病毒空斑纯化实验protocal

病毒的分离纯化
我设计了一套方案，请大家批评指正：
1. 新鲜病叶200g，-70℃冰冻30分钟，以2倍体积0.2mol/L磷酸缓冲液（PH7.5，含0.1%巯基乙醇,2%TritionX-100,0.01mol/LEDTA）。

组织捣碎机捣碎，双层纱布过滤。

2. 滤液中加入等体积的氯仿，冰浴激烈搅拌15分钟，充分乳化后2000 g离心15分钟
3. 上清液中加入6%聚乙二醇-6000，3%Nacl,0.5%TritionX-100（W/V）。

冰浴搅拌，4℃下过夜，次日取出10000g离心20分钟。

4. 沉淀悬浮于0.02mol/L磷酸缓冲液（PH7.2，2%TritionX-100, 0.1%巯基乙醇，1mol/L尿素），2小时后，2000g离心10分钟。

5. 上清液中加入6%聚乙二醇-6000，3%Nacl,0.5%TritionX-100（W/V）。

冰浴搅拌4小时，10000g离心30分钟。

6. 沉淀悬浮于0.02mol/L磷酸缓冲液（PH
7.2，2%TritionX-100,0.01mol/LEDTA，1mol/L尿素），4℃下4小时后，10000g离心10分钟。

7. 上清用10%～40%蔗糖密度梯度离心(30000r/min,1.5h)，收集病毒带，用0.02mol/L磷酸缓冲液（PH7.2，2%TritionX-100, 0.1%巯基乙醇，1mol/L尿素）稀释，123000g离心2小时。

8.沉淀用0.02mol/L磷酸缓冲液（PH7.2，2%TritionX-100, 0.1%巯基乙醇，1mol/L尿素）悬浮，5000g离心15分钟，上清即为提纯病毒制品。

lf_12345。

M13噬菌体空斑实验一、实验目的：1、了解M13噬菌体载体的一般结构、性质及感染特征。

2、学习并掌握M13噬菌体载体的空斑纯化技术。

二、实验原理：一个M13噬菌体的病毒颗粒感染一个细菌后形成一个噬菌斑。

从感染细菌释放出来的子代病毒颗粒感染临近细菌，后者又可释放下一代病毒颗粒；如果细菌在半固体培养基上生长，自带病毒颗粒的扩散受到一定限制，诸如M13等丝状噬菌体并不裂解细菌，但可以使细菌生长速度降低至原来的1/2，在上层琼脂中生长的菌台的背景下，生长缓慢细菌形成了一个不断扩大到肉眼可见的噬菌斑。

三、材料与试剂：1、M13噬菌体2、ER2738菌种3、LB培养基四、实验步骤1.1、取5ml LB液体培养基于10ml的试管中，加入5ul 四环素（20mg/ml），将大肠杆菌接入，37℃震荡（80-100rpm）培养过夜（12h）2.将2ml的ER2738培养液转入20ml的LB培养基中（1:10稀释），继续37℃震荡（80-100rpm）培养4.5h（不宜过快，否则，细菌性毛被破坏，噬菌体无法导入），即成为感受态细胞3.培养细菌时将水浴锅打开，43℃预热，并将LB 平板置于37℃预热备用4.用装有LB培养基的EP管10倍稀释噬菌体，理想的稀释范围：扩增过的噬菌体108-1010倍稀释，未扩增过的104-105倍稀释5.将顶层琼脂用微波炉或者电磁炉沸水融化，置于水浴锅中保温待用6.当大肠杆菌达到对数成长期，取大肠杆菌ER2738感受态细胞200ul于EP管中7.加入10ul-100 ul（或者一定体积）一定稀释度的噬菌体溶液，快速混合，室温孵育1-5min8.将感染过的大肠杆菌的培养液倒入43℃顶层琼脂中，用vortex迅速混匀，立刻在预热的LB培养基上倒平板，迅速摇晃平板使顶层琼脂均匀展开并铺满表面9.室温静置5min左右使平板冷却凝固，将培养皿倒置37℃培养过夜10.第二天观察平板，对培养皿中的噬菌斑进行计数，计算约含有10-100个数量级的平板噬菌斑的具体数目（y），计算噬菌体效价（pfu/ml）噬菌体效价=y*10x+2puf/ml分子生物学作业1、什么是细菌的转化？2、在哪些生物中，RNA是唯一的遗传物质？3、与单个氨基酸对应的碱基序列叫什么？4、DNA的复制是全保留还是半保留的？5、在半保留复制中，在第一、第二和第三轮复制中，分别有多少含有一条亲代链和一条子代链的双连DNA分子？。

