病毒空斑纯化实验protocal

第1篇一、实验目的1. 掌握抗体空斑实验的原理和方法。

2. 了解抗体形成细胞（B淋巴细胞）的功能和特性。

3. 通过抗体空斑实验检测和分析抗体生成细胞的功能。

二、实验原理抗体空斑实验（Plaque Formation Cell Assay, PFC）是一种体外检测单个抗体形成细胞（B淋巴细胞）的方法。

其原理是将绵羊红细胞（SRBC）免疫家兔或小鼠，然后提取家兔淋巴结或小鼠脾细胞制成细胞悬液。

将细胞悬液与一定量的SRBC混合，在补体的参与下，抗体形成细胞会释放出溶血素，导致周围的SRBC溶解，形成肉眼可见的溶血空斑。

每个空斑代表一个抗体形成细胞，空斑的数量和大小可以反映抗体生成细胞的功能和特性。

三、实验材料与试剂1. 材料：- 家兔或小鼠- 绵羊红细胞（SRBC）- 家兔淋巴结或小鼠脾细胞- 平皿、离心机、显微镜、温箱、水浴箱等2. 试剂：- Hanks液（含Ca2+、Mg2+）- PBS（含Ca2+、Mg2+）- 底层琼脂（1.4%）- 表层琼脂（0.7%）- 补体（新鲜豚鼠血清）- 小牛血清（56℃灭活30min）四、实验步骤1. 免疫动物：将绵羊红细胞免疫家兔或小鼠，使其产生抗体。

2. 制备细胞悬液：取出家兔淋巴结或小鼠脾细胞，制成细胞悬液。

3. 准备琼脂平板：将底层琼脂加入Hanks液，融化后倒入平皿中，待凝固。

4. 混合细胞悬液：将细胞悬液与SRBC混合，加入适量的补体。

5. 倒平板：将混合液倒入平皿中的底层琼脂上，待凝固。

6. 覆盖表层琼脂：将表层琼脂加入Hanks液，融化后倒入平皿中，待凝固。

7. 温育：将平皿放入温箱中，37℃温育24-48小时。

8. 观察：用显微镜观察溶血空斑的形成情况。

五、实验结果与分析1. 实验结果：- 观察到平皿中形成了多个溶血空斑，每个空斑大小不一。

- 空斑数量较多，说明抗体生成细胞的功能较强。

2. 结果分析：- 溶血空斑的形成表明实验动物产生了抗体。

- 空斑数量和大小反映了抗体生成细胞的功能和特性。

病毒空斑纯化病毒蚀斑如同噬菌体的噬斑，一个蚀斑为一个病毒体的繁殖后代品系。

在细胞培养中做蚀斑是一种较精确的测定病毒感染的方法，将病毒各稀释度种入单层细胞瓶，吸附1h，在单层细胞上覆以营养琼脂培养基，病毒在细胞中繁殖使细胞死亡。

但由于琼脂的限制只能感染临近的细胞，形成“蚀斑”的退化细胞区，经中性红活细胞染料着色后，活细胞显红色，而蚀斑区细胞已退化步着色，形成不染色区域。

凡是能在细胞培养物中产生CPE的病毒都可以采用蚀斑技术来分离和测定。

蚀斑技术在测定病毒感染时是很好的定量方法，也是测定干扰素和抗体中和病毒繁殖能力的一种非常敏感的方法。

此外还可以用来纯化病毒，纯化时挑选合适的空斑进行传代即可。

若目的是要提高病毒能力，应选大空斑，若是为了减毒以制备疫苗应挑选小空斑，但每瓶空斑数不得超过20-40个。

试验时，培养瓶应翻转培养，以防止水滴在琼脂面流动，以免各个蚀斑交叉融合，中性红应在蚀斑出现前加入，在暗处孵育，以防止染料抑制病毒和破坏细胞。

对那些生长缓慢的病毒蚀斑，中性红则不是加在最初的覆盖层里，而是加在经过几天培养后的最后一层覆盖层上，可使培养物维持更久，甚至有的中间还得补加营养琼脂覆盖层1-2次。

