病毒的浓缩和纯化

现代病毒研究往往需要大量的纯病毒粒子，以便于化学研究或制备抗体。

在这里我们简明地描述一下脊髓灰质炎病毒（Polio virus）的纯化步骤。

它是一种已被广泛研究的危害人体健康的病毒。

在开展人体病毒实验工作以前，让实验工作人员获得抵抗这种病毒的免疫力是非常必要的。

脊髓灰质炎病毒疫苗很容易获得，大多数工作人员可能已经获得免疫，但重新免疫是必要的预防措施。

病毒的纯化步骤主要是：1.在大规模的装置中培养病毒；2.去除富含病毒培养液；3.通过沉淀将病毒浓缩；4.通过密度梯度离心最终纯化病毒。

现在我们讲解每个步骤的一些细节。

1.在大型装置中培养细菌。

为获得足够的用于化学研究的病毒，必须制备大量病毒。

每种病毒的培养都有不同的步骤。

脊髓灰质炎病毒是在人或灵长类动物细胞系中培养的，可以培养在一大瓶中沿壁生长的单层细胞上，也可以在一个轻轻搅拌的细胞悬液中。

在有利病毒生长的条件下，每个宿主细胞能生产10～1000的感染单位的病毒，即每毫升一个感染单位的滴度（或称效价）。

2.富含病毒培养液的去除。

病毒的生长和释放伴随着细胞的破损。

在病毒复制完成的时候，培养液中大多数细胞已经变成了细胞碎片。

为使所有病毒分子完全释放，要通过反复冷冻—融化的循环过程使细胞进一步破碎。

然后将富含病毒的液体从培养瓶转移到离心试管中。

低速离心除去大分子的细胞残骸。

3.通过沉淀将病毒物质浓缩。

由于病毒是蛋白质性质的，它们能通过蛋白质沉淀法沉淀。

脊髓灰质炎病毒可通过高浓度的NH4Cl（每毫升培养液中加0.4g）沉淀下来。

这一过程要在低温下进行，NH4Cl要在搅拌下缓慢加到培养液中。

由于病毒蛋白沉降，溶液将变得浑浊。

将沉淀物通过低速离心（2000g，1-2hr）。

然后将含有病毒分子的沉淀物在少量磷酸盐缓冲液中再次悬浮培养。

这一步骤可浓缩病毒大约10倍，99％以上的病毒粒子可沉淀回收。

4.通过密度梯度离心最终纯化病毒。

脊髓灰质炎病毒可以通过蔗糖或CSCl的密度梯度离心纯化。

灭活疫苗的的生产工艺过程
灭活疫苗的生产工艺过程通常包括以下几个步骤：
1. 病毒培养：首先，科学家们需要大量培养目标病毒株。

病毒通常在细胞培养基中培养，并提供营养物质以促进其繁殖。

培养时间和条件会因不同的病毒而有所不同。

2. 病毒灭活：培养的病毒需要被灭活，以防止在接种过程中引发疾病。

病毒可以通过热处理、化学处理或辐射等方法进行灭活。

灭活后的病毒仍能保留其免疫原性，但不再有致病能力。

3. 病毒纯化：接下来，灭活的病毒需要经过纯化过程，以去除其他细胞残渣和杂质。

纯化常常包括离心、滤过和超速离心等步骤，以分离病毒颗粒。

4. 抗原浓缩：疫苗中的病毒抗原需要进行浓缩，以提高疫苗的效力。

这一步骤可以通过离心、滤过或柱层析等技术实现。

5. 疫苗制剂：浓缩的病毒抗原需要与适当的辅助物质（如佐剂）混合，以增强免疫反应。

这些辅助物质通常包括佐剂、防腐剂和稳定剂等，以保护病毒抗原不受破坏。

6. 疫苗填充和包装：最后，疫苗需要被装入适当的容器中，如玻璃瓶或注射器。

疫苗容器需要经过严格的无菌处理，以确保疫苗不受细菌或其他微生物的污染。

需要注意的是，不同类型的灭活疫苗在生产工艺上可能会有所差异。

灭活疫苗的生产需要严格遵循相关的质量管理体系和生物安全规定，确保疫苗的质量和安全性。

病毒纯化浓缩方法方法一超速离心沉淀法1 仪器超速离心机(BECKMAN OPTIMAL-80XP) 50000~80000rpm相对离心力最大可达510000×g；高速冷冻离心机(BECKMAN AVANTIJ-26XP)20000~25000rpm 最大离心力为89000×g；超速离心管 (Beckman 344058)，Ultra-clear SW28离心管2 方法步骤（1）转染后44-48小时，收集上清液到50ml离心管内，并加入20ml Production 培养基以便第二轮病毒的收集。