病毒空斑纯化病毒蚀斑如同噬菌体的噬斑，一个蚀斑为一个病毒体的繁殖后代品系。

在细胞培养中做蚀斑是一种较精确的测定病毒感染的方法，将病毒各稀释度种入单层细胞瓶，吸附1h，在单层细胞上覆以营养琼脂培养基，病毒在细胞中繁殖使细胞死亡。

但由于琼脂的限制只能感染临近的细胞，形成“蚀斑”的退化细胞区，经中性红活细胞染料着色后，活细胞显红色，而蚀斑区细胞已退化步着色，形成不染色区域。

凡是能在细胞培养物中产生CPE的病毒都可以采用蚀斑技术来分离和测定。

蚀斑技术在测定病毒感染时是很好的定量方法，也是测定干扰素和抗体中和病毒繁殖能力的一种非常敏感的方法。

此外还可以用来纯化病毒，纯化时挑选合适的空斑进行传代即可。

若目的是要提高病毒能力，应选大空斑，若是为了减毒以制备疫苗应挑选小空斑，但每瓶空斑数不得超过20-40个。

试验时，培养瓶应翻转培养，以防止水滴在琼脂面流动，以免各个蚀斑交叉融合，中性红应在蚀斑出现前加入，在暗处孵育，以防止染料抑制病毒和破坏细胞。

对那些生长缓慢的病毒蚀斑，中性红则不是加在最初的覆盖层里，而是加在经过几天培养后的最后一层覆盖层上，可使培养物维持更久，甚至有的中间还得补加营养琼脂覆盖层1-2次。

蚀斑使用的琼脂往往有少量抑制物而影响蚀斑的产生，应将琼脂用单蒸水浸泡过夜，再用单蒸水冲洗2-3次，而后用去离子水冲洗1-2次后，用Hanks液配制成3%浓度，煮沸1h 除菌备用。