蚀斑使用的琼脂往往有少量抑制物而影响蚀斑的产生，应将琼脂用单蒸水浸泡过夜，再用单蒸水冲洗2-3次，而后用去离子水冲洗1-2次后，用Hanks液配制成3%浓度，煮沸1h 除菌备用。

有人在试验时补加25mmol的MgCl2或CaCl2及1mmol的半胱氨酸，可加强肠道病毒形成蚀斑。

而MgCl2的加强作用最强。

流感病毒纯化（蔗糖梯度法）概论转头选择密度梯度选用一、概论在密度梯度离心中单一样品组份的分离是借助于混合样品穿过密度梯度层的沉降或上浮来达到的。

梯度液的密度随着离心本经的增大而增加。

密度梯度可以予形成，也可以在离心过程中自形成，经常，密度梯度的可以分为：速率一区带（Rate-30nal）离和等密度（Isopycnic）离心。

病毒空斑实验原理
病毒空斑实验是一种常用的病毒鉴定方法，它通过观察植物叶片上的病毒感染
区域与未感染区域的差异，来确定植物是否感染了某种特定的病毒。

这种方法简单易行，且对于一些病毒的鉴定具有较高的准确性，因此在植物病毒学研究中得到了广泛应用。

病毒空斑实验的原理主要基于病毒感染后对植物叶片的影响。

在实验中，首先
需要选择一种易感染的植物作为实验材料，然后通过接种方式将待检测的植物病毒接种到植物叶片上。

接种后，病毒会在植物叶片内部进行复制和扩散，导致叶片出现病斑或病斑区域的变化。

而在实验的对照组中，同样的植物叶片则不接种病毒，作为未感染的对照。

接下来，通过一系列的观察和分析，可以发现感染了病毒的植物叶片上会出现
病斑，而未感染的对照叶片则不会有这样的变化。

病斑的形态、颜色、大小等特征可以帮助鉴定出感染的病毒种类和数量。

通过比对实验组和对照组的差异，可以准确地确定植物是否感染了目标病毒。

除了观察病斑的形态特征外，还可以利用分子生物学方法对病毒进行进一步的
鉴定。

例如，通过提取病毒RNA或DNA，利用PCR扩增等技术进行特异性检测，可以进一步确认病毒的种类和数量。

这种综合应用观察和分子生物学方法的方式，可以提高病毒鉴定的准确性和灵敏度。

总的来说，病毒空斑实验是一种简单、有效的病毒鉴定方法，通过观察病斑的
形态特征和分子生物学方法的综合应用，可以准确地确定植物是否感染了目标病毒。

在植物病毒学研究中，这种方法对于病毒的鉴定和研究具有重要的意义，也为植物病害的防控提供了重要的技术支持。

3、空斑纯化3.1病毒TCID501）在离心管中用MEM将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-6。

2）将稀释好的病毒接种到96孔培养板中，每一稀释度接种一纵排，共8 孔，每孔接种100µl。

3）在每孔加入细胞悬液100µl，使细胞量达到2~3×105个/ml。

4）设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。

（100µl生长液+100µl细胞悬液）5）逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。

6）结果的计算，按Reed-Muench法。

Reed-Muench法距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数）＝（91.6-50）/（91.6-40）＝0.8lg TCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数=0.8×(-1)+(-3)=-3.8TCID50=10-3.8/0.1ml含义：将该病毒稀释103.8接种100µl可使50%的细胞发生病变。