将收集的上清液4℃，4000g离心10分钟，去除细胞碎片，然后0.45 μm滤膜过滤到40ml超速离心管中。

（2）取6个Beckman超速离心管，70%乙醇清洗后在生物安全柜中风干并紫外消毒30min。

（3）每个Ultra-clear SW28管加入30ml 预先处理过滤过的病毒上清。

（4）取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液(PBS配制)。

将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml，形成一个蔗糖垫。

同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。

另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。

（5）务必确定离心管没有裂缝且用PBS调整各管重量使两两平衡。

（6）4℃离心，25000rpm （82700g）2 h。

（7）离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀。

管底可见少量的半透明或白色沉淀。

将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip头吸去管壁上多余的液体。

（8）每管中加入100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀。

（9）将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。

（10）在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。

（11）4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。

（12）用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。

病毒纯化述职报告尊敬的领导：我担任病毒纯化工作岗位已有一段时间，现将纯化工作的情况向您进行汇报。

一、工作目标根据病毒纯化的要求，以确保纯化获得高纯度、高活性的病毒制备为目标，提供满足临床需求的病毒产品。

二、工作内容1. 病毒感染与扩增：根据病毒特性进行感染与扩增，采取适当的培养条件，确保病毒大规模生产的需求。

2. 细胞破碎与离心：选用合适的方法对细胞进行破碎，迅速释放病毒颗粒。

随后，利用超速离心将细胞碎片、异物与未裂解的细胞沉淀进行分离。

3. 进行净化：通过离心操作将游离的病毒颗粒沉淀，去除大量的冗余杂质。

4. 透析与浓缩：利用适当筛选膜进行透析，除去较小分子量的杂质，并浓缩病毒制备。

5. 病毒纯化：利用离心、层析等方法，将病毒与其他蛋白质、核酸等杂质进行分离，达到高纯度的病毒制备。

三、工作成果1. 根据项目需要，成功纯化多个病毒株，包括XXX病毒、XXX病毒等，制备了高纯度的病毒样品。

2. 使用电镜观察，确认所纯化的病毒制备具有完整的病毒颗粒形态特征，无明显杂质。

3. 经过生物学测定，所制备的病毒样品具有较高的活性，表现出良好的感染性。

四、存在问题与思考1. 在病毒纯化过程中，有时难以完全去除所有的杂质，需要进一步改进纯化方案，提高纯度。

2. 部分病毒株在纯化过程中容易失活，需要根据其特性进行针对性优化，确保制备的活性病毒样品质量。

3. 针对特定需求的病毒纯化工作，应进行方案设计与技术咨询，以确保工作的顺利进行。

在今后的工作中，我将更加严格地按照病毒纯化的流程要求进行操作，提高病毒制备的纯度和活性，为临床应用提供优质的病毒产品。

同时，我也会不断学习和更新相关的病毒纯化技术，以适应不同病毒株的纯化工作。

谢谢您对我的支持和关注！此致敬礼！。

病毒纯化浓缩办法之羊若含玉创作办法一超速离心沉淀法1 仪器超速离心机(BECKMAN OPTIMAL-80XP) 50000~80000rpm相对离心力最大可达510000×g；高速冷冻离心机(BECKMAN A V ANTIJ-26XP)20000~25000rpm 最大离心力为89000×g；超速离心管 (Beckman 344058)，Ultra-clear SW28离心管2 办法步调（1）转染后44-48小时，收集上清液到50ml离心管内，并参加20ml Production造就基以便第二轮病毒的收集.将收集的上清液4℃，4000g离心10分钟，去除细胞碎片，然后0.45 μm滤膜过滤到40ml超速离心管中.（2）取6个Beckman超速离心管，70%乙醇清洗后在生物平安柜中风干并紫外消毒30min.（3）每个Ultra-clear SW28管参加30ml 预先处理过滤过的病毒上清.（4）取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液(PBS 配制).将移液管一直拔出到离心管的底部，迟缓将蔗糖溶液打出4 ml，形成一个蔗糖垫.同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分离参加到另两个离心管中.另取一支清洁的移液管，对剩下3管进行同样处理.（5）务必确定离心管没有裂痕且用PBS调剂各管重量使两两平衡.（6）4℃离心，25000rpm （82700g）2 h.（7）离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀.管底可见少量的半透明或白色沉淀. 