有人在试验时补加25mmol的MgCl2或CaCl2及1mmol的半胱氨酸，可加强肠道病毒形成蚀斑。

而MgCl2的加强作用最强。

流感病毒纯化（蔗糖梯度法）概论转头选择密度梯度选用一、概论在密度梯度离心中单一样品组份的分离是借助于混合样品穿过密度梯度层的沉降或上浮来达到的。

梯度液的密度随着离心本经的增大而增加。

密度梯度可以予形成，也可以在离心过程中自形成，经常，密度梯度的可以分为：速率一区带（Rate-30nal）离和等密度（Isopycnic）离心。

病毒空斑实验原理
病毒空斑实验是一种常用的病毒鉴定方法，它通过观察植物叶片上的病毒感染
区域与未感染区域的差异，来确定植物是否感染了某种特定的病毒。

这种方法简单易行，且对于一些病毒的鉴定具有较高的准确性，因此在植物病毒学研究中得到了广泛应用。

病毒空斑实验的原理主要基于病毒感染后对植物叶片的影响。

在实验中，首先
需要选择一种易感染的植物作为实验材料，然后通过接种方式将待检测的植物病毒接种到植物叶片上。

接种后，病毒会在植物叶片内部进行复制和扩散，导致叶片出现病斑或病斑区域的变化。

而在实验的对照组中，同样的植物叶片则不接种病毒，作为未感染的对照。

接下来，通过一系列的观察和分析，可以发现感染了病毒的植物叶片上会出现
病斑，而未感染的对照叶片则不会有这样的变化。

病斑的形态、颜色、大小等特征可以帮助鉴定出感染的病毒种类和数量。

通过比对实验组和对照组的差异，可以准确地确定植物是否感染了目标病毒。

除了观察病斑的形态特征外，还可以利用分子生物学方法对病毒进行进一步的
鉴定。

例如，通过提取病毒RNA或DNA，利用PCR扩增等技术进行特异性检测，可以进一步确认病毒的种类和数量。

这种综合应用观察和分子生物学方法的方式，可以提高病毒鉴定的准确性和灵敏度。

总的来说，病毒空斑实验是一种简单、有效的病毒鉴定方法，通过观察病斑的
形态特征和分子生物学方法的综合应用，可以准确地确定植物是否感染了目标病毒。

在植物病毒学研究中，这种方法对于病毒的鉴定和研究具有重要的意义，也为植物病害的防控提供了重要的技术支持。

Supplementary informationAccess to a main alphaherpesvirus receptor, located basolaterally in the respiratory epithelium, is masked by intercellular junctionsJolien Van Cleemput, Katrien C.K. Poelaert, Kathlyn Laval, Roger Maes, Gisela S. Hussey, Wim Van den Broeck, Hans J. Nauwynck.Supplementary experimental proceduresEHV1 purification and Dio-labellingCulture fluids of EHV1-infected RK-13 cells were clarified by centrifugation at 60,000g for 2h at 4°C. The virus pellet was pooled onto a discontinuous OptiPrep™ gradient (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) containing 10-30% (w/v) of iodixanol and centrifuged at 100,000g for 2.5h at 4°C. After centrifugation, purified opalescent virus bands were harvested at the interface of the 15% and 20% layers. To ensure efficient virus lipophilic labelling, the buffer was exchanged to HNE buffer (5 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4) by the use of a 50K filter device (Millipore corporation, Bedford, MA, USA). While vortexing, 2 nM of 3,3’-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (Dio) dissolved in DMSO (Molecular probes, Oregon, USA) was added to the virus. Subsequently, unbound Dio was removed by centrifugation onto a MicroSpin™ G-50 fine column (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). The degree of Dio-labelled virus purity (>90%) was evaluated by simultaneous immunofluorescent staining of EHV1 gB with mouse monoclonal antibody 3F6 (kindly provided by Prof. U. Balasuriya, University of Kentucky, USA) and quantitative analysis by confocal microscopy.Tissue collection and processingRespiratory mucosal explant isolation and cultivationThe respiratory mucosa was stripped from the underlying cartilage and washed in PBS to remove excess blood. Tissues were cut into small square pieces (25 mm2), placed with the epithelial side facing upwards onto fine-meshed gauzes and cultured in a 37°C, 5% CO2, humidified incubator for 24h at air-liquid interface in serum-free medium containing DMEM/RPMI (Invitrogen, Paisley, UK), supplemented with 0.1 mg/mL gentamicin, 100 U/mL penicillin, 0.1 mg/mL streptomycin, and 0.25 µg/mL amphotericin B.EREC isolation and cultivationTracheae were trimmed upon arrival in the lab and washed in PBS to remove excess blood. Tissues were submerged into an enzyme mix of 1.4% pronase (Roche Diagnostics Corporation, Basel, Switzerland) and 0.1% deoxyribonuclease I (Sigma-Aldrich) in calcium- and magnesium-free PBS supplemented with 0.45% glucose (VWR International, Leuven, Belgium), 1% sodium pyruvate (Invitrogen), 100 U/mL penicillin and 0.1 mg/mL streptomycin for 48h at 4°C. Detached cells were then incubated in DMEM/F12 (Invitrogen), containing 1% MEM non-essential amino-acids (Invitrogen), 2.4 µg/mL insulin (Sigma-Aldrich), 100 U/mL penicillin and 0.1 mg/mL streptomycin in a plastic petri dish for 2h to reduce fibroblast contamination by adherence. Isolated EREC were either seeded immediately or stored in liquid nitrogen at a density of 2∙106cells per cryovial until further use. EREC were seeded at a concentration of 1.8∙106 cells/insert overnight into type IV collagen-coated (Sigma-Aldrich) 0.4µm pore size transwell cell culture wells (Costar, Corning, Fisher Scientific, Fair Lawn, USA) in DMEM/F12 (Invitrogen), supplemented with 5% non-heat inactivated FCS (Invitrogen), 1% MEM non-essential amino-acids, 100 U/mL penicillin, 1 mg/mL streptomycin, and 1.25 µg/mL amphotericin B. The next day, seeding medium was removed and the bottom platewells were filled with DMEM/F12, containing 2% Ultroser G (Pall Life Sciences; Pall Corp., Cergy, France), 100 U/mL penicillin, 0.1 mg/mL streptomycin, and 1.25 µg/mL amphotericin B (EREC medium). The transwell, comprising the apical surface of the EREC, was left empty to mimic an air-liquid interface. EREC were incubated in a 37°C, 5% CO2 humidified incubator and medium was changed every 1-2 days until full differentiation. After 5-7 days, the EREC attained a trans-epithelial