3.2中性红溶液和DMEM营养琼脂的配制（1）中性红溶液的配制1）取中性红1g、NaCl 8.5g溶于1L超纯水中2）高压灭菌后分装保存于4℃冰箱中。

（2）DMEM营养琼脂的配制1）取2g琼脂糖于100ml超纯水中，微波炉中火2min溶解后摇匀，高压灭菌。

2）取小牛血清4ml、中性红3.3ml无菌操作加到100ml双倍DMEM中，37℃水浴30min，摇晃均匀。

3）溶解的2%琼脂置于44℃水浴30min，与双倍DMEM混合液混合后，置于44℃待用。

3.3铺6六孔板(1) 将已准备好的V ero细胞消化均匀铺于6孔板中。

(2)细胞长成单层后吸去培养液，每孔加2ml无血清维持液置于37℃1h。

(3)将病毒用无血清维持液做10倍递增稀释。

(4)吸去孔内维持液，按合适稀释度每孔滴加200μl稀释好的病毒液, 每个稀释度加两个孔，置37℃吸附1小时后弃病毒液。

问：我准备做病毒空斑实验，不知到怎样配置甲基纤维素覆盖培养液，敬请各位指教答：1、我是这么做的：24孔板VERO，HSV11）24孔板预板2）24h后，弃培养液，用hanks液洗1次3）接种病毒液0.1ml/孔4）放入37度5％CO2培养箱1h，期间每15min慢摇一次，使病毒充分吸附5）加入1％甲基纤维素（1ml/）孔覆盖培养基，放入37度5％CO2培养箱继续培养6）3天后，吸弃培养基7）加入5％甲醛1ml/孔固定4min，弃甲醛，加入结晶紫0.8ml/孔染色20min8）自来水缓缓冲洗染液，计算孔斑数2、我的老师做空斑试验也是用甲基纤维素，不过浓度是2%，配置方法是：甲基纤维素：3克溶于150ml 蒸馏水中，最终浓度为2%；染色用的碘液：25g溶于500ml95%的乙醇中。

最终浓度为5%做出的效果很好。

不过甲基纤维素要提前很长时间配置，大约2周，高压后放入冰箱，使用前无菌操作加入培养液，混匀放入冰箱，过一天后再拿出，使劲摇匀，使纤维素达到一种匀质的状态，静置至起泡完全消失后使用。

染色可以用中性红0.1%（w/v)温箱孵育2-3小时，若是6孔板每孔加1ml;倾倒后即可计数。

问：“1％甲基纤维素（1ml/）孔覆盖培养基，放入37度5％CO2培养箱继续培养”是指把1％甲基纤维素直接加入已放好培养基的孔里，还是甲基纤维素和培养基混好再加入细胞中？配方比例是什么？甲基纤维素要提前很长时间配置，大约2周为什么？什么时候可以计数了？以什么为标准呢？答：1、1％甲基纤维素（1ml/）孔覆盖培养基应是指按1ml/孔的量加甲基纤维素覆盖培养基。

甲基纤维素覆盖培养基应该就是指Viscous medium,它是一种专门培养基。

简单的说就是在普通细胞培养液里面添加了甲基纤维素来提供粘性,甲基纤维素应非营养物质。

因甲基纤维素难溶，所以要先配并灭菌好甲基纤维素溶液。

然后在无菌条件下往其中补加其他培养基所需成分，注意MEM 配的是10×的，这样要加的MEM 溶液体积就少的多。

腺病毒的制备简介：腺病毒(adenovirus)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，基因组长约36kb。

基因组上分布着4个早期转录子（E1、E2、E3、E4）承担调节功能，以及一个晚期转录子负责结构蛋白的编码。

其中，E1的缺失可造成病毒在复制阶段的流产，重组腺病毒必须在293细胞等表达E1蛋白的细胞系中包装；E3为复制非必须区，影响病毒的免疫逃逸，其缺失则可以大大地扩大插入容量。

腺病毒在自然界分布广泛，至少存在100种以上的血清型。

目前的腺病毒载体大多以5型（Ad5）、2型（Ad2）为基础。

腺病毒载体转基因效率高，体外实验通常接近100％的转导效率；可转导不同类型的人组织细胞，不受靶细胞是否为分裂细胞所限，甚至包括来自高度分化的组织中的细胞，例如骨骼肌细胞，肺细胞，神经细胞和心脏细胞；容易制得高滴度病毒载体；进入细胞内并不整合到除卵细胞外的宿主细胞基因组中，仅瞬间表达，安全性高。