将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip头吸去管壁上过剩的液体.（8）每管中参加100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀.（9）将SW28超速离心管拔出到50ml锥底离心管中，盖上盖子.（10）在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡.（11）4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底.（12）用200μl移液器轻柔吹打使沉淀重悬.防止产生泡沫.将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中，分装50ul/管，保管于成品管中，用碎干冰速冻后储存在-80℃冻存.办法二 PEG-8000浓缩法(1)5X PEG8000+NaCl配制称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭尽 30min；保管在4℃.(2)使用0.45μm滤头过滤慢病毒上清液；(3)每30ml过滤后的病毒初始液，参加5X PEG-8000+NaCl母液7.5 ml；(4)每20～30min混杂一次，共进行3-5次；(5)4度放置留宿；(6)4度，4000 g，离心 20min；(7)吸弃上清，静置管子1～2分钟，吸走残存液体；(8)参加适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；(9)集中后的病毒悬液分装成50 μl每份，保管在成品管中.用碎干冰速冻后储存在-80 ℃办法三慢病毒纯化浓缩试剂盒1.每10ml过滤后的病毒初始液，参加Concen Solution 3ml，每20-30min混杂一次，共进行3-5次.2.2. 4℃放置留宿.3. 4℃，3000 g，离心45min.4. 去失落上清，静置管子1-2min，吸走残存液体.5. 参加无血清DEME充分溶解慢病毒沉淀.6. 病毒悬液分装成200μl每份,保管在离心管中，速冻后储存在-80 ℃.。

病毒纯化浓缩方法方法一超速离心沉淀法1 仪器超速离心机(BECKMANOPTIMAL-80XP) 50000~80000rpm相对离心力最大可达510000X g；高速冷冻离心机(BECKMAN AVANTIJ-26XP)20000~25000rpm最大离心力为89000X g；超速离心管(Beckman 344058), Ultra-clear SW28离心管2 方法步骤(1)转染后44-48 小时，收集上清液到50ml 离心管内，并加入20ml Production培养基以便第二轮病毒的收集。

将收集的上清液4C, 4000g 离心10分钟，去除细胞碎片，然后0.45卩m滤膜过滤到40ml超速离心管中。

(2)取6个Beckman超速离心管，70聽醇清洗后在生物安全柜中风干并紫外消毒30min。

(3)每个Ultra-clear SW28I加入30ml预先处理过滤过的病毒上清。

(4)取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%勺蔗糖溶液(PBS配制)。

将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml，形成一个蔗糖垫。

同样地，将剩下8 ml 的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。

另取一支干净的移液管，对剩下3 管进行同样处理。

(5)务必确定离心管没有裂缝且用PBS调整各管重量使两两平衡。

(6)4C离心，25000rpm (82700g) 2 h。

(7)离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀。

管底可见少量的半透明或白色沉淀。

将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip 头吸去管壁上多余的液体。

(8)每管中加入100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀。

(9)将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。

(10)在4C溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。

(11)4C, 500g离心1分钟，使溶液集中于管底。

(12)用200卩l移液器轻柔吹打使沉淀重悬。

避免产生泡沫。

(10)申请公布号 (43)申请公布日 2014.07.16C N 103923883A (21)申请号 201310015169.X(22)申请日 2013.01.16C12N 7/00(2006.01)C12N 7/02(2006.01)(71)申请人辽宁成大生物股份有限公司地址110179 辽宁省沈阳市浑南新区新放街1号(72)发明人周荔葆 殷建文 焦龙 吴栩涛甄祖刚 赵新(74)专利代理机构沈阳亚泰专利商标代理有限公司 21107代理人韩辉(54)发明名称一种流感病毒的浓缩、纯化方法(57)摘要本发明涉及一种流感病毒的浓缩、纯化方法，其特征在于：（1）应用0.8～0.65um 的滤芯进行澄清；（2）750KD 的中空纤维超滤浓缩；（3）Sepharose4FF 层析纯化技术进行纯化。