electrical resistance (TEER) of ~500-700 Ω∙cm-2. TEER was measured using an epithelial voltohmmeter (Millipore). The net resistance was calculated by subtracting the background resistance and multiplying the resistance by the surface area of the membrane.Disruption of intercellular bridges of respiratory mucosal explantsFirst, 24-well culture dishes were filled with 1 mL of a solution containing 50% sterile 3% agarose (low temperature gelling; Sigma-Aldrich) and 50% 2X MEM (Invitrogen). Explants were placed onto the solidified agarose with the epithelial surface facing upwards. Additional agarose was added until the lateral surfaces of the mucosa were fully occluded. Explants were then exposed for 1h at 37°C to different drugs (8 mM EGTA, 500 mM NAC, 20 mM DTT or 50 mM β-mercaptoethanol in PBS). PBS supplemented with calcium and magnesium was used as a control. Finally, explants were washed 3 times to remove excess drugs and were fixed in phosphate-buffered 3.5% formaldehyde solution, either immediately or after an additional 24h incubation. An automated system was used for paraffin embedding of the samples (Thermo Scientific™ STP 120 Spin Tissue Processor). Eight µm paraffin sections were first deparaffinised in xylene, then rehydrated in descending grades of alcohol, subsequently stained with haematoxylin-eosin, dehydrated in ascending grades of alcohol and xylene and finally mounted with DPX (Sigma-Aldrich). Ten pictures on five different sections per treated explant were taken with an Olympus IX50 light microscope fitted with 40X objective. The percentage of intercellular space in the epithelium was measured using ImageJ software (ImageJ, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA). The region of interest (ROI, i.e. the epithelium) was drawn manually for each picture in the “ROI manager tool”. Next, the threshold value to distinguish blank spaces from cellular material was determined and the percentage of blank spaces between the cells (i.e. the intercellular space) was calculated. Immunofluorescent staining and confocal microscopyRespiratory mucosal explantsSixteen µm thick cryosections were cut using a cryostat at -20°C and loaded onto 3-aminopropyltriethoxysilane-coated (Sigma-Aldrich) glass slides. Slides were then fixed in 4% paraformaldehyde for 15min and subsequently permeabilized in 0.1% Triton-X 100 diluted inPBS. Non-specific binding sites were blocked by 15min incubation with avidin and biotin (Invitrogen) at 37°C. To label late viral glycoproteins, a polyclonal biotinylated horse anti-EHV1 was used for 1h at 37°C1, followed by incubation with streptavidin-FITC® (Invitrogen) for 1h at 37°C. The basement membrane of the tissues was stained with monoclonal mouse anti-collagen VII antibodies (Sigma-Aldrich), followed by secondary Texas Red® labelled goat anti-mouse antibodies (Invitrogen). Nuclei were detected by staining with Hoechst 33342 (Invitrogen). Slides were mounted with glycerol-DABCO and analysed using a Leica (TCS SPE) confocal microscope. The total number of plaques was counted on 50 cryosections and plaque latitude was measured using the Leica confocal software package. Five cryosections per explant were completely photographed and the percentage of infection in the epithelium (i.e. ROI) was determined using Image J software. The ROI (i.e. the epithelium) was drawn manually for each picture in the “ROI manager tool”. Next, the threshold value to distinguish the FITC positive signal from the background signal was determined and the percentage of FITC positive signal (i.e. infection) was calculated.Cellular glycosaminoglycans, heparan sulfate, chondroitin sulfate A and B and sialic acids were respectively stained with a monoclonal mouse anti-heparan sulfate antibody (10E4; Ambsio, Abingdon, UK), a monoclonal mouse anti chondroitin sulfate (CS-56; Bio-rad; Oxford; UK) or biotinylated Maackia Amurensis lectin (Vector Laboratories; Peterborough; UK) followed by a goat anti-mouse FITC® antibody or streptavidin-FITC®.ERECAntibodies were incubated directly in the transwells for 1h at 37°C. Cells were first incubated with a 1:1,000 dilution of a polyclonal rabbit anti-IEP antibody, kindly provided by Dr. D. O’Callaghan, Louisiana State University, USA. The diluent used was PBS containing 10% negative goat serum. This was followed by incubation with a goat anti-rabbit IgG FITC®conjugated antibody (Invitrogen). Nuclei were counterstained with Hoechst 33342 for 10minat 37°C. Transwell membranes were excised from the culture inserts and mounted on glass slides using glycerol-DABCO. Slides were examined using a Leica confocal microscope. The total number of plaques was counted on 5 random fields of approximately 3∙104 cells per insert. Plaque latitude was measured on 10 individual plaques using the Leica confocal software package.Enzymatic removal of cell surface N-linked glycans and sialic