腺病毒载体已成为继逆转录病毒载体之后广泛应用且最具前景的病毒载体。

基本概念：RCA：在扩增或制备复制缺陷型腺病毒时会产生复制型腺病毒（replication competent adenoviruses，RCA），RCA是因为重组腺病毒的基因组与293基因组的E1同源序列间发生重组而产生的。

这就导致目的基因丢失而被E1区代替。

具体表现是在本不支持病毒载体复制的细胞株（如A549细胞）上产生病毒的复制和扩增。

实验证明，复制型腺病毒(RCA) 数量随着腺病毒载体在293细胞上的传代次数的增加而增加。

RCA在其宿主细胞中可以自主复制和扩增，因此RCA的产生会严重干扰重组腺病毒载体的使用效果和带来安全隐患。

要避免RCA出现，以下两点非常必要：1）对原始毒种进行1~3轮空斑纯化；2）尽量减少腺病毒在293细胞上的传代次数，建议建立至少两级病毒种子库。

（尤为重要：一旦毒种中发现了RCA，建议重新重组出毒。

）各种常用病毒单位的含义：VP：病毒颗粒（viral particle），是“活”（有感染性）和“死”（无感染性）的腺病毒颗粒的总量。

一、目的测定病毒空斑形成单位（PFU ，plaque forming unit ），可用于病毒滴度测定及标定病毒的感染能力。

本SOP 明确了流感病毒空斑形成单位的标准测定方法，保证实验结果的准确可靠。

二、范围适用于中国国家流感中心的所有技术人员测定流感病毒空斑形成单位。

三、程序（一）生物安全要求H5、H7亚型高致病性禽流感病毒及H2N2亚型流感病毒的操作需要在BSL-3级实验室中进行。

其余流感病毒的操作需要在BSL-2级实验室中进行。

操作人员的生物安全防护要求详见流感中心“生物安全个人防护SOP ”（二）材料1．病毒储存液2．MDCK 细胞和细胞培养液试剂MDCK 细胞：低代数的MDCK 细胞（小于25代），MDCK 细胞培养液：D-MEM +5%胎牛血清+抗生素500mL D-MEM 培养液（Gibco, Cat. #11960-051）5.5mL 青、链霉素母液（10000 U/mL 青霉素G ；10000µg/mL 硫酸链霉素，Gibco, Cat. #15140-122）25.5mL 胎牛血清（Gibco Cat. #16000），0.22µm 过滤器过滤 EDTA-胰酶（Gibco, Cat. #25300-054）3．病毒培养液：DMEM+1%牛血清白蛋白+抗生素，即配即用。

429mL DMEM标准操作规程（SOP ）——实验66mL 7.5%牛血清白蛋白（BSA）5mL 100×抗生素TPCK-胰酶（使用浓度为2mg/mL）4．其他平底24，12或6孔微量培养板红细胞计数器1.6%低熔点琼脂无菌PBS液（pH7.2）中性红溶液（浓度为3.3mg/mL）5．2×DMEM (Gibco,Cat.# 12100-046)（三）实验步骤以六孔细胞板为例：1．第一天，将T75细胞瓶中成片生长的MDCK用EDTA-胰酶消化后计数，（具体方法见MDCK细胞培养SOP及细胞计数SOP）铺6孔MDCK细胞板，细胞浓度5×105/孔。

