病毒空斑纯化实验protocal

第1篇一、实验目的1. 掌握抗体空斑实验的原理和方法。

2. 了解抗体形成细胞（B淋巴细胞）的功能和特性。

3. 通过抗体空斑实验检测和分析抗体生成细胞的功能。

二、实验原理抗体空斑实验（Plaque Formation Cell Assay, PFC）是一种体外检测单个抗体形成细胞（B淋巴细胞）的方法。

其原理是将绵羊红细胞（SRBC）免疫家兔或小鼠，然后提取家兔淋巴结或小鼠脾细胞制成细胞悬液。

将细胞悬液与一定量的SRBC混合，在补体的参与下，抗体形成细胞会释放出溶血素，导致周围的SRBC溶解，形成肉眼可见的溶血空斑。

每个空斑代表一个抗体形成细胞，空斑的数量和大小可以反映抗体生成细胞的功能和特性。

三、实验材料与试剂1. 材料：- 家兔或小鼠- 绵羊红细胞（SRBC）- 家兔淋巴结或小鼠脾细胞- 平皿、离心机、显微镜、温箱、水浴箱等2. 试剂：- Hanks液（含Ca2+、Mg2+）- PBS（含Ca2+、Mg2+）- 底层琼脂（1.4%）- 表层琼脂（0.7%）- 补体（新鲜豚鼠血清）- 小牛血清（56℃灭活30min）四、实验步骤1. 免疫动物：将绵羊红细胞免疫家兔或小鼠，使其产生抗体。

2. 制备细胞悬液：取出家兔淋巴结或小鼠脾细胞，制成细胞悬液。

3. 准备琼脂平板：将底层琼脂加入Hanks液，融化后倒入平皿中，待凝固。

4. 混合细胞悬液：将细胞悬液与SRBC混合，加入适量的补体。

5. 倒平板：将混合液倒入平皿中的底层琼脂上，待凝固。

6. 覆盖表层琼脂：将表层琼脂加入Hanks液，融化后倒入平皿中，待凝固。

7. 温育：将平皿放入温箱中，37℃温育24-48小时。

8. 观察：用显微镜观察溶血空斑的形成情况。

五、实验结果与分析1. 实验结果：- 观察到平皿中形成了多个溶血空斑，每个空斑大小不一。

- 空斑数量较多，说明抗体生成细胞的功能较强。

2. 结果分析：- 溶血空斑的形成表明实验动物产生了抗体。

- 空斑数量和大小反映了抗体生成细胞的功能和特性。

病毒空斑纯化病毒蚀斑如同噬菌体的噬斑，一个蚀斑为一个病毒体的繁殖后代品系。

在细胞培养中做蚀斑是一种较精确的测定病毒感染的方法，将病毒各稀释度种入单层细胞瓶，吸附1h，在单层细胞上覆以营养琼脂培养基，病毒在细胞中繁殖使细胞死亡。

但由于琼脂的限制只能感染临近的细胞，形成“蚀斑”的退化细胞区，经中性红活细胞染料着色后，活细胞显红色，而蚀斑区细胞已退化步着色，形成不染色区域。

凡是能在细胞培养物中产生CPE的病毒都可以采用蚀斑技术来分离和测定。

蚀斑技术在测定病毒感染时是很好的定量方法，也是测定干扰素和抗体中和病毒繁殖能力的一种非常敏感的方法。

此外还可以用来纯化病毒，纯化时挑选合适的空斑进行传代即可。

若目的是要提高病毒能力，应选大空斑，若是为了减毒以制备疫苗应挑选小空斑，但每瓶空斑数不得超过20-40个。

试验时，培养瓶应翻转培养，以防止水滴在琼脂面流动，以免各个蚀斑交叉融合，中性红应在蚀斑出现前加入，在暗处孵育，以防止染料抑制病毒和破坏细胞。

对那些生长缓慢的病毒蚀斑，中性红则不是加在最初的覆盖层里，而是加在经过几天培养后的最后一层覆盖层上，可使培养物维持更久，甚至有的中间还得补加营养琼脂覆盖层1-2次。

蚀斑使用的琼脂往往有少量抑制物而影响蚀斑的产生，应将琼脂用单蒸水浸泡过夜，再用单蒸水冲洗2-3次，而后用去离子水冲洗1-2次后，用Hanks液配制成3%浓度，煮沸1h 除菌备用。

