丙酮酸对肺炎克雷伯氏菌微氧发酵甘油产1,3-丙二醇的影响

第30卷　第1期华侨大学学报(自然科学版)Vol.30　No.1 2009年1月Journal of Huaqiao University(Natural Science)　J an.2009　　文章编号:　100025013(2009)0120062205克雷伯杆菌1,32丙二醇氧化还原酶的分离纯化及其酶学性质陈宏文,聂金峰,方柏山(华侨大学工业生物技术福建省高等学校重点实验室,福建泉州362021)摘要:　在有氧条件下,利用DEA E Sepharose Fast Flow弱阴离子离子交换层析和Blue Sepharose CL26B亲和层析,同时分离并提纯克雷伯杆菌胞内的1,32丙二醇氧化还原酶和甘油脱氢酶.研究表明,1,32丙二醇氧化还原酶的纯化倍数为35.86倍,回收率为5.17%,该酶最适表观反应温度为57℃,最适反应p H值为9.5.在30℃及p H=8.0～10.0时,该酶具有良好的稳定性.在45℃和p H=9.5条件下,该酶以1,32丙二醇和NAD+为底物,其米氏常数K m分别为15.8,0.2mmol・L-1.1,32丙二醇氧化还原酶对生理反应底物32羟基丙醛活性最大,对其他醇类也有氧化能力.Mn2+对酶有显著激活作用,巯基保护剂能明显提高酶的活力.关键词:　1,32丙二醇氧化还原酶;克雷伯杆菌;甘油脱氢酶;酶学性质;纯化中图分类号:　TQ923;Q554.03文献标识码:　A1,32丙二醇是一种重要的化工原料,它最主要的用途是作为新型聚酯(如聚对苯二甲酸丙二醇)、聚醚和聚亚氨酯的单体[1].1,32丙二醇的生产方法有化学法和生物转化法.近年来,生物转化法以其利用可再生资源、对环境友好等特点日益受到人们的重视.1,32丙二醇氧化还原酶又称1,32丙二醇脱氢酶(PDOR,EC1.1.1.202),是甘油转化为1,32丙二醇的厌氧发酵途径中关键酶之一,能催化一系列还原反应和氧化反应[1].依赖辅酶Ⅰ的PDOR主要来源于克雷伯杆菌属、柠檬菌属及梭状芽孢杆菌属等,而且,大多数用于制备这种酶的细菌是需要严格厌氧培养的.迄今为止,未见有对该酶晶体结构的报道,也不能在蛋白质数据库(PDB)中搜索到该酶的结构信息1研究发现,克雷伯杆菌(兼性厌氧菌)中甘油脱氢酶(GD H)和PDOR对氧气有一定耐受力[2].本文在有氧条件下,利用离子交换层析和亲和层析,同时分离和提纯了克雷伯杆菌胞内PDOR和GD H,并考察PDOR的酶学性质.1　材料和方法1.1　主要仪器和试剂∋KTA Purifier100制备型全自动液相色谱系统,XK16/20色谱柱,D EA E Sep haro se Fast Flow离子交换层析和Blue Sep haro se CL26B亲和层析的介质(瑞典安玛西亚公司);J Y922Ⅱ型超声波细胞粉碎机(浙江宁波新芝生物科技股份有限公司);UV22401(PC)S型联机紫外可见光分光光度计,TB285型恒温水浴装置(日本岛津公司);3K30型高速冷冻离心机(德国Sigma公司).32羟基丙醛(自制)[3],其他试剂购自上海化学试剂公司,均为市售分析纯或化学纯.1.2　菌种和培养克雷伯杆菌(Klebsiell a p neumoni ae DSM2026,德国生物技术中心曾安平博士赠送).相关的细胞培养和无细胞抽提液制备方法参见文[2].　收稿日期:　2008204215　作者简介:　方柏山(19572),男,教授,主要从事合成生物学的研究.E2mail:bsfang@.　基金项目:　国家重点基础研究发展(973)计划项目(2007CB707804);国家高技术研究发展(863)计划项目(2006AA2 020103);国家自然科学基金资助项目(20676048);福建省自然科学基金计划资助项目(E0510018)1.3　酶活力测定GD H ,PDOR 酶活力用初速度法测定,参考文[1]的方法并适当修改[4].1.5mL GD H 酶活力分析反应液中含有30mmol ・L -1的(N H 4)2SO 4,0.2mol ・L -1甘油,2mmol ・L -1NAD ,1μmol ・L -1的Fe (N H 4)2(SO 4)2,0.1mol ・L -1碳酸钾缓冲溶液(p H =12.0).在45℃条件下,加入适量酶液启动反应,在紫外分光光度计(λ=340nm )下测定吸光度变化(NAD H 形成).PDOR 酶活力测定以1,32丙二醇为底物(碳酸钾缓冲溶液p H =9.5),其余同GD H 的酶活测定.酶活力定义:在上述条件下,每秒钟催化1mol 底物转化为产物所需的酶量为1kat 1酶的比活力为每克蛋白所含酶的单位数(kat ・g -1)11.4　蛋白质测定蛋白质采用Bradford 法测定[5],以牛血清白蛋白为标准蛋白.2　结果和讨论2.1　酶的分离与纯化2.1.1　离子交换层析　取6mL 的无细胞抽提液,上样到已被50mmol ・L -1Tris 2HCl 缓冲液(p H =8.4,含2mmol ・L -1二硫代苏糖醇)充分平衡的1mL 的D EA E Sep haro se Fast Flow 预装柱1采用10个柱体积的0～1mol ・L -1KCl 进行线性梯度洗脱,流速为1mL ・min -1,每管分部收集1mL ,分别测定各管GD H ,PDOR 的酶活.GD H ,PDOR 在KCl 浓度约0.3～0.6mol ・L -1处得到洗脱,两条洗脱曲线几乎重叠,如图1(a )所示.2.1.2　亲和层析　合并经离子交换洗脱具有较高GD H ,PDOR 酶活力的洗脱液,上样到Blue Sep ha 2ro se CL 26B 层析柱(1.6cm ×4cm )1用10个柱体积的0～2mmol ・L -1NAD +进行线性梯度洗脱,流速为2mL ・min -1,每管分部收集4mL ,分别测定各管酶活.PDOR ,GD H 分别在NAD +浓度0.1,0.3mmol ・L -1处得到两个洗脱酶峰,2号管为PDOR 洗脱峰,4号管为GD H 洗脱峰,两条洗脱曲线部分重叠,如图1(b )所示.(a )离子交换层析 (b )亲和层析 图1　不同方法的酶分离洗脱曲线Fig.1　Elution curve of enzymes separation with different motheds经过上述步骤,纯化过程中蛋白质量浓度及酶活力变化如表1所示.