空斑纯化/计数
1.病毒的稀释与接种
病毒液用冷DMEM 10倍倍比稀释。

待单层MDCK细胞长到90%-100%时，吸弃细胞培养液，用PBS冲洗2次，每孔每次0.1ml。

选择不同稀释倍数的病毒液接种细胞，每孔0.2ml，每个稀释度做3个孔，37℃吸附1h。

2.覆盖琼脂培养液
将含有双抗的DMEM与2%琼脂液等量混合，并加入TPCK-Trypsin，使其终浓度为2ug/ml。

吸弃病毒液后，将覆盖液铺盖于单层细胞表面。

4℃放置10min，待琼脂凝固后，将琼脂层向上，置37℃培养4-5天，并逐日观察。

3.挑斑/染色计数蚀斑
对光观察，出现蚀斑后，对蚀斑做出标记，用枪头将蚀斑连同琼脂一起挑出，溶解于适量PBS，可进一步利用鸡胚或MDCK细胞繁殖病毒。

当蚀斑出现且数量不再增加时，每孔加0.2ml 0.1%中性红染色4h，由于中性红可使活细胞着色，病毒感染灶则形成无色蚀斑。

（也可用1%的结晶紫染色染十几分钟即可）计数时选择蚀斑不融合，分散呈单个，数目在10-30个/孔的细胞孔，分别计算计算各病毒稀释度的蚀斑数，并求3个孔的平均值，按下列公式计算：
感染性病毒量（pfu/ml）=每孔内蚀斑数/每孔接种病毒量×病毒稀释倍数。

四、病毒的培养和纯化
同微生物学其他学科分支一样，病毒学的进步完全得益于
研究方法和技术手段的发展。

通过病毒的分离与纯化获得纯化的、有感染性的病毒制备物
是病毒学研究和实践的基本技术。

1、病毒的培养
病毒的培养：二元培养物法
1、病毒的培养
培养液
细菌培养液变清亮
噬菌体细菌培养物
营养琼脂平板
细菌平板成为残迹平板若是噬菌体标本经过适当稀释再接种细菌平板，
经过一定时间培养，在细菌菌苔上可形成圆形局
部透明区域，即噬斑（plaque）。

如同对细菌计数一样，形成的噬菌斑也可用于对
噬菌体的数目进行估算。

1、病毒的培养
动物病毒实验动物
鸡胚
多种细胞培养
1、病毒的培养
大多数动物病毒感染敏感细胞
培养能引起其显微表现的改变
，即产生致细胞病变效应
（cytopathic effect,CPE），例如
细胞聚集成团、肿大、圆缩、
脱落，细胞融合形成多核细胞，
细胞内出现包涵体（inclusion
body），乃至细胞裂解等。

1、病毒的培养
若标本经过适当稀释进行接
种并辅以染色处理，病毒可
在培养的细胞单层上形成肉
眼可见的局部病损区域，即
蚀斑（plaque）或称空斑。

1、病毒的培养
植物病毒敏感植物叶片产生坏死斑，或称枯斑
四、病毒的培养和纯化
2、病毒纯化
病毒是有感染性的生物体
标准纯化的病毒制备物应保持其感染性病毒具有化学大分子的属性
纯化的病毒制备物的理化性质应具有均一性。

