Western blot 、蛋白质双向电泳的原理、方法及在医学中的应用 (最终版)

活性蛋白整体方案免疫印迹(Western Blot)的基本原理、实验步骤Western Blot原理Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

SDS-PAGE 可对蛋白质样品进行分离，转移到固相载体——例如硝酸纤维素薄膜（NC）上。

固相载体可以吸附蛋白质，并保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

转移后的NC膜就称为一个印迹（blot），用蛋白溶液（如5%BSA 或脱脂奶粉溶液）处理，封闭NC膜上的疏水结合位点。

用目标蛋白的抗体（一抗）处理NC膜——只有待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。

用一抗处理过的NC膜再用标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。

处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。

实验操作(一)配胶1.将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。

2.分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡），加入10%AP及TEMED即可。

3.封胶：灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。

封胶后静置至胶凝固。

待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O活性蛋白整体方案冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。

4.灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时防止气泡进入梳孔使梳孔变形。

拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。

westernblot原理及步骤Western blot原理及步骤。

Western blot（简称WB）是一种常用的蛋白质分析技术，通过检测特定蛋白在混合物中的存在和量来研究蛋白质的表达和功能。

它是一种通过特异性抗体对蛋白质进行识别和检测的方法，具有高灵敏度和高特异性的特点。

本文将介绍Western blot的原理及步骤，希望能对初学者有所帮助。

一、原理。

Western blot的原理基于蛋白质的电泳分离和免疫检测。

首先，待检样品经过SDS-PAGE凝胶电泳分离，然后将蛋白质转移到聚丙烯酰胺膜（PVDF）或硝酸纤维素膜上。

接下来，膜上的蛋白质与特异性的一抗结合，再与二抗结合，形成特定的免疫复合物。

最后，通过化学发光或染色等方法检测蛋白质的存在和量。

二、步骤。

1. 样品制备。

将待检样品加入SDS-PAGE样品缓冲液，并在100℃水浴中煮沸5分钟，使蛋白质变性。

然后冷却至室温，并离心去除沉淀物。

2. 凝胶电泳。

将样品加载到SDS-PAGE凝胶孔中，进行电泳分离。

根据蛋白质大小选择合适的分离凝胶浓度和电泳条件。

3. 转膜。

将凝胶中分离的蛋白质转移到PVDF或硝酸纤维素膜上，通常使用半干法或湿法转膜。

4. 封闭。

将转膜浸泡在牛血清蛋白（BSA）或非脂奶粉的封闭缓冲液中，阻断非特异性结合位点。

5. 抗体孵育。

将特异性的一抗加入封闭转膜的缓冲液中，孵育一定时间，使一抗与目标蛋白结合。

6. 洗涤。

用洗涤缓冲液洗涤转膜，去除未结合的一抗。

7. 二抗孵育。

将与目标蛋白特异性结合的二抗加入转膜的缓冲液中，孵育一定时间，形成特异性的免疫复合物。

8. 洗涤。

用洗涤缓冲液洗涤转膜，去除未结合的二抗。

9. 检测。

通过化学发光或染色等方法检测蛋白质的存在和量，最终得到Western blot结果。

总结。

Western blot技术是一种重要的蛋白质分析方法，具有高灵敏度和高特异性的优点。

掌握其原理及步骤对于科研工作者来说至关重要，希望本文能够对初学者有所帮助。

免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。

对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

Western Blot技术：一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

二、分类western显色的方法主要有以下几种：i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECLiii. 底物荧光ECFiv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。

只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP 标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

三、主要试剂1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。

)储于棕色瓶，4℃避光保存。

严格核实PH 不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。

使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。

如有沉淀，可以过滤。

2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。

Western Blot 原理和操作方法（全）工作原理蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用.SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量.PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS 与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基.样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳.另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部.重要参数①聚丙烯酰胺凝胶(PAG)制备原则:由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺在凝胶中的总浓度(T)以及双体占总浓度的百分含量即交联度(C)决定的,因而制胶之前必须首先知道这两个参数.一般可以由下述公式计算:T%=(a+b)/m*100%; 和C%=a/(a+b)*100%其中: a=双体(bis)的重量;b=单体(arc)的重量;m=溶液的体积(ml)②当分析一个未知样品时,常常先用7.5%的标准凝胶制成4-10的梯度凝胶进行试验,以便选择理想的胶浓度.如果蛋白质的分子量已知,可参考下表选择所需凝胶浓度:蛋白质分子量范围(Da) 适宜的凝胶浓度(%)<10420-301×104-4×10415-204×104-1×10510-151×105-5×1055-10>5×1052-5蛋白分子量 (kDa)凝胶浓度 (%)4-40 20 12-45 15 10-70 12.5 15-100 10 25-2008③分离胶（5ml 体积）:5%的积层胶的配置：蛋白质的样品制备：蛋白质的样品制备是Western Blotting 的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题：1：在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。