acids prior to EHV1 inoculationPNGase F (New England Biolabs, Ipswich, UK) removes complex, hybrid and oligomannose N-glycosylations and was applied onto apical or basolateral EREC surfaces for 12h at a concentration of 25,000 U/mL, diluted in EREC medium, supplemented with 10% glycobuffer (New England Biolabs; Ipswich; UK). Neuraminidase from Vibrio cholera (Sigma-Aldrich) has a broad substrate spectrum for sialic acids and was used for 1h at 50 mU/mL in PBS. The influenza A/Equine/Kentucky/98 (H3N8) strain served as a positive control during neuraminidase treatment of EREC. The virus was propagated in embryonated eggs and titrated onto Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells. Influenza A strains can easily infect MDCK cells through interaction with cell-associated sialic acids, which can be removed with neuraminidase2. Equine influenza virus (EIV) A nucleoprotein was stained with the mouse monoclonal antibody HB-65 (ATCC) and subsequently visualized with FITC®-labelled secondary goat anti-mouse IgG antibodies. Nuclei were counterstained with Hoechst 33342 and coverslips were mounted using glycerol-DABCO. The percentage of positive cells was calculated based on the total number of positive cells out of 300 randomly selected cells. Correct cleavage of the respective sialic acids was corroborated by immunofluorescent staining of EREC with biotinylated Maackia Amurensis Lectin II (Vector laboratories). The complex was subsequently stained with Streptavidin-FITC® (Invitrogen). Ten z-stack confocal pictures were taken to distinguish apical from basolateral treatment. The means of the fluorescent apicalor basolateral signals were compared with Image J software and dropped significantly after treatment with neuraminidase, compared to control. Following enzymatic treatment, cells were washed 3 times with DMEM/F12 and the inoculum was delivered on top of the respective surfaces for 1h at 37°C. Concurrently, and as a positive control for enzymatic treatment, MDCK cells were treated with neuraminidase before inoculation with EIV. After 1h inoculation, unbound virus particles were removed by washing and cells were incubated for 10 hours before fixation in methanol, as described above.Supplementary figuresFigure S1. Cell viability in respiratory mucosal explantsTUNEL-staining data of tracheal ME (left) and nasal ME (right) after different treatments. Three independent experiments were performed and data are represented as means + SD. The lower case letters indicate significant (P<0.05) differences in the epithelium, while the upper case letters indicate significant differences in the lamina propria.Figure S2. The disruption of intercellular bridges in EREC(a) Trans-epithelial electrical resistance of EREC prior to treatment and after 30min treatment with PBS (control) or EGTA. Three independent experiments were performed and the data are represented as means + SD. Different letters indicate significant (P<0.05) differences. (b) EMA-staining confirmed no significant (P<0.05) differences in cell viability after different treatments, when compared to cell viability prior to treatment. Three independent experiments were performed and data are represented as means + SD. Different letters indicate significant (P<0.05) differences.Figure S3. Validation neuraminidase assay(a) During enzymatic treatment, MDCK cells were similarly pre-treated with neuraminidase before inoculation with EIV. Cells were fixed at 6hpi in methanol and EIV-positive cells were visualized using the monoclonal HB65 antibody. Five random fields of approximately 100 cells were screened to calculate the percentage of EIV-positive cells. Experiments were performed in triplicate. Data are represented as means + SD and different letters represent significant differences. (b) Correct sialic acid-cleavage from EREC surfaces was confirmed by confocal analysis of 10 different z-stacks per treatment. EREC were grown to confluency on transwells and treated at either the apical surface (left) or basolateral surface (right) with neuraminidase or control PBS for 1h at 37°C. Cells were then fixed in PFA and permeabilized in Triton X, sialic acids were stained with biotinylated Maackia Amurensis lectin and the percentage of fluorescent signal in either the apical or the basolateral domain of EREC was calculated. Data are represented as mean + SD. Significant differences after apical exposure are indicated by different lower case letters and after basolateral exposure by different upper case letters.Supplementary references1 van der Meulen, K., Vercauteren, G., Nauwynck, H. & Pensaert, M. A local epidemicof equine herpesvirus 1-induced neurological disorders in Belgium. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift72, 366-372 (2003).2 Stray, S. J., Cummings, R. D. & Air, G. M. Influenza virus infection of desialylatedcells. Glycobiology10, 649-658 (2000).。