病毒空斑实验原理病毒空斑实验是一种常用的分子生物学技术，用于研究病毒的感染和复制机制。

通过观察病毒在寄主细胞中形成的空斑，可以揭示病毒的传播途径、寄主范围和致病机制。

本文将介绍病毒空斑实验的原理及其应用。

病毒空斑实验的原理主要基于病毒在寄主细胞中的感染和复制过程。

在实验中，病毒颗粒首先侵入寄主细胞，然后利用细胞的生物机制进行复制和扩散。

当病毒感染细胞后，会在细胞内形成一定数量的病毒颗粒，并导致细胞的变化，形成可见的病毒空斑。

通过观察这些病毒空斑的形成和扩散情况，可以了解病毒在细胞内的复制过程和对寄主细胞的影响。

病毒空斑实验通常使用寄主细胞培养物和病毒悬浮液进行。

首先，将寄主细胞培养在培养皿中，形成单层细胞。

然后，在细胞上均匀涂抹病毒悬浮液，使病毒感染细胞。

随着病毒的复制和扩散，细胞表面会出现圆形或不规则形状的病毒空斑。

通过显微镜观察这些病毒空斑的形态和数量变化，可以对病毒的感染和复制过程进行定量和定性的分析。

病毒空斑实验在病毒学研究中具有重要的应用价值。

首先，它可以用于鉴定和鉴定病毒株系。

不同的病毒株系对不同的寄主细胞具有不同的感染能力和复制速度，因此可以通过病毒空斑实验来鉴定和鉴定病毒的株系。

其次，病毒空斑实验可以用于病毒的毒力测定。

通过观察病毒空斑的形成和扩散情况，可以了解病毒对寄主细胞的致病能力和毒力大小。

此外，病毒空斑实验还可以用于研究病毒的传播途径和寄主范围，为病毒防控和治疗提供重要的参考依据。

综上所述，病毒空斑实验是一种重要的病毒学研究方法，通过观察病毒在寄主细胞中形成的空斑，可以揭示病毒的感染和复制机制。

病毒空斑实验的原理简单易懂，应用价值广泛，是病毒学研究中不可或缺的技术手段。

希望本文的介绍能够帮助读者更好地理解病毒空斑实验的原理及其应用，促进病毒学研究的进展和应用。

空斑实验步骤嘿，咱今儿就来说说空斑实验那些事儿！这空斑实验啊，就好像是一场神秘的探索之旅。

首先呢，你得准备好合适的细胞，这就好比是搭建舞台，细胞就是那舞台上的主角呀。

把这些细胞小心翼翼地培养起来，给它们提供一个舒适的“家”。

然后呢，把要研究的病毒稀释到合适的浓度。

这就像是给这场探索之旅准备好独特的“道具”，可不能太浓也不能太稀哦，得恰到好处。

接下来，就把稀释好的病毒液加到细胞上啦。

哎呀，这就像是让“主角”和“道具”相遇，看看会碰撞出什么样的火花。

然后呀，要给它们足够的时间相互作用。

这时候可别急，得耐心等待，就像等待一朵花慢慢开放一样。

等过了一段时间，你就会发现细胞上出现了一些小小的斑点，嘿嘿，这就是空斑啦！就好像是舞台上出现了特别的标记。

这时候，还得仔细地观察和计数这些空斑。

可别小看了这一步，这就像是在数宝藏一样，得认真仔细，一个都不能少。

你想想看，这不就像是在破解一个神秘的密码吗？每一个空斑都可能隐藏着重要的信息。

在整个过程中，每一个环节都得精心呵护，稍有不慎可能就会影响结果哦。

就像走钢丝一样，得稳稳当当的。

而且啊，做这个实验可不能马马虎虎，得像个细心的侦探，不放过任何一个小细节。

不然怎么能发现那些隐藏在细胞和病毒之间的秘密呢？做实验不就像是一场冒险吗？每一次尝试都可能带来新的发现和惊喜。

虽然可能会遇到困难和挫折，但只要坚持下去，总会找到属于自己的“宝藏”。

所以啊，要做好空斑实验，就得有耐心、细心和恒心。

只有这样，才能在这场神秘的探索之旅中满载而归呀！你说是不是呢？。

材料和试剂：DMEM培养基，细胞板，中性红，琼脂糖，PBS或无抗无血培养基，1ml和10ml 移液管等。

操作步骤：1 PK15细胞铺细胞板，细胞密度要较高，才容易形成空斑（但太高了也不好，有可能会形成很多层细胞，导致有的细胞形成病变的地方有其他层的细胞没有坏死也被染色从而无法形成空斑）。