有人在试验时补加25mmol的MgCl2或CaCl2及1mmol的半胱氨酸，可加强肠道病毒形成蚀斑。

而MgCl2的加强作用最强。

流感病毒纯化（蔗糖梯度法）概论转头选择密度梯度选用一、概论在密度梯度离心中单一样品组份的分离是借助于混合样品穿过密度梯度层的沉降或上浮来达到的。

梯度液的密度随着离心本经的增大而增加。

密度梯度可以予形成，也可以在离心过程中自形成，经常，密度梯度的可以分为：速率一区带（Rate-30nal）离和等密度（Isopycnic）离心。

病毒空斑实验原理
病毒空斑实验是一种常用的病毒鉴定方法，它通过观察植物叶片上的病毒感染
区域与未感染区域的差异，来确定植物是否感染了某种特定的病毒。

这种方法简单易行，且对于一些病毒的鉴定具有较高的准确性，因此在植物病毒学研究中得到了广泛应用。

病毒空斑实验的原理主要基于病毒感染后对植物叶片的影响。

在实验中，首先
需要选择一种易感染的植物作为实验材料，然后通过接种方式将待检测的植物病毒接种到植物叶片上。

接种后，病毒会在植物叶片内部进行复制和扩散，导致叶片出现病斑或病斑区域的变化。

而在实验的对照组中，同样的植物叶片则不接种病毒，作为未感染的对照。

接下来，通过一系列的观察和分析，可以发现感染了病毒的植物叶片上会出现
病斑，而未感染的对照叶片则不会有这样的变化。

病斑的形态、颜色、大小等特征可以帮助鉴定出感染的病毒种类和数量。

通过比对实验组和对照组的差异，可以准确地确定植物是否感染了目标病毒。

除了观察病斑的形态特征外，还可以利用分子生物学方法对病毒进行进一步的
鉴定。

例如，通过提取病毒RNA或DNA，利用PCR扩增等技术进行特异性检测，可以进一步确认病毒的种类和数量。

这种综合应用观察和分子生物学方法的方式，可以提高病毒鉴定的准确性和灵敏度。

总的来说，病毒空斑实验是一种简单、有效的病毒鉴定方法，通过观察病斑的
形态特征和分子生物学方法的综合应用，可以准确地确定植物是否感染了目标病毒。

在植物病毒学研究中，这种方法对于病毒的鉴定和研究具有重要的意义，也为植物病害的防控提供了重要的技术支持。

3、空斑纯化3.1病毒TCID501）在离心管中用MEM将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-6。

2）将稀释好的病毒接种到96孔培养板中，每一稀释度接种一纵排，共8 孔，每孔接种100µl。

3）在每孔加入细胞悬液100µl，使细胞量达到2~3×105个/ml。

4）设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。

（100µl生长液+100µl细胞悬液）5）逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。

6）结果的计算，按Reed-Muench法。

Reed-Muench法距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数）＝（91.6-50）/（91.6-40）＝0.8lg TCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数=0.8×(-1)+(-3)=-3.8TCID50=10-3.8/0.1ml含义：将该病毒稀释103.8接种100µl可使50%的细胞发生病变。

3.2中性红溶液和DMEM营养琼脂的配制（1）中性红溶液的配制1）取中性红1g、NaCl 8.5g溶于1L超纯水中2）高压灭菌后分装保存于4℃冰箱中。

（2）DMEM营养琼脂的配制1）取2g琼脂糖于100ml超纯水中，微波炉中火2min溶解后摇匀，高压灭菌。

2）取小牛血清4ml、中性红3.3ml无菌操作加到100ml双倍DMEM中，37℃水浴30min，摇晃均匀。

3）溶解的2%琼脂置于44℃水浴30min，与双倍DMEM混合液混合后，置于44℃待用。

3.3铺6六孔板(1) 将已准备好的V ero细胞消化均匀铺于6孔板中。

(2)细胞长成单层后吸去培养液，每孔加2ml无血清维持液置于37℃1h。

(3)将病毒用无血清维持液做10倍递增稀释。

(4)吸去孔内维持液，按合适稀释度每孔滴加200μl稀释好的病毒液, 每个稀释度加两个孔，置37℃吸附1小时后弃病毒液。

问：我准备做病毒空斑实验，不知到怎样配置甲基纤维素覆盖培养液，敬请各位指教答：1、我是这么做的：24孔板VERO，HSV11）24孔板预板2）24h后，弃培养液，用hanks液洗1次3）接种病毒液0.1ml/孔4）放入37度5％CO2培养箱1h，期间每15min慢摇一次，使病毒充分吸附5）加入1％甲基纤维素（1ml/）孔覆盖培养基，放入37度5％CO2培养箱继续培养6）3天后，吸弃培养基7）加入5％甲醛1ml/孔固定4min，弃甲醛，加入结晶紫0.8ml/孔染色20min8）自来水缓缓冲洗染液，计算孔斑数2、我的老师做空斑试验也是用甲基纤维素，不过浓度是2%，配置方法是：甲基纤维素：3克溶于150ml 蒸馏水中，最终浓度为2%；染色用的碘液：25g溶于500ml95%的乙醇中。

最终浓度为5%做出的效果很好。

不过甲基纤维素要提前很长时间配置，大约2周，高压后放入冰箱，使用前无菌操作加入培养液，混匀放入冰箱，过一天后再拿出，使劲摇匀，使纤维素达到一种匀质的状态，静置至起泡完全消失后使用。

染色可以用中性红0.1%（w/v)温箱孵育2-3小时，若是6孔板每孔加1ml;倾倒后即可计数。

问：“1％甲基纤维素（1ml/）孔覆盖培养基，放入37度5％CO2培养箱继续培养”是指把1％甲基纤维素直接加入已放好培养基的孔里，还是甲基纤维素和培养基混好再加入细胞中？配方比例是什么？甲基纤维素要提前很长时间配置，大约2周为什么？什么时候可以计数了？以什么为标准呢？答：1、1％甲基纤维素（1ml/）孔覆盖培养基应是指按1ml/孔的量加甲基纤维素覆盖培养基。

