施敲除基因小鼠的胚胎干细胞基因改造将固定的胚胎干细胞系重新激活，转染 Cas9 和 sgRNA，利用CRISPR-Cas9 系统使这些细胞具有敲除基因的突变。

6.识别敲除基因的胚胎干细胞阳性克隆株对转染了 Cas9 和 sgRNA 的胚胎干细胞进行筛选，通过 PCR、Western blot、Southern blot等技术方法识别出敲除了目标基因的阳性克隆株。

7.将敲除基因的胚胎干细胞注入小鼠的早期胚胎取出已受精的小鼠卵母细胞，利用显微操作将敲除基因的胚胎干细胞注入到小鼠的早期胚胎中。

利用体外受精或者通过体内或体外的胚胎移植方式将基因敲除干细胞注入受体小鼠。

8.制备基因敲除小鼠的嵌合小鼠将已注入敲除基因的胚胎干细胞的受体小鼠进行嵌合以产生基因敲除小鼠。

嵌合可以通过体内或体外的胚胎移植方式进行。

9.筛选识别基因敲除小鼠对产生的嵌合小鼠进行筛选，确认敲除基因是否成功。

可以通过 PCR、Western blot、Southern blot等技术方法对小鼠体细胞或组织进行分析。

cre重组酶转基因小鼠原理
CRE recombinase (CRE) 重组酶是一种生物学工具，用于在基因组中定向地编辑和改变基因序列。

它通过识别并损伤两个特定的DNA 目标序列（称为LoxP 序列）来实现这一目的。

CRE 重组酶转基因小鼠是通过将CRE 重组酶基因插入到小鼠基因组中来实现的。

这些小鼠称为CRE 转基因小鼠。

这些小鼠可以用来研究基因编辑和基因疾病，以及药物研发。

在CRE 重组酶转基因小鼠中，CRE 重组酶基因可以被插入到特定基因的启动子区域中，这样CRE 重组酶就能在特定组织或细胞中表达。

这种基因敲除或基因编辑的方法称为条件型基因敲除。

例如，在一种常见的CRE 重组酶转基因小鼠中，CRE 重组酶基因被插入到肝脏中的基因启动子区域中，这样只有在肝脏细胞中才能表达CRE 重组酶。

这种小鼠可以用来研究肝脏疾病的基因编辑疗法。

CRE 重组酶转基因小鼠还可以用来研究其他器官和组织的基因编辑疗法，如心脏、肺、肠、脑等。

这些小鼠也可以用来研究各种疾病的基因编辑疗法，如癌症、遗传性疾病等。

总之, CRE重组酶转基因小鼠是一种重要的生物学工具, 可以用来研究基因编辑和基因疾病，以及药物研发。

它能够在特定组织或细胞中实现基因敲除或基因编辑，进而探究基因对疾病的影响。

CRE重组酶转基因小鼠原理是通过将CRE重组酶基因插入到小鼠基因组中,这样就能在特定组织或细胞中表达CRE重组酶。

CRE重组酶能识别并损伤两个特定的DNA目标序列（称为LoxP序列），实现在基因组中定向地编辑和改变基因序列。

这样就能在特定组织或细胞中实现基因敲除或基因编辑，进而探究基因对疾病的影响。

第38卷第1期2021年2月实验动物科学L A B O R A T O R Y A N I M A L S C I E N C EVol.38 N o.1February 20214研究进展i遗传修饰小鼠模型基因型鉴定技术要点介绍#刘甦苏王辰飞岳秉飞李冠名范昌发(中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所.北京102696)摘要：近年来，随着生物医学研究及基因编辑技术的发展，出现了越来越多的动物模型。

由于制作方法的不同，其 基因型鉴定技术方法也不一样，导致基因型鉴定的工作存在混乱无序的现象。

本文根据遗传修饰小鼠模型制作方法进行分类，介绍了随机转基因小鼠、条件性基因敲人小鼠、基因敲除小鼠三类常见模型的基因型鉴定技术要点，规范遗传修饰小鼠模型基因型鉴定方法，保证动物实验材料的准确性，从而推动动物模型在基础和应用科技领域的应用与发展。

关键词：遗传修饰；小鼠模型；基因型鉴定；技术要点中图分类号：R-332文献标识码：A文章编号：1006-6179(2021)01-0074-05D O I：10. 3969/j. issn. 1006-6179. 2021.01. 015遗传修饰小鼠模型是基础和应用科学研究中不可或缺的工具，在研究人类疾病相关基因功能、疾病 表型、诊断及治疗等方面都起着重要作用111。

近年 来，动物模型制作成为研究热点，针对小鼠的基因修饰技术也在不断更新，出现了各种类型的遗传修饰小鼠模型，比较常见的分为随机转基因小鼠、条件性 基因敲人小鼠、基因敲除小鼠三类+5]。

由于制作方法不同，其基因型鉴定方法也不一样，目前很多实 验人员并不能很好的掌握该类实验的技术要点，从 而导致基因型鉴定工作存在混乱无序的现象。

本文 从基因型鉴定实验总体原则、三类模型的设计原理、鉴定引物设计原则及结果判定这几个方面介绍了基因型鉴定技术要点，规范基因型鉴定技术方法，保证 动物实验材料的准确性，从而推动动物模型在基础和应用科技领域的应用与发展。

同源重组双交换原理基因敲除一、同源重组原理同源重组是指两个染色体上的相同区域发生交换，交换的两个染色体必须来自于同一个亲本。

同源重组是常见的染色体遗传现象之一。

1.1 同源染色体同源染色体是指来自不同亲本但具有相似基因序列的两条染色体，它们在大小、形态和基因排列方面都相似。

人类有23对同源染色体。

1.2 交叉互换交叉互换是指发生在同源染色体上的交换现象。

在减数分裂中，配子形成前，同源染色体间会发生互换，使得每个配子都包含来自母本和父本的遗传物质。

1.3 同源重组原理在减数分裂中，当两条同源染色体上的相似区域发生交叉互换时，就会产生新的组合形式。

这种现象被称为同源重组。

二、双交换原理双交换原理是指在一对杂合子中，如果两个位点A和B位于不同的染色体上，则它们之间存在独立分离和随机联合关系。

这意味着，位于不同染色体上的两个基因在遗传过程中是相互独立的。

2.1 杂合子杂合子是指一个个体拥有两个不同等位基因的情况。

例如，在人类中，如果一个人的父母分别是Aa和Bb，则该人就是AB杂合子。

2.2 独立分离独立分离是指在一对杂合子中，两个位点A和B之间的遗传关系是相互独立的。

例如，在一个AaBb杂合子中，位于不同染色体上的A和B基因会随机分配到不同的配子中。

2.3 随机联合随机联合是指在一对杂合子中，两个位点A和B之间的遗传关系是随机组合的。

例如，在一个AaBb杂合子中，由于A和B基因在遗传过程中相互独立，所以会出现AB、Ab、aB和ab四种可能性。

三、基因敲除基因敲除是指通过技术手段使得特定基因失去功能或被删除。

这种技术可以用来研究特定基因在生物体发育、生长、代谢等方面所起到的作用。

3.1 RNA干扰技术RNA干扰技术是一种常见的基因敲除技术。

它是通过引入特定的RNA 分子，来抑制目标基因的表达。

RNA干扰技术可以用于研究基因在生物体发育、生长、代谢等方面所起到的作用。

3.2 CRISPR-Cas9技术CRISPR-Cas9技术是一种新兴的基因编辑技术。