2 过夜后，用无抗无血的培养基清洗洗吧，然后再进行病毒吸附，原液进行10倍倍比稀释，自己可以摸索一下感染稀释度，一般病毒价较低的时候，可以降低稀释度。

看空斑形成情况，要是空斑形成太大，连成片，就得增加稀释度。

3 吸附1-2小时，用无抗无血培养基（或无菌PBS）清洗2-3遍后配制第一次覆盖液。

使用1.6%的琼脂糖（加热至液体状）和两倍DMEM溶液等体积混合，逐滴加到细胞板中。

没孔加入1-2ml覆盖液。

放置于37度培养箱中培养。

4 每天观察细胞病变情况，出现明显病变时进行二次覆盖，覆盖液和第一次差不多，只是要加入细胞染色液中性红（0.1%），一般体积比为10ml：10ml：1ml （可以适当增加一点，如果染色效果不良的话）。

5 染色5H以上应该就可以观察染色情况，理论上伪狂犬病毒应能形成白色空斑而PCV2不会产生空斑。

在不知道PCV2在哪里的情况下，我们随机挑取若干个没有空斑的细胞，而后进行传代。

应该可以得到无伪狂犬污染的PCV2病毒种。

1 蚀斑实验需要细胞长至什么程度可以接毒？显微镜下观察，一般情况下，铺满细胞板底部即可，这样不会造成空洞影响蚀斑观察。

不同的细胞不一样，一般时候是长满T25的细胞传一个六孔板，第二天就接毒。

2 细胞上用什么覆盖物？琼脂？琼脂糖？低熔点琼脂糖？浓度应该是多大？我用的是lonza公司的低熔点琼脂糖，终浓度是0.75%。

感觉不错，就是挺贵的，2k+人民币。

3 如果做挑斑纯化，是不是就不可以染色，染色后对毒力有何影响？不染色就可以看出来，因为培养基本身里面就含有酚红呈现颜色，形成的斑没有颜色，可以直接挑斑；我也染色后挑过，感觉影响不大，可能不同病毒不一样吧。