表1中,m T 为总蛋白质质量,表1　克雷伯杆菌PDOR 和G D H 的纯化Tab.1　Purification of PDOR and G D H f rom Klebsiella pneumoniae酶步骤m T /mg u /μkatρ/g ・L -1ε/μkat ・g -1η/%nPDOR粗提液108.18 2.42818.0322.5100.00 1.00离子层析交换8.660.929 1.24111.239.65 4.95亲和层析(4号管)0.160.1260.04804.0 5.1735.86亲和层析(2号管)0.180.0230.05124.00.94 5.52G D H粗提液108.18 2.36618.0321.8100.00 1.00离子层析交换8.66 1.662 1.24191.970.228.77亲和层析(4号管)0.180.1330.05720.1 5.6032.92亲和层析(2号管)0.160.0270.039171.4 1.137.8436第1期 陈宏文,等:克雷伯杆菌1,32丙二醇氧化还原酶的分离纯化及其酶学性质ρ为蛋白质质量浓度,u 为总酶活,ε为酶的比活力,η为回收率,n 为纯化倍数.由表1可知,PDOR ,GD H 的纯化倍数和回收率分别为35.86,32.92倍和5.17%,5.60%.2,4号管仍残留极少量的GD H 和PDOR 酶活,GD H 和PDOR 基本分离.以2号管中的PDOR 继续研究酶学性质.2.2　1,32丙二醇氧化还原酶的酶学性质2.2.1　最适反应温度及热稳定性　在1.5mL 的0.1mol ・L -1碳酸钾缓冲溶液(p H =9.5)的测酶活力体系中,测定温度(θ)对酶活力的影响,如图2(a )所示.图2中,σ为相对活力.从图2(a )可知,PDOR 酶活力随温度升高逐渐增加,在57℃时,PDOR 活力最大,继续升高温度,酶相对活力则急剧下降.说明PDOR 能在较高的温度下进行反应.取一定量的酶液在不同温度下分别保温30,100,240min 后,迅速冷却至室温.取出100μL 经过处理的酶液,加入到45℃的测活体系中反应,测定酶的残余活力,结果如图2(b )所示.设酶失活符合一级失活动力学方程,则30,45℃的酶活力半衰期分别为14.4,1.2h ,说明PDOR 在30℃具有较好的热稳定性.在实际的反应中,兼顾酶的最适反应温度和热稳定性,反应温度选用30～45℃.2.2.2　最适反应p H 值和p H 值稳定性　在45℃的恒温缓冲液体系(p H =6.0～8.0,50mmol ・L -1磷酸钾缓冲液;p H =9.0～12.0,50mmol ・L -1碳酸钾缓冲液)中,考察p H 值对酶活力的影响,如图2(c )所示.结果表明,PDOR 的最适反应p H 值为9.5.取一定量的酶液分别加入到等体积的不同p H 值缓冲液(同上)中,45℃保温120min.取出100μL 经过处理的酶液,加入到45℃,p H =9.5的测活体系中反应,测定酶的残余活力,考察了PDOR 的p H 值稳定性,如图2(d )所示.结果表明,在p H =7.0～10.0时,酶保持了较高的稳定性,p H 值继续增加,酶活力损失较大;当p H 值为12.0时,残余酶活力为60%左右. (a )温度2酶活力(b )p H 值2酶活力 (c )温度2酶稳定性(d )p H 值2酶稳定性图2　温度和p H 值对PDOR 活性和稳定性的影响Fig.2　Effects of temperature and p H on the activity and stability of 1,32propanediol oxidoreductase2.2.3　动力学参数　在p H =9.5和反应温度为45℃的条件下,测定不同底物浓度(另一种底物为饱和浓度)下的酶活力,以流量V 和浓度C 作Lineweaver Burk 双倒数图,如图3所示.这里测的是PDOR 的氧化反应,以1,32丙二醇和NAD +为底物1从图3可得到,1,32丙二醇和NAD +的米氏常数K m 值分46华侨大学学报(自然科学版) 2009年(a )1,32丙二醇(b )NAD图3　双倒数法测PDOR 的K m 值Fig.3　Double reciprocal plot for K m value of PDOR别为15.8,0.2mmol ・L -1,而两者的V max 值分别为7.76,6.85mmol ・(L ・min )-11结果表明,K m 值均大于来源于Clost ri di um but y ricum a [6],Cit robacter f reundii [7],L actobacill us brevis [8]等PDOR 的K m 值.文献报道NAD +的K m 值范围大致为0.076～0.370mmol ・L -1.2.2.4　酶对几种底物的相对活力　选择32羟基丙醛(32HPA )、甘油、1,22丙二醇及其他结构相似的醇类作为底物,32HPA 浓度为50mmol ・L -1,其他底物浓度均为0.1mol ・L -1,反应液中还含有30mmol ・L -1(N H 4)2SO 4,1μmol ・L -1Fe (N H 4)2(SO 4)2,0.2mmol ・L -1的NAD H 和0.1mol ・L -1碳酸盐缓冲液(p H =9.5).以32HPA 酶活力为100%,考察PDOR 对几种底物的相对活力(σ),结果如表2所示.由表2可知,PDOR 对生理反应底物32H PA 活性最大,其次是正戊醇、正丙醇、乙二醇、1,42丁二醇.PDOR 相对较低的底物专一性与已知的大多数PDOR 一致.PDOR 对乙醇、1,32丁二醇、1,22丙二醇、甲醇、异丙醇以及糖醇活性则很低.表2　PDOR 对几种底物的相对活力比较Tab.2　Substrate specificity of PDOR底物σ/%底物σ/%底物σ/%32羟基丙醛100乙醇2正丙醇15甘油11甲醇5异丙醇51,22丙二醇41,32丁二醇3正戊醇21乙二醇141,42丁二醇12木糖醇2.2.5　金属离子对酶的影响　在10mmol ・L -1含有不同一价、二价金属离子的氯盐反应液中,考察金属离子对酶活力的影响,结果如表3所示.反应液中还含有0.1mol ・L -1的1,32丙二醇,2mmol ・L -1表3　金属离子对PDOR 的影响Tab.3　Effects of metal ions on PDOR 阳离子σ/%阳离子σ/%对照组100Mn 2+312N H +4112Mg 2+65Na +80Ca 2+24Li+101Fe2+134的NAD +和0.1mol ・L -1碳酸盐缓冲液(p H =9.5),以不另外添加金属离子为对照(酶活力为100%)1由表3可知,Mn 2+对PDOR 有明显激活作用,这与Clost ri di um but y ricum a [5],L actobacil 2l us brevis [7],L actobacill us buchneri [7]中的PDOR一致.Fe 2+,N H +4及Li +对PDOR 也有一定的激活作用,Ca 2+,Mg 2+和Na +表现出24%至80%的相对活力.