试述western blot技术的原理、方法、注意事项及其在医学科研中的应用。

1. 引言1.1 概述Western blot技术是一种常用的分子生物学实验方法，用于检测、定量和分析特定蛋白质在复杂混合物中的表达和相互作用。

它具有高灵敏度、高特异性和较为准确的测量能力，因此在医学科研领域中得到广泛应用。

1.2 文章结构本文将详细介绍Western blot技术的原理、方法、注意事项以及在医学科研中的应用。

首先，我们将阐述免疫检测原理、蛋白质分离与转移原理以及免疫染色与检测原理，帮助读者全面了解该技术的基本原理。

其次，我们将描述样品制备与电泳条件设置、蛋白质转移与固定方法以及免疫染色及可视化方法，为读者提供详细的实验步骤。

随后，我们将介绍实验室操作要求及安全措施、样品处理和保存注意事项以及技术参数调整和结果解读注意事项，以保证实验的准确性和可重复性。

最后，在医学科研领域中的应用方面，我们将以蛋白质表达水平检测、蛋白质亚细胞定位分析以及蛋白质相互作用和功能分析为例，展示Western blot技术在疾病诊断和药物研发等方面的重要应用。

1.3 目的本文的目的是为读者提供对Western blot技术全面了解，并指导其在医学科研中正确应用该技术。

通过详细介绍该技术的原理、方法和注意事项，读者将能够准确地进行实验操作并正确解读结果，同时也能够认识到其在医学科研中的重要性和广泛应用价值。

2. Western blot技术原理2.1 免疫检测原理Western blot技术是一种常用于检测特定蛋白质的免疫学方法。

它基于抗原与抗体的特异性结合关系，通过将蛋白质溶液经过电泳分离、转移到固体载体上，并使用特异性抗体识别目标蛋白质，从而实现对目标蛋白质的定性和定量检测。

在Western blot中，首先需要将待检测的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离。

然后，通过将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶或其他固体载体上，在固相载体上形成一个被称为“Western blotting”的蛋白质模式。

WesternBlot原理和操作方法样品制备是Western Blot起始的步骤之一、首先，需要从生物学样本中提取目标蛋白质。

常见的提取方法包括细胞裂解、组织均质和亲和纯化等。

提取后的样品需要经过蛋白质浓度测定，以确保加载相同数量的蛋白质。

接下来，需要将样品进行电泳分离。

这通常是通过聚丙烯酰胺凝胶（SDS-）电泳实现的。

SDS（十二烷基硫酸钠）能够破坏蛋白质的非共价键，使蛋白质呈现线性构象。

电泳根据蛋白质的分子量将其分离成不同的带状条带。

接下来是转膜的步骤。

将凝胶中分离的蛋白质转移到聚合物膜上。

这通常是通过湿式转膜实现的，其中聚合物膜与凝胶是紧密接触的。

电场将带有电荷的蛋白质从凝胶中转移到膜上。

然后进行免疫反应。

转膜后的膜需要被阻断以避免非特异性结合。

一般会使用非特异性蛋白质溶液，如牛血清蛋白（BSA）或脱脂奶粉。

然后，在阻断溶液中加入一种特异性的抗体，抗体可以与感兴趣的蛋白质结合。

抗体结合的蛋白质可以被进一步检测。

最后是图像开发阶段。

Western Blot的图像开发通常是通过酶标记二抗的荧光或酶标记产生的化学发光。

这意味着在膜上的蛋白质上有特异性抗体结合。

然后，在图像上使用相应的技术来检测抗体结合的蛋白质，以获得目标蛋白质的图像。

总结起来，Western Blot是一种广泛应用于生物学研究的技术，用于分析复杂的蛋白质混合物。

它通过电泳和免疫反应的结合，可以检测和分离出特定的蛋白质。

虽然操作过程较为复杂，但其可靠性和准确性使其成为许多实验室中常用的技术。

蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项实验方法原理Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。