3、空斑纯化3.1病毒TCID501）在离心管中用MEM将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-6。

2）将稀释好的病毒接种到96孔培养板中，每一稀释度接种一纵排，共8 孔，每孔接种100µl。

3）在每孔加入细胞悬液100µl，使细胞量达到2~3×105个/ml。

4）设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。

（100µl生长液+100µl细胞悬液）5）逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。

6）结果的计算，按Reed-Muench法。

Reed-Muench法距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数）＝（91.6-50）/（91.6-40）＝0.8lg TCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数=0.8×(-1)+(-3)=-3.8TCID50=10-3.8/0.1ml含义：将该病毒稀释103.8接种100µl可使50%的细胞发生病变。

3.2中性红溶液和DMEM营养琼脂的配制（1）中性红溶液的配制1）取中性红1g、NaCl 8.5g溶于1L超纯水中2）高压灭菌后分装保存于4℃冰箱中。

（2）DMEM营养琼脂的配制1）取2g琼脂糖于100ml超纯水中，微波炉中火2min溶解后摇匀，高压灭菌。

2）取小牛血清4ml、中性红3.3ml无菌操作加到100ml双倍DMEM中，37℃水浴30min，摇晃均匀。

3）溶解的2%琼脂置于44℃水浴30min，与双倍DMEM混合液混合后，置于44℃待用。

3.3铺6六孔板(1) 将已准备好的V ero细胞消化均匀铺于6孔板中。

(2)细胞长成单层后吸去培养液，每孔加2ml无血清维持液置于37℃1h。

(3)将病毒用无血清维持液做10倍递增稀释。

(4)吸去孔内维持液，按合适稀释度每孔滴加200μl稀释好的病毒液, 每个稀释度加两个孔，置37℃吸附1小时后弃病毒液。

材料和试剂：DMEM培养基，细胞板，中性红，琼脂糖，PBS或无抗无血培养基，1ml和10ml 移液管等。

操作步骤：1 PK15细胞铺细胞板，细胞密度要较高，才轻易形成空斑（但太高了也不好，有可能会形成很多层细胞，造成有细胞形成病变地方有其它层细胞没有坏死也被染色从而无法形成空斑）。

2 过夜后，用无抗无血培养基清洗洗吧，然后再进行病毒吸附，原液进行10倍倍比稀释，自己能够探索一下感染稀释度，通常病毒价较低时候，能够降低稀释度。

看空斑形成情况，要是空斑形成太大，连成片，就得增加稀释度。

3 吸附1-2小时，用无抗无血培养基（或无菌PBS）清洗2-3遍后配制第一次覆盖液。

使用1.6%琼脂糖（加热至液体状）和两倍DMEM溶液等体积混合，逐滴加到细胞板中。

没孔加入1-2ml覆盖液。

放置于37度培养箱中培养。

4 天天观察细胞病变情况，出现显著病变时进行二次覆盖，覆盖液和第一次差不多，只是要加入细胞染色液中性红（0.1%），通常体积比为10ml：10ml：1ml （能够合适增加一点，假如染色效果不良话）。

5 染色5H以上应该就能够观察染色情况，理论上伪狂犬病毒应能形成白色空斑而PCV2不会产生空斑。

在不知道PCV2在哪里情况下，我们随机挑取若干个没有空斑细胞，以后进行传代。

应该能够得到无伪狂犬污染PCV2病毒种。

1 蚀斑试验需要细胞长至什么程度能够接毒？显微镜下观察，通常情况下，铺满细胞板底部即可，这么不会造成空洞影响蚀斑观察。

不一样细胞不一样，通常时候是长满T25细胞传一个六孔板，第二天就接毒。

2 细胞上用什么覆盖物？琼脂？琼脂糖？低熔点琼脂糖？浓度应该是多大？我用是lonza企业低熔点琼脂糖，终浓度是0.75%。

感觉不错，就是挺贵，2k+人民币。

3 假如做挑斑纯化，是不是就不能够染色，染色后对毒力有何影响？不染色就能够看出来，因为培养基础身里面就含有酚红展现颜色，形成斑没有颜色，能够直接挑斑；我也染色后挑过，感觉影响不大，可能不一样病毒不一样吧。

腺病毒包装纯化及感染实验操作步骤技术背景Adeasy 系统利用了腺病毒具有的高感染能力，可高度浓缩等优点，并破坏了腺病毒基因组中的早期基因E1，使之成为较为安全、高效的病毒载体。

利用带有E1 基因的293 细胞作为包装细胞，通过倍比扩增，富集病毒颗粒，并通过CsCl 梯度离心，透析进行分离纯化。

对绝大多数的细胞株可以达到近乎100％的感染效率。

但需要指出的是Adeasy 同样具有所有病毒载体或转染试剂都不可避免的细胞毒性问题。

所需试剂1.293 细胞；2. 重组好的腺病毒质粒；3. Pac I 限制性内切酶；4. 质粒回收相关试剂；5. 细胞培养、转染相关试剂；6. TBS：10mM Tris, 0.9% NaCl，pH8.1；7. 40% CsCl：28.45 g CsCl 溶于42.7 ml 的TBS 中，4 度保存；8. 15% CsCl：9.085 g CsCl 溶于47.69 ml 的TBS 中，4 度保存；9. Beckman 离心管：14*89 mm，SW41 转头；10. Polybrene (sigma)，10 mg/ml；11. 透析袋：Spectrum Co. （成卷供应，带少量甘油，硫化物与重金属），MW=8000~14400；12. 灭菌甘油。

操作流程1.293 细胞（E1-transformed human embryonic kidney cells 在转染前24 小时接种于1 或2 个60 mm 培养盘中，使之在转染时细胞汇合率为50-70%；2. 在转染前，用Pac I 处理目的质粒（一般一个60 mm 细胞盘需要6μg DNA）。