在实验中加入2mmol ・L -1的巯基保护剂如二硫苏糖醇(D T T ),发现巯基保护剂能明显提高PDOR 酶活力1说明PDOR 的活性中心可能含有巯基,受到D T T 的保护后,酶活力可免遭氧化破坏.3　结束语在有氧条件下,利用D EA E Sep haro se Fast Flow 弱阴离子离子交换层析和Blue Sep haro se CL 26B 亲和层析,同时分离并提纯克雷伯杆菌胞内PDOR 和GD H.与文献报道的严格厌氧条件或经多步纯化56第1期 陈宏文,等:克雷伯杆菌1,32丙二醇氧化还原酶的分离纯化及其酶学性质66华侨大学学报(自然科学版) 2009年只得到一种关键酶相比,更便于实际操作.实验结果表明,PDOR的纯化倍数和回收率分别为35.86倍和5.17%1该酶最适表观反应温度和最适反应p H分别为57℃和9.51在30℃及p H=8.0～10.0时,该酶具有良好的稳定性1参考文献:[1]　A HRENS K,M ENZEL K,ZEN G A P,et al.K inetic dynamic,and pathway studies of glycerol metabolism byKlebsiella pneumoniae in anaerobic continuous culture(Ⅲ):Enzymes and fluxes of glycerol dissimilation and1,32 propanediol formation[J].Biotech Bioeng,1998,59(5):5442552.[2]　陈宏文,王　蔚,方柏山,等.克雷伯杆菌生产1,32丙二醇关键酶发酵条件研究[J].高校化学工程学报,2004,18(5):6212627.[3]　陈宏文,洪其文,徐　晶,等.克雷伯杆菌有氧发酵利用甘油生产32羟基丙醛的研究[J].现代化工,2004,24(11),36239.[4]　陈宏文,王　蔚,方柏山,等.克雷伯杆菌生产1,32丙二醇关键酶酶活分析方法研究[J].广州食品工业科技,2004,20(3):529.[5]　汪家政.蛋白质技术手册[M].北京:科学出版社,2000:42247.[6]　MAL AOU I H,MARCZA K R.Separation and characterization of the1,32propanediol and glycerol dehydrogenaseactivities f rom Clost ri di um but y ricum E5wild type and mutant D[J].Appl Microbiol,2001,90:100621014.[7]　DANIEL R,BO EN IGK R,GO T TSCHAL K G.Purification of1,32propanediol dehydrogenase from Cit robacterf reundii and cloning,sequencing,and overexpression of the corresponding gene in Escherichia coli[J]1J Bacteriol,1995,177:215122156.[8]　V EO GA2DA2CUN HA M,FOSTER M A.1,32propanediol:NAD+oxidoreductase of L actobacill us brevis and L ac2tobacill us buchneri[J].Appl Environ Microbiol,1992,58:200522010.Purif ication and Characterization of1,32PropanediolOxidoreductase from Klebsiell a p neumoniaeC H EN Hong2wen,N IE Jin2feng,FAN G Bai2shan(Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Fujian Province University,Huaqiao University,Quanzhou362021,China)Abstract:　1,32propanediol oxidoreductase f rom Klebsiella pneumoniae was purified by DEA E sepharose fast flow ion2 exchange chromatography and Blue Sepharose CL26B affinity chromatography under aerobic conditions.A35.862fold pur2 ification was obtained with the recovery of5.17%activity.The optimum temperature and p H of the enzyme activity were 57℃and9.5of p H value.At30℃and at range of p H8.0～10.0,1,32propanediol oxidoreductase was stable.At45℃and p H9.5the K m for1,32propanediol and NAD+were15.8mmol・L-1and0.2mmol・L-1,respectively.The enzyme oxidized other alcohols such as pentanol,propanol,ethylene glycol and1,42butanediol,besides physiological substrate32 hydroxypropionaldehyde.The enzyme was significantly activated by Mn2+.Reducing agents were able to enhence the ac2 tivity of1,32propanediol oxidoreductase.K eyw ords:　1,32propanediol oxidoreductase;Klebsiella pneumoniae;characterization;purification(责任编辑:黄仲一 英文审校:陈国华)。