对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HClβ-巯基乙醇ddH2O甘氨酸Tris甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒实验步骤一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。

2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。

3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。

4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24 g；加ddH2O至1000 ml。

5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸 2 ml；ddH2O118 ml。

westernblot原理及步骤蛋白免疫印迹即Werstern blot，是将印迹技术与抗原-抗体反应的特异性相结合的检测技术，用于分离和检测生物标本中的某一特定蛋白。

其基本原理实混合蛋白质样本通过凝胶电泳分离后，通过特殊虹吸或电场装置印迹至固相介质（NC膜或PVDF 膜）上，将针对待测蛋白的特异性抗体作用于滤膜上，利用抗体上偶联的酶降解底物在滤膜上生成有色沉淀物或化学发光产物，从而显示出待测蛋白的存在及量。

Western blot原理通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。

Western blot实验步骤一、样本制备1、样本的来源：细胞培养上清；细胞（胞浆蛋白、胞膜蛋白、胞核蛋白）；组织匀浆2、不同样本有不同的提取方式：蛋白完全裂解液、RIPA、胞核/胞浆3、蛋白的提取：裂解前加入蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂使其终浓度为1mM4、蛋白定量：BCA检测法(灵敏度高，操作简单，常用)、Bradford 检测法、Lowry 检测法、UV测量、电泳检测5、样本上样前的处理：蛋白提取液和SDS上样缓冲液（Loading buffer）以一定的比例上样6、蛋白变性：95-100℃变性5分钟（为了能使抗体接触到抗原表位，必须将蛋白的三维结构打开，因此需要将蛋白变性，核蛋白要增加裂解液体积和超声破碎次数，煮样时间延长至10-15min）二、上样与电泳原理：裂解后的蛋白质样本经过高速离心去除不溶物后，再经SDS上样缓冲液95-100℃变性5分钟，使带有强负电荷的SDS与带有弱电荷的蛋白质结合，大量的SDS可掩盖蛋白质本身的电荷量，只显示SDS的负电荷，在pH8.6~pH8.8的Tris-甘氨酸不连续SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶）系统中，蛋白质的电泳与自身电荷量无关，只和其分子大小有关，从而将蛋白质按分子量大小顺序分离。

Western Blot 原理和操作方法（详细）工作原理蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用.SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量.PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基.样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳.另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部.重要参数①聚丙烯酰胺凝胶(PAG)制备原则:由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺在凝胶中的总浓度(T)以及双体占总浓度的百分含量即交联度(C)决定的,因而制胶之前必须首先知道这两个参数.一般可以由下述公式计算:T%=(a+b)/m*100%; 和C%=a/(a+b)*100%其中: a=双体(bis)的重量;b=单体(arc)的重量;m=溶液的体积(ml)②当分析一个未知样品时,常常先用7.5%的标准凝胶制成4-10的梯度凝胶进行试验,以便选择理想的胶浓度.如果蛋白质的分子量已知,可参考下表选择所需凝胶浓度:蛋白质分子量范围(Da) 适宜的凝胶浓度(%)<104 20-301×104-4×104 15-204×104-1×10510-151×105-5×105 5-10>5×105 2-5③分离胶:电泳凝胶浓度试剂10% 12% 15% 10% 12% 15%H2O(ml) 4.0 3.3 2.3 5.9 4.93.430%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 3.3 4.0 5.0 5.0 6.07.51.5mol/lTris.cl(PH8.8) (ml)2.5 2.5 2.53.8 3.8 3.810%SDS(ml) 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.1510%AP(ml) 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.15TEMED(μl) 4 4 4 6 6 6总体积(ml) 10 15④浓缩胶试剂浓度(5%)H2O(ml) 4 230%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 1 0.51.0mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 1 0.510%SDS(μl) 80 4010%AP(μl) 60 30TEMED(μl) 84总体积(ml) 6 3蛋白质的样品制备：蛋白质的样品制备是Western Blotting的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题：1：在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。

蛋⽩质免疫印迹（WesternBlot）实验步骤和原理及注意事项蛋⽩质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋⽩样品(Protein sample preparation)可以使⽤适当的裂解液。