处理后质粒用乙醇沉淀并重悬于20 μl 无菌水中；3. 用PEI 或其他转染试剂将6 μg Pac I 处理过的质粒转染细胞；4. 8 个小时后移去混合液，加入4 ml DMEM 完全培养液（10% CBS，1%Pen/Strep）；5. 在转染后7 到10 天用细胞刮（而不是胰酶）将细胞从瓶中刮下并移入50ml锥形管。

一、目的测定病毒空斑形成单位（PFU ，plaque forming unit ），可用于病毒滴度测定及标定病毒的感染能力。

本SOP 明确了流感病毒空斑形成单位的标准测定方法，保证实验结果的准确可靠。

二、范围适用于中国国家流感中心的所有技术人员测定流感病毒空斑形成单位。

三、程序（一）生物安全要求H5、H7亚型高致病性禽流感病毒及H2N2亚型流感病毒的操作需要在BSL-3级实验室中进行。

其余流感病毒的操作需要在BSL-2级实验室中进行。

操作人员的生物安全防护要求详见流感中心“生物安全个人防护SOP ”（二）材料1．病毒储存液2．MDCK 细胞和细胞培养液试剂MDCK 细胞：低代数的MDCK 细胞（小于25代），MDCK 细胞培养液：D-MEM +5%胎牛血清+抗生素500mL D-MEM 培养液（Gibco, Cat. #11960-051）5.5mL 青、链霉素母液（10000 U/mL 青霉素G ；10000µg/mL 硫酸链霉素，Gibco, Cat. #15140-122）25.5mL 胎牛血清（Gibco Cat. #16000），0.22µm 过滤器过滤 EDTA-胰酶（Gibco, Cat. #25300-054）3．病毒培养液：DMEM+1%牛血清白蛋白+抗生素，即配即用。

429mL DMEM标准操作规程（SOP ）——实验66mL 7.5%牛血清白蛋白（BSA）5mL 100×抗生素TPCK-胰酶（使用浓度为2mg/mL）4．其他平底24，12或6孔微量培养板红细胞计数器1.6%低熔点琼脂无菌PBS液（pH7.2）中性红溶液（浓度为3.3mg/mL）5．2×DMEM (Gibco,Cat.# 12100-046)（三）实验步骤以六孔细胞板为例：1．第一天，将T75细胞瓶中成片生长的MDCK用EDTA-胰酶消化后计数，（具体方法见MDCK细胞培养SOP及细胞计数SOP）铺6孔MDCK细胞板，细胞浓度5×105/孔。

EV71空斑纯化实验protocal
原理
病毒感染细胞后，由于固体介质的限制，释放的病毒只能由最初感染的细胞向周边扩展。

经过几个增殖周期，便形成一个局限性病变细胞区，此即病毒蚀斑。

一个蚀斑是由最初感染细胞的一个病毒颗粒形成的，接种的病毒液要充分分散和稀释。

流程
1.铺板
将已长满80~90%RDcell消化均匀铺于6孔板中。

2.病毒感染
细胞长成单层达80~90%吸去培养液，将病毒做10倍稀释，共做5个梯度，并向每孔中加入200μL稀释好的病毒液（阴性对照加DMEM200μL），置于37℃温箱吸附两小时后弃残液。

3.制备2%琼脂糖
使用低熔点琼脂糖配方：0.2g加入10ml 无菌PBS中，121℃高压灭菌15min，取出后置于55℃水浴锅中待用
4.混合
将上述琼脂糖和2X？维持液(FBS浓度为2%）40~50℃水浴1:1混合后，加入培养板各孔，每孔2ml,室温放置30min以上使其冷却凝固成覆盖层
5.培养
把培养板倒置？，在37℃二氧化碳培养箱继续培养48h。

6.染色
制备含0.2%结晶紫(生理盐水稀释）的2%琼脂糖：双倍维持液（1：1），置于40~50℃水浴待用，吸取上述混合液加入培养板各孔，每孔2ml,使冷却凝固成第二覆盖层
7.培养
把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱继续培养48h观察，每皿蚀斑数量＜10个的稀释度中，挑选附近10mm均为健康的蚀斑。