甲基纤维素覆盖培养基应该就是指Viscous medium,它是一种专门培养基。

简单的说就是在普通细胞培养液里面添加了甲基纤维素来提供粘性,甲基纤维素应非营养物质。

因甲基纤维素难溶，所以要先配并灭菌好甲基纤维素溶液。

然后在无菌条件下往其中补加其他培养基所需成分，注意MEM 配的是10×的，这样要加的MEM 溶液体积就少的多。

腺病毒的制备简介：腺病毒(adenovirus)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，基因组长约36kb。

基因组上分布着4个早期转录子（E1、E2、E3、E4）承担调节功能，以及一个晚期转录子负责结构蛋白的编码。

其中，E1的缺失可造成病毒在复制阶段的流产，重组腺病毒必须在293细胞等表达E1蛋白的细胞系中包装；E3为复制非必须区，影响病毒的免疫逃逸，其缺失则可以大大地扩大插入容量。

腺病毒在自然界分布广泛，至少存在100种以上的血清型。

目前的腺病毒载体大多以5型（Ad5）、2型（Ad2）为基础。

腺病毒载体转基因效率高，体外实验通常接近100％的转导效率；可转导不同类型的人组织细胞，不受靶细胞是否为分裂细胞所限，甚至包括来自高度分化的组织中的细胞，例如骨骼肌细胞，肺细胞，神经细胞和心脏细胞；容易制得高滴度病毒载体；进入细胞内并不整合到除卵细胞外的宿主细胞基因组中，仅瞬间表达，安全性高。

腺病毒载体已成为继逆转录病毒载体之后广泛应用且最具前景的病毒载体。

基本概念：RCA：在扩增或制备复制缺陷型腺病毒时会产生复制型腺病毒（replication competent adenoviruses，RCA），RCA是因为重组腺病毒的基因组与293基因组的E1同源序列间发生重组而产生的。

这就导致目的基因丢失而被E1区代替。

具体表现是在本不支持病毒载体复制的细胞株（如A549细胞）上产生病毒的复制和扩增。

实验证明，复制型腺病毒(RCA) 数量随着腺病毒载体在293细胞上的传代次数的增加而增加。

RCA在其宿主细胞中可以自主复制和扩增，因此RCA的产生会严重干扰重组腺病毒载体的使用效果和带来安全隐患。

要避免RCA出现，以下两点非常必要：1）对原始毒种进行1~3轮空斑纯化；2）尽量减少腺病毒在293细胞上的传代次数，建议建立至少两级病毒种子库。

（尤为重要：一旦毒种中发现了RCA，建议重新重组出毒。

）各种常用病毒单位的含义：VP：病毒颗粒（viral particle），是“活”（有感染性）和“死”（无感染性）的腺病毒颗粒的总量。

一、目的测定病毒空斑形成单位（PFU ，plaque forming unit ），可用于病毒滴度测定及标定病毒的感染能力。

本SOP 明确了流感病毒空斑形成单位的标准测定方法，保证实验结果的准确可靠。

二、范围适用于中国国家流感中心的所有技术人员测定流感病毒空斑形成单位。

三、程序（一）生物安全要求H5、H7亚型高致病性禽流感病毒及H2N2亚型流感病毒的操作需要在BSL-3级实验室中进行。

其余流感病毒的操作需要在BSL-2级实验室中进行。

操作人员的生物安全防护要求详见流感中心“生物安全个人防护SOP ”（二）材料1．病毒储存液2．MDCK 细胞和细胞培养液试剂MDCK 细胞：低代数的MDCK 细胞（小于25代），MDCK 细胞培养液：D-MEM +5%胎牛血清+抗生素500mL D-MEM 培养液（Gibco, Cat. #11960-051）5.5mL 青、链霉素母液（10000 U/mL 青霉素G ；10000µg/mL 硫酸链霉素，Gibco, Cat. #15140-122）25.5mL 胎牛血清（Gibco Cat. #16000），0.22µm 过滤器过滤 EDTA-胰酶（Gibco, Cat. #25300-054）3．病毒培养液：DMEM+1%牛血清白蛋白+抗生素，即配即用。

429mL DMEM标准操作规程（SOP ）——实验66mL 7.5%牛血清白蛋白（BSA）5mL 100×抗生素TPCK-胰酶（使用浓度为2mg/mL）4．其他平底24，12或6孔微量培养板红细胞计数器1.6%低熔点琼脂无菌PBS液（pH7.2）中性红溶液（浓度为3.3mg/mL）5．2×DMEM (Gibco,Cat.# 12100-046)（三）实验步骤以六孔细胞板为例：1．第一天，将T75细胞瓶中成片生长的MDCK用EDTA-胰酶消化后计数，（具体方法见MDCK细胞培养SOP及细胞计数SOP）铺6孔MDCK细胞板，细胞浓度5×105/孔。