收集完蛋⽩样品后，为确保每个蛋⽩样品的上样量⼀致，需要测定每个蛋⽩样品的蛋⽩浓度。

根据所使⽤的裂解液的不同，需要采⽤适当的蛋⽩浓度测定⽅法。

因为不同的蛋⽩浓度测定⽅法对于⼀些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很⼤。

BCA法。

2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋⽩样品中加⼊适量浓缩的SDS-PAGE蛋⽩上样缓冲液。

例如2X或5X的SDS-PAGE蛋⽩上样缓冲液。

使⽤5X的SDS-PAGE蛋⽩上样缓冲液可以减⼩上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋⽩样品。

100℃或沸⽔浴加热3-5分钟，以充分变性蛋⽩（根据蛋⽩分⼦的⼤⼩，煮沸时间可适当变化，⼀般不低于5min。

煮沸只是变性蛋⽩，⽽不是分解，⼀般加了抑制酶不会分解。

煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋⽩质的⽴体⼆级结构,伸展为⼀维线性结构,所以⼀般来讲⼆聚体都会解体,才能完全按照分⼦量跑电泳,加的蛋⽩Marker才有指⽰分⼦量的意义。

蛋⽩样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋⽩呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离⼼5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另⼀管,4度可以放⼀周备再次电泳）。