本发明采用0.65um 的膜对流感病毒液进行澄清，采用中空纤维750k 超滤膜进行浓缩，分子筛层析技术进行纯化彻底解决了目标蛋白纯度低，杂蛋白高、DNA残留量高、抗原回收率低的问题。

对于提供疫苗质量，降低副反应提供了很好的技术手段，有利于生产出高品质、安全性好的高质量疫苗。

(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书3页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书3页(10)申请公布号CN 103923883 A1/1页1.一种流感病毒的浓缩、纯化方法，其特征在于有以下步骤：（1）应用0.8～0.65um 的滤芯进行澄清；（2）750KD 的中空纤维超滤浓缩；（3）Sepharose 4FF 层析纯化技术进行纯化。

2.根据权利要求1所述的流感病毒的浓缩、纯化方法，其特征在于：步骤（1）应用0.8～0.65um 的滤芯进行澄清是指：首先用L-15液体平衡滤芯，之后对病毒液进行澄清。

3.根据权利要求1所述的流感病毒的浓缩、纯化方法，其特征在于：步骤（2）750KD 的中空纤维超滤浓缩是指：应用0.5N NaOH 对750KD 的中空纤维超滤浓缩设备进行在线消毒清洗，用L-15液体平衡设备，浓缩20～30倍数，之后用L －15冲洗设备,定容到预订体积，超滤浓缩结束后，应用0.5N NaOH 对超滤设备进行在线清洗，清洗后应用0.1N NaOH 保存。

慢病毒的浓缩与纯化——PEG-8000浓缩法
实验试剂
1. NaCl
2. PEG8000
实验设备
1. 高压灭菌锅
2. 0.45μm滤头
3. 高速离心机
4. 低温冰箱
实验步骤
1. 5X PEG8000 NaCl配制称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃。

2. 使用0.45μm滤头过滤慢病毒上清液；
3. 每30ml过滤后的病毒初始液，加入5X PEG-8000 NaCl母液7.5 ml；
4. 每20～30min混合一次，共进行3-5次；
5. 4度放置过夜；
6. 4度，4000 g，离心 20min；
7. 吸弃上清，静置管子1～2分钟，吸走残余液体；
8. 加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；
9. 集中后的病毒悬液分装成50 μl每份，保存在成品管中。

用碎干冰速冻后储存在-80 ℃。

（学习的目的是增长知识，提高能力，相信一分耕耘一分收获，努力就一定可以获得应有的回报）。

慢病毒纯化
慢病毒纯化是指从慢病毒病毒培养物中分离和纯化出慢病毒颗粒的过程。

这个过程通常包括以下步骤：
1.细胞培养：首先，需要将慢病毒所感染的细胞系培养到适
当的细胞密度和病毒扩增时间，以确保足够的病毒产量。

2.细胞裂解：将培养的细胞收集并经过离心等方法分离，然
后使用裂解缓冲液裂解细胞，释放出细胞内的慢病毒。

3.离心和过滤：经过细胞裂解后，样品需要进行离心，以去
除细胞碎片和核酸残余物。

然后，可以使用过滤器对澄清
的上清液进行过滤以去除大颗粒物质。

4.病毒浓缩：慢病毒通常是低浓度的，因此需要进行浓缩。

可以使用超滤、离心和沉淀等方法，将病毒颗粒从大量液
体中浓缩到较小的容量中。

5.梯度离心：为了进一步纯化病毒，可以使用梯度离心技术，
如葡聚糖梯度离心或离心浓缩。

这个过程可将纯化的病毒
与细胞碎片、蛋白质和其他污染物分离开来。

6.病毒沉淀：经过梯度离心后，可以进行病毒的最终沉淀。

使用离心来将病毒沉淀到盘底或在离心管底端形成浓缩的
沉淀。

7.再悬浮：将病毒沉淀用缓冲液再悬浮，以便进行后续实验
应用。

在整个慢病毒纯化的过程中，必须遵守基本的生物安全措施，
并使用无菌操作、合适的缓冲液和处理设备。

每一步之间的温度、离心速度和离心时间等参数也需要根据具体的实验条件和病毒类型进行优化和调整。