磷酸根对海洋克雷伯氏菌合成1,3-丙二醇代谢的影响李莉莉;周胜;高品;郭传宇;俞也频;尼松伟;李鹏飞;秦启伟【摘要】Klebsiella pneumoniae HSL4 is an excellent strain for the fermentation of 1,3-propanediol(1,3-PDO), which was isolated from coastal mangrove sediment environment. Many nutrient factors are involved in the culture medium ofK. pneumoniae HSL4. Among them, phosphate is one of the main factors, which have a significant impact on the fermentation. The effects of the low concentration of phosphate (LP:1.6×10?4mol·L?1 PO43?) and the high concentra tion phosphate (HP:5.0×10?3mol·L?1 PO43?) on cell growth, 1,3-PDO and by-product (acetic succinic acid, lactic acid, acid, 2,3-butanediol, and ethanol) production were studied. The impacts of phosphate on the metabolism ofK. pneumoniae HSL4 were characterized by metabolic flux analysis. The results showed that the final concentration of 1,3-PDO was 75g·L?1 under both LP and HP in the culture medium. Significantly, the 1,3-PDO conversion was higher, but the substrate glycerol consumption and by-products (except for 2,3-butanediol) accumulation were less under LP condition compared to HP condition. The productions of acetic acid and ethanol were higher under HP condition. The accumulations of acetic acid and ethanol will change the environment of fermentation and increase the difficulty of product separation in the downstream. Metabolic flux distributions in four fermentation periods (adjustmental phase, log phase, stationary phase, and decline phase) were analyzed. This study will helpresearchers to choose reasonable phosphate concentration in the culture broth and provide information for process control and metabolic regulation in 1,3-PDO fermentation byK. pneumoniae HSL4.%海洋克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniaeHSL4是一株分离于海洋沉积物环境的用于发酵生产1,3-丙二醇(1,3-propanediol, 1,3-PDO)的优良菌株.K. pneumoniaeHSL4发酵生产1,3-PDO的培养基包含多种营养因子,其中磷酸根对发酵过程影响较大.利用5L发酵罐进行补料发酵实验,分别考察培养基中低磷(1.6×10–4mol·L–1 PO43–)和高磷(5.0×10–3mol·L–1 PO43–)浓度条件下K. pneumoniaeHSL4发酵生产1,3-PDO过程中细胞生长、1,3-PDO及多种副产物生成的规律,分析初始磷酸根浓度差异对K. pneumoniaeHSL4不同发酵阶段代谢流分布的影响.结果表明,培养基中高、低初始磷酸根浓度条件下, 1,3-PDO的终浓度均在75g·L–1左右.在低磷条件下,底物甘油消耗量较少,具有较高的1,3-PDO转化率; 除2,3-丁二醇外, 其他副产物在发酵液中的积累均小于高磷条件下副产物的积累.高磷条件促进乙酸、乙醇、乳酸等副产物生成, 改变中、后期发酵环境, 增加下游分离提取1,3-PDO的压力.根据高、低初始磷酸根浓度条件下菌体生物量、产物、副产物合成的差异, 对细菌4个发酵时期(延滞期、对数生长期、平台期和衰亡期)的代谢流分布及其变化进行了分析.研究结果可以为合理配比培养基中磷酸盐浓度、进行发酵生产1,3-PDO过程控制与代谢调控提供理论依据.【期刊名称】《热带海洋学报》【年(卷),期】2015(034)005【总页数】9页(P27-35)【关键词】克雷伯氏菌HSL4;磷酸根;发酵;1,3-丙二醇;代谢流分析【作者】李莉莉;周胜;高品;郭传宇;俞也频;尼松伟;李鹏飞;秦启伟【作者单位】中国科学院南海海洋研究所,中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室;广东广州 510301;中国科学院南海海洋研究所,中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室;中国科学院大学,北京 100049;中国科学院南海海洋研究所,中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室;广东广州 510301;中国科学院南海海洋研究所,中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室;广东广州 510301;中国科学院南海海洋研究所,中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室;广东广州 510301;中国科学院南海海洋研究所,中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室;广东广州 510301;中国科学院南海海洋研究所,中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室【正文语种】中文【中图分类】P7351,3-丙二醇(1,3-Propanediol, 1,3-PDO)是一种重要的化工原料, 可以作为溶剂用在润滑剂、油墨、抗冻剂、印染、药物生产等方面。