(3)电泳i.清洗玻璃板：⼀只⼿扣紧玻璃板，另⼀只⼿蘸点洗⾐粉轻轻擦洗。

两⾯都擦洗过后⽤⾃来⽔冲，再⽤蒸馏⽔冲洗⼲净后⽴在筐⾥晾⼲。

ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放⼊夹中卡紧。

然后垂直卡在架⼦上准备灌胶。

（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。

）（2）配10%分离胶，加⼊TEMED后⽴即摇匀即可灌胶。

westernblot原理及步骤Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。

对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

操作步骤（一）蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。

然后4℃，13,000g 离心15min。

取上清液作为样品。

（二）电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。

（三）转移：（半干式转移）1、电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次。

2、膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min。

3、转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。

接通电源,恒流1mA/cm2，转移1.5hr。

转移结束后，断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。

将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。

值得一提的是，western blot 这个名称的由来很有意思。

Western blot的原理、操纵及注意事项之五兆芳芳创作原理：通过电泳区分不合的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技巧结合了凝胶电泳的高分辩率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng （最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白.一、抗原的选择和制备A：样品的制备1 组织：组织的处理办法：组织洗涤后参加3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，参加5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清.参加βME(9.5ml参加0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml参加0.5ml）煮沸10min，分装后于20℃保管，用时取出，直接溶解上样.2 细胞：细胞的处理办法：离心收集细胞或直接往细胞培养瓶内参加5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清.参加βME(9.5ml参加0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml参加0.5ml）煮沸10min，分装后于20℃保管，用时取出，直接溶解上样.3 排泄蛋白的提取（特例）：直接收集排泄液，参加βME、溴酚蓝制样.B：蛋白的定量办法及影响蛋白定量原因1.双缩脲法：双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的办法.在需要快速，但不很准确的测定中，经常使用此法.硫铵不搅扰显色，这对蛋白质提纯的早期阶段是很是有利的.双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收.双缩脲法经常使用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白质溶液测定.搅扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等.可用沉淀法除去搅扰物，即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1m NaOH 溶解沉淀的蛋白质进行定量测定.2.Lowry法：此法是双缩脲法的进一步成长.他的第一步就是双缩脲反响，即Cu++与蛋白质在碱性溶液中形成络合物，然后这个络合物复原磷钼磷磷钨酸试剂（福林酚试剂），结果得到深蓝色物.此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L～400mg/L含量的蛋白质溶液.其搅扰物质与双缩脲法相同，并且受他们的影响更大，硫醇和许多其他物质的存在会使结果严重偏差.另外要注意的是，参加福林试剂时要特别小心，试剂只在酸性pH情况中才稳定，上述提到的复原反响只有在pH10时才产生，因此，福林试剂参加到碱性的Cu2+蛋白质溶液中时，必须立刻搅拌，以使磷钼酸磷钨酸试剂在未被破坏之前能有效地被Cu2+蛋白质络合物所复原.3.紫外吸收法：大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故，因此，利用这个特异性吸收，可以计较蛋白质的含量.如果没有搅扰物质的存在，在280nm处的吸收可用于测定0.1～0.5mg/ml含量的蛋白质溶液.部分纯化的蛋白质常含有核酸，核酸在260nm波长处有最大吸收.有核酸时，所测得的蛋白质浓度必须作适当校正，一般按下述公式粗略计较：是蛋白质溶液在280nm波长处（光程1厘米）测得的光密度值.是蛋白质溶液在260nm小波长处（光程1厘米）处所测得的光密度值.此方程是从烯醇酶（在酵母核酸存在时）得出来的.因此，对其他蛋白质和其他核酸不一定适用.由于各类蛋白质所含芬芳族氨基酸的量不合，因此，浓度为0.1%的各类蛋白质在280nm处的消光系数（）在0.5～2.5之间变更.