病毒空斑实验原理
病毒空斑实验是一种常用的分子生物学实验方法，用于研究病
毒的感染机制、复制过程以及宿主细胞对病毒的抵抗能力。

该实验
通过在宿主细胞中引入病毒基因组的部分序列，观察病毒基因组在
宿主细胞中的复制和表达情况，从而揭示病毒与宿主细胞之间的相
互作用关系。

下面将介绍病毒空斑实验的原理及操作步骤。

首先，进行病毒空斑实验需要准备病毒基因组的部分序列，通
常是通过PCR扩增或合成基因片段的方式获取。

这些基因片段可以
是病毒的基因组的一部分，也可以是编码病毒蛋白的基因。

接下来，将这些基因片段与适当的载体连接，构建成重组质粒。

这些重组质
粒可以是质粒载体，也可以是病毒载体。

然后，将构建好的重组质粒转染至宿主细胞中，使其表达病毒
基因组的部分序列。

在转染后的一段时间内，观察宿主细胞的生长
情况，以及病毒基因组的复制和表达情况。

如果病毒基因组的部分
序列对宿主细胞有毒性，那么在转染后的一段时间内，宿主细胞会
出现空斑，即细胞死亡区域。

最后，通过对空斑进行染色或其他适当的检测方法，可以观察
到病毒基因组的复制和表达情况。

通过比较不同条件下空斑的形成情况，可以揭示病毒基因组的复制和表达机制，以及宿主细胞对病毒的抵抗能力。

总之，病毒空斑实验是一种重要的研究病毒感染机制的实验方法，通过该实验可以揭示病毒与宿主细胞之间的相互作用关系，为病毒的防治和治疗提供重要的理论依据。

希望本文介绍的病毒空斑实验原理及操作步骤能够对相关研究工作提供帮助。

猪流行性腹泻病毒(PEDV)纯化分离方案(1) 将已准备好的VERO细胞消化均匀铺于6孔板中。

(2) 细胞长成单层后吸去培养液，将病毒做10倍稀释，共做5个梯度并向每孔滴加0.4ml稀释好的病毒液, 置37℃吸附2小时后弃残液。

(3) 制备2％的琼脂糖（PCR电泳胶一样的琼脂糖），置40－50℃水浴待用。

(4) 将上述琼脂糖和双倍维持液（1:1）混合后，加入培养板各孔，每孔2ml，使冷却凝固成覆盖层。

(5) 把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱培养48h。

(6) 制备含0.002％中性红的2%琼脂糖：双倍维持液（1:1），置40－50℃水浴待用。

(7) 吸取上述琼脂加入培养板各孔，每孔2ml，使冷却凝固成第二覆盖层。

(8) 把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱继续培养，48小时内观察结果。

(9) 挑出蚀斑下的细胞作病毒的进一步增殖和鉴定。

主要问题：1、铺完琼脂糖层之后，24h之后细胞轮廓模糊，不清晰。

48h之后有些孔的细胞基本上看不清了，但是这都不是病毒造成的。

（支原体的存在会不会导致这种情况）2、使用中性红染色在一开始就染色还是等病毒造成一定的噬斑再染色，覆盖一层还是两层琼脂糖层？3、使用的琼脂糖是不是有问题，与琼脂区别大不大？4、之前按照这个方法加了中性红的琼脂糖层之后，细胞着色很不理想。

看不出明显的染色区域，只是有些红色的点点。

5、温度不会出现问题，因为把握的很好，细胞不会被烫死的。

就是不知道自己配制的液会不会由于渗透压的原因导致细胞死亡。

6、一直拿不出照片的原因就是没法看到空斑，板孔中不能显示出一个一个比较像样的噬斑，我挑也是挑病变情况有点不一样的病灶。

7、8、（此文档部分内容来源于网络，如有侵权请告知删除，文档可自行编辑修改内容，供参考，感谢您的配合和支持）9、。

5.1 4%低熔点琼脂糖培养基的配制5.1.1 微波炉加热或者70℃水浴,溶化4%低熔点琼脂(PBS溶解)。

当低熔点琼脂溶化后，将下列物品放入水浴中：空的100ml无菌瓶Sf-900II培养基5.1.2 待低熔点琼脂溶化后，马上将低熔点琼脂、无菌瓶及Sf-900II培养基放入超净台。

5.1.3 将30ml Sf-900II培养基及10ml 4%低熔点琼脂放入100ml无菌瓶中，温和混匀。

5.1.4 准备好后，于40℃保存。

5.2 蚀斑试验5.2.1在转染当天，收获sf9细胞，并准备30ml细胞悬液，调整细胞密度为6×105细胞，于6孔板中每孔铺2ml细胞。

5.2.2 室温放置1hr，让细胞贴壁。

5.2.3 1hr后，用倒置显微镜观察细胞贴壁的状态，汇合度50%细胞贴壁。

5.2.4 在sf-900II SFM中将病毒稀释8个浓度梯度（10-1—10-8）。

取0.2ml病毒放入1.8ml培养基中，稀释为10-1，然后从10-1浓度的病毒中取0.2ml病毒放入1.8ml培养基中，稀释为10-2，依此类推。

5.2.5 将6孔板中的培养基移去，马上加入1ml病毒稀释液。

5.2.6 培养1hr后，马上将40℃水浴的平板培养基放入超净台。

5.2.7 将病毒液取出，马上将2ml的平板培养基放入。

（动作要快，以免培养基凝固）。

5.2.8 室温放置10-20min。

5.2.9 将培养基放于27℃，5%CO2培养箱中培养。

5.2.10 在感染第四天时，用sf-900II SFM培养基配制1mg/ml的中性红溶液，抽滤除菌。

5.2.11 将1.5ml的1mg/ml的中性红溶液加入16.5ml的sf-900II SFM培养基中配制中性红溶液，混匀，然后放入40℃水浴中。

5.2.12 将4%的低熔点琼脂溶解，放入40℃水浴中，5min。

5.2.13取6ml 4%的低熔点琼脂加入中性红溶液中，40℃水浴保存。

5.2.14 迅速将配好的低熔点琼脂中性红溶液，按每孔1ml，加入6孔平板培养基中。