高产1,3-丙二醇菌株的诱变与筛选唐广明;徐佳杰;徐卫涛;李凤辰;付水林;宫衡【摘要】为提高克雷伯氏肺炎杆菌产1,3-丙二醇(1,3-PD)的能力,利用紫外线对其进行诱变,建立了一种高效高通量的摇瓶传代连续富集培养筛选抗产物抑制菌株的方法,筛选出了4株抗1,3-PD抑制且高产1,3-PD的菌株,分别命名为KpⅠ、KpⅡ、KpⅢ和KpⅣ,其1,3-PD产量分别为74.80 g·L-1、77.98 g·L-1、76.04 g·L-1、73.50 g·L-1,比出发菌株提高了14.5%、19.4%、16.4%、12.5%.1,3-PD得率分别比出发菌株提高了8.1%、14.8%、11.5%、6.6%.【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2010(027)003【总页数】5页(P46-50)【关键词】克雷伯氏肺炎杆菌;诱变;连续传代富集培养;1,3-丙二醇【作者】唐广明;徐佳杰;徐卫涛;李凤辰;付水林;宫衡【作者单位】华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237【正文语种】中文【中图分类】TQ9231，3-丙二醇(1,3-Propanediol，简称1,3-PD)是一种重要的化工原料，可用作溶剂、抗冻剂或保护剂、精细化工原料以及新型聚酯——聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)和聚氨酯的单体。