所有的蛋白质在230nm以下都有强吸收.例如，牛血清白蛋白的α0.1%在225nm和215nm处辨别为 5.0和11.7，而在280nm处测为0.58.在230nm以下的强吸收是由于肽键的存在，因此，此值对所有的蛋白质都是一样的.从215nm和225nm处的光密度之差可用于测定浓度为10μl/ml～100μl/ml的蛋白质.蛋白质浓度可以近似地由下式得到：光密度之差求得，这一公式是减去溶液中非蛋白质成分产生的误差.但是，蛋白质之间的份子量差别比较大，因此，在比较几种蛋白质含量时，必须作适当的校正.由于蛋白质的吸收峰常因pH改动而变更，所以在制作尺度曲线时，必须与样品条件一致.4. Bradford比色法：Bradford比色法比Lowry法测定蛋白浓度更复杂迅速.用脱氧胆酸/三氯乙酸沉淀蛋白可排除甘油、去污剂、2巯基乙醇、乙酸、硫酸铵、Tris和一些碱性缓冲系统的搅扰.辨别在两组微量离心管中各参加0.5mg/ml牛血清白蛋白（5，10，15和20µl），以0.15mmol/l NaCl补足至100µl，同时以两管100µl的0.15mmol/l NaCl作空白对照.每管各参加1ml考马斯亮蓝染料溶液，振荡混匀，室温放置2分钟.用1cm光径的微量比色杯测A595，取A595吸光值对尺度蛋白浓度作图，画尺度曲线，并丈量待测样品的A595.从BSA尺度曲线中确定待测样品的浓度.测定10100µg的蛋白质，要在较大试管中将染料溶液体积增大5倍进行.样品浓度太高，可稀释落后行，或在10100µg另作一尺度曲线进行测定.5．电泳预算法（我们选择此法）：样品倍比稀释，SDSPAGE电泳，同时做定量marker对照，可以预算样品大概浓度.以提取癌组织总蛋白为例：①取等量胰腺癌组织、癌旁组织及正常胰腺组织，用dH2O漂洗5～10次，再用预冷的1×PBS洗涤3次，目的是去除样本中的血液.②每2克组织参加3ml 1×PBS匀浆，保持在4℃条件进行.③参加5×STOP Buffer缓冲液1ml，混匀，4℃下超声碎化.再参加0.5ml βME，0.5ml溴酚蓝，煮沸10mins，至此，制样进程完成；④SDSPAGE电泳，以BAS作为对照估量样品蛋白浓度.二、SDS聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS－PAGE）A：实际操纵1.做胶前的准备1)查抄是否有足够的、洁净的 spacer、comb 和架子.2)查抄是否有新鲜的，足量10%APS，没有立刻重配.3)按将要检测的抗体对应的原始抗原的份子量大小，计较出胶的浓度，并算出别离胶各组分的用量.2.制胶，电泳1）装好架子.2)依照下面配方配制别离胶.(单位：ml，Total： 8ml)在胶上面参加一层蒸馏水，促进胶更好的凝集.3)待别离胶凝集后，配制浓缩胶.(单位：ml，Total： 3.5ml)倒好后拔出预先准备好的梳子.4)待胶凝集好后，上样，电泳. 上层胶用6080V电压，当样品至别离胶时，用100120V电压.一般电泳时间在1.5小时左右.B ：注意事项及常遇到的问题1）别离胶不要倒的太满，需要有一定的浓缩胶空间，不然起不到浓缩效果.2）上样蛋白量不该超出30ug/mm2 (载荷面即：如果你的胶槽是5mm×1mm，则载荷面为：1mm×5mm=5mm2) .3）gel通常在0.51h内凝集最好，过快暗示TEMED、APS用量过量，此时胶太硬易龟裂，并且电泳时容易烧胶.太慢则说明两种试剂用量不敷或系统实际不纯或实效.4）混杂搅拌速度太快产生气泡影响聚合，导致电泳带畸形.太慢不均匀，特别是甘油.5）电泳中常出现的一些现象：︶条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却欠好.︵条带呈皱眉状，可能是由于装置不适合，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或两边聚合不完全.拖尾：样品溶解欠好.纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒.条带偏斜：电极不服衡或加样位置偏斜.条带两边扩散：加样量过量.三、转移在电流的作用下，使蛋白质从胶转移至固相载体（膜）上.膜的选择：印迹中经常使用的固相资料有NC膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF等.我们选用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性.有两种规格：ImmobilonP（0.45um）和ImmobilonPSQ(0.2um for MW<20kDa).A 半干法行将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间，通过滤纸上吸附的缓冲液传导电流，起到转移的效果.因为电流直接作用在膜胶上，所以其转移条件比较严酷，但是其转移时间短，效率高.1 实验条件的选择电流1mA2mA/cm2，我们通常100mA/膜，依照目的蛋白份子大小、胶浓度选择转移时间，具体可以按照实际适当调整.2 实验操纵（1）滤纸和膜的准备(在电泳结束前20分钟应开始准备任务).A.查抄是否有足够的transfer buffer，没有立即配制.B.查抄是否有适合大小的滤纸和膜.C.将膜泡入甲醇中，约12分钟.再转入transfer buffer中.D.将适合的靠胶滤纸和靠膜滤纸辨别泡入transfer buffer中.（2）转移A.在电转移仪上铺好下层滤纸.一般用三层.B.将膜铺在靠膜滤纸上，注意和滤纸间不要有气泡，再倒一些transfer buffer到膜上，保持膜的湿润.C.将胶剥出，去掉stack gel，小心的移到膜上.D.剪去膜的左上角，在膜上用铅笔标识表记标帜出胶的位置.E.将一张靠胶滤纸笼盖在胶上. 倒上些transfer buffer，再铺两张靠胶滤纸.F.装好电转移仪，按照需要选定所需的电流和时间.G.转移进程中要随时不雅察电压的变更，如有异常应实时调整.3 注意事项及常遇到的问题靠胶滤纸胶膜靠膜滤纸1）滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸>=膜>=胶.2）滤纸、胶、膜之间千万不克不及有气泡，气泡会造成短路.3）因为膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿.并且在以后的操纵中，膜也必须随时保持湿润（干膜法除外）.4）滤纸可以重复利用，上层滤纸（靠膜）内吸附有良多转移透过的蛋白质，所以上下滤纸一定不克不及弄混，在不克不及分辩的情况下，可以将靠胶滤纸换新的.5）转移时间一般为1.5 小时，( 1mA2mA/cm2，10% gel)，可按照份子量大小调整转移时间和电流大小.B 湿法我们根本上不必此办法，这里暂不做介绍.C 转移后效果的判定1．染胶用考马斯亮兰染色经destain脱色后，看胶上是否还有蛋白来反应转移的效果.2．染膜有两类染液选择，可逆的和不成逆的.可逆的有ponceaus red 、Fastgreen FC、CPTS等，这类染料染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做进一步的阐发用.但是不成逆的染料，如考马斯亮兰、india ink、Amido.black 10B等，染色后膜就不克不及用于进一步的阐发.四、封锁（block）封锁是为了使我们的抗体仅仅只能跟特异的蛋白质结合而不是和膜结合.经常使用的封锁液有bovine serum albumin(BSA)，nonfat milk，casein，gelatin，tween20等，我们一般用nonfat milk.在转移结束前配好5%的Milk(TBST溶解).转移结束后将膜放入milk中block(一定要放在洁净的容器里，避免污染并且要足以笼盖膜)，并清洗整理好用过的滤纸，以便下次使用. Block 4°C O/N，或 RT 1小时.五、孵育一抗A.先将需要检测的抗体准备好，并决定好它们的稀释度.B.配好5%的Milk(TBST溶解)，按要求稀释好抗体.注意，如需高比例稀释，最好采取梯度稀释.C.将稀释好的抗体和膜一起孵育. 一般采取RT 1小时，可按照抗体量和膜上抗原量适当延长或缩短时间.注意：为了便于前面阐发结果，我们一般会选用已确定份子量大小并且纯度高的抗体作为marker与一抗同时孵育.六、洗涤用TBST先快速洗三次，把milk尽快的wash掉.然后5mins *5.洗涤是为了洗去一抗与抗原的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果布景的深浅.七、孵育二抗孵育RT1 小时. 一般采取HRP标识表记标帜的二抗，稀释比例为1:5000.二抗的稀释比例不克不及太低，不然容易导致非特异性的结合.注意二抗的选择有多种，要按照一抗来选择抗兔、抗鼠或抗羊的二抗，以及按照前面的显色条件来选择HRP、AP或GOD（葡萄糖氧化酶）酶链的二抗或标记其他探针（如核素等）的.八、洗涤用TBST先快速洗三次，把milk尽快的wash掉. 然后5mins *5.洗涤是为了洗去二抗的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果布景的深浅，所以洗涤一定要洁净.九、显色（HRP酶）1．增强化学发光法(ECL)Ecl 显色原理：氨基苯二酰肼类主要是鲁米诺及异鲁米诺衍生物，是最经常使用的一类化学发光剂.鲁米诺（luminol，5＇氨基2，3二氢1，4酞嗪二酮）的份子结构及化学反响式如下：鲁米诺在免疫测定中既可用作标识表记标帜物，也可用作过氧化物酶的底物.在Ecl底物中，含有H2O2和鲁米诺，在HRP（辣根过氧化物酶）的作用下，收回荧光来.试验步调：1）将两种显色底物1：1等体积混杂（一般各1ml/membrane）.2）将混杂物笼盖在膜概略，12分钟，摇晃使均匀.3）用保鲜膜把膜包起来，放入夹板中.4）在暗室中将X光片，笼盖在膜的上面，夹好夹子，曝光1min.5）显影、定影.6）按照结果调整曝光时间和曝光区域，得到最佳结果.注意：荧光在一段时间后会越来越弱.DAB（3,3二氨基联苯胺）和HRP反响产生棕色的不溶终产品.这种棕色沉淀不溶于酒精和其它有机溶剂，对于必须使用传统复染和封固介质的免疫组化染色应用特别理想.对于AP标识表记标帜的二抗我们选用BCIP and NBT 显色，它们在碱性磷酸酶（AP）作用下反响可生成一种不溶性黑紫色沉淀的强信号.十、阐发结果及其判断罕有问题原因阐发及处理办法：见附录一、二.附录一：Troubleshooting Blotting Problems （P43－48）附录二：Western Blotting Troubleshooting Logic Tree （P390－394）附录三：试验中所用到的试剂弛缓冲溶液1)5x Stop Solution (Sample buffer)pH6.7:Stock:to use:20% Glycerol 100ml take 9.5ml stock250mM Tris 15.14g bromphenol blue ortotal 475.00ml pyronine 4 to taste2) Gel solution (30% w/v acrylamide mix):total 100ml3) 2x Laemmli Separation Buffer:0.2% SDS 10ml 20% SDStotal 1000ml4) 2x Laemmli Stacking Buffer:0.2% SDS 1gtotal 500ml5) 10x Laemmli Running Buffer:1% SDS 20gtotal 2 liters6) Transfer Buffer:20% MeOH 200mltotal 1000ml7) TBST:100mM NaCl0.2% Tween20Total 1000ml8) Coomassie Stain :40%MeOH 400ml10%HAc 100ml0.1%BBR 1g Brilliant Blue R total 1000ml9) Destain:30%MeOH 300ml7.5%HAc 75mltotal 1000ml10) 10×丽春红染液配方：丽春红 2g磺基水杨酸 30g三氯醋酸 30gtotal 100ml11）DABDAB 50mg0.05mol/L TB （PH7.6） 100ml30%H2O2 3040ul先配成25倍的储存液，过滤后分装，20℃避光保管，H2O2在任务液中终浓度0.01％.。