8.将挑选的病毒至少再传2代
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问：我准备做病毒空斑实验，不知到怎样配置甲基纤维素覆盖培养液，敬请各位指教答：1、我是这么做的：24孔板VERO，HSV11）24孔板预板2）24h后，弃培养液，用hanks液洗1次3）接种病毒液0.1ml/孔4）放入37度5％CO2培养箱1h，期间每15min慢摇一次，使病毒充分吸附5）加入1％甲基纤维素（1ml/）孔覆盖培养基，放入37度5％CO2培养箱继续培养6）3天后，吸弃培养基7）加入5％甲醛1ml/孔固定4min，弃甲醛，加入结晶紫0.8ml/孔染色20min8）自来水缓缓冲洗染液，计算孔斑数2、我的老师做空斑试验也是用甲基纤维素，不过浓度是2%，配置方法是：甲基纤维素：3克溶于150ml 蒸馏水中，最终浓度为2%；染色用的碘液：25g溶于500ml95%的乙醇中。

最终浓度为5%做出的效果很好。

不过甲基纤维素要提前很长时间配置，大约2周，高压后放入冰箱，使用前无菌操作加入培养液，混匀放入冰箱，过一天后再拿出，使劲摇匀，使纤维素达到一种匀质的状态，静置至起泡完全消失后使用。

染色可以用中性红0.1%（w/v)温箱孵育2-3小时，若是6孔板每孔加1ml;倾倒后即可计数。

问：“1％甲基纤维素（1ml/）孔覆盖培养基，放入37度5％CO2培养箱继续培养”是指把1％甲基纤维素直接加入已放好培养基的孔里，还是甲基纤维素和培养基混好再加入细胞中？配方比例是什么？甲基纤维素要提前很长时间配置，大约2周为什么？什么时候可以计数了？以什么为标准呢？答：1、1％甲基纤维素（1ml/）孔覆盖培养基应是指按1ml/孔的量加甲基纤维素覆盖培养基。

甲基纤维素覆盖培养基应该就是指Viscous medium,它是一种专门培养基。

简单的说就是在普通细胞培养液里面添加了甲基纤维素来提供粘性,甲基纤维素应非营养物质。

因甲基纤维素难溶，所以要先配并灭菌好甲基纤维素溶液。

然后在无菌条件下往其中补加其他培养基所需成分，注意MEM 配的是10×的，这样要加的MEM 溶液体积就少的多。

空斑纯化/计数
1.病毒的稀释与接种
病毒液用冷DMEM 10倍倍比稀释。

待单层MDCK细胞长到90%-100%时，吸弃细胞培养液，用PBS冲洗2次，每孔每次0.1ml。

选择不同稀释倍数的病毒液接种细胞，每孔0.2ml，每个稀释度做3个孔，37℃吸附1h。

2.覆盖琼脂培养液
将含有双抗的DMEM与2%琼脂液等量混合，并加入TPCK-Trypsin，使其终浓度为2ug/ml。

吸弃病毒液后，将覆盖液铺盖于单层细胞表面。

4℃放置10min，待琼脂凝固后，将琼脂层向上，置37℃培养4-5天，并逐日观察。

3.挑斑/染色计数蚀斑
对光观察，出现蚀斑后，对蚀斑做出标记，用枪头将蚀斑连同琼脂一起挑出，溶解于适量PBS，可进一步利用鸡胚或MDCK细胞繁殖病毒。

当蚀斑出现且数量不再增加时，每孔加0.2ml 0.1%中性红染色4h，由于中性红可使活细胞着色，病毒感染灶则形成无色蚀斑。

（也可用1%的结晶紫染色染十几分钟即可）计数时选择蚀斑不融合，分散呈单个，数目在10-30个/孔的细胞孔，分别计算计算各病毒稀释度的蚀斑数，并求3个孔的平均值，按下列公式计算：
感染性病毒量（pfu/ml）=每孔内蚀斑数/每孔接种病毒量×病毒稀释倍数。

四、病毒的培养和纯化
同微生物学其他学科分支一样，病毒学的进步完全得益于
研究方法和技术手段的发展。

通过病毒的分离与纯化获得纯化的、有感染性的病毒制备物
是病毒学研究和实践的基本技术。

1、病毒的培养
病毒的培养：二元培养物法
1、病毒的培养
培养液
细菌培养液变清亮
噬菌体细菌培养物
营养琼脂平板
细菌平板成为残迹平板若是噬菌体标本经过适当稀释再接种细菌平板，
经过一定时间培养，在细菌菌苔上可形成圆形局
部透明区域，即噬斑（plaque）。

如同对细菌计数一样，形成的噬菌斑也可用于对
噬菌体的数目进行估算。

1、病毒的培养
动物病毒实验动物
鸡胚
多种细胞培养
1、病毒的培养
大多数动物病毒感染敏感细胞
培养能引起其显微表现的改变
，即产生致细胞病变效应
（cytopathic effect,CPE），例如
细胞聚集成团、肿大、圆缩、
脱落，细胞融合形成多核