开发低成本、环境友好的生物法1,3-丙二醇生产工艺已成为各国关注的热点。

自然界中能将甘油转化为1,3-PD的微生物主要包括：肠道菌中的克雷伯氏菌、肠杆菌、柠檬酸杆菌、乳酸杆菌和梭状芽孢杆菌中的丁酸梭菌、巴斯德梭菌[1]。

食品与发酵工业F OOD AND FERMENTAT I ON I N DU ST R I ES梯度洗脱高效液相色谱法快速测定1, 3 丙二醇发酵液中有机酸*王元好 , 董悦生 , 修志龙(大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系 , 辽宁大连 , 116024摘要提出了一种快速分析发酵液中 9种有机酸的高效液相色谱方法。

该方法利用 R Spak KC -811色谱柱 (300mm 8mm i d , 采用超纯水 -4mm ol/L高氯酸为流动相进行梯度洗脱。

流动相流速 1 0mL /mi n , 紫外检测波长 210nm, 柱温 60 时 , 能够快速、准确地分离测定发酵液中的丙酮酸、柠檬酸、苹果酸、延胡索酸、琥珀酸、乳酸、甲酸、乙酸等 8种有机酸 , 分析时间只需 15m in 。

各种有机酸的线性相关系数 R 2! 0 9992, 精密度的相对标准偏差为 0. 97%-2. 72%, 样品回收率为 96 8%-102 5%, 具有较高的精密度和准确度 , 可以用于 1, 3 丙二醇发酵液中有机酸的分析。

关键词高效液相色谱 , 梯度洗脱 , 有机酸 , 1, 3 丙二醇 , 发酵液第一作者 :博士研究生 (修志龙教授为通讯作者。

*∀ 863#计划项目 (2007AA02Z208 和∀ 973#计划项目 (2007CB 714306收稿日期 :2009-07-10, 改回日期 :2009-11-16代谢组学 (m e tabono m ics 是近几年来的一门新兴学科 , 主要应用高效液相色谱、气相色谱质谱、液相色谱质谱以及核磁共振等现代分析仪器手段 , 定性定量的研究生物体内代谢产物及其随时间变化的规律 [1]。

质谱及核磁共振等分析手段由于仪器价格昂贵、专业性强 , 限制了其普及应用。

因而开发常规仪器 H PLC 在代谢组学领域的应用具有重要意义。

微生物代谢过程中会生成有机酸 , 分析有机酸的种类、含量和变化趋势 , 对于了解不同条件下菌体内的代谢通量分布 , 发酵过程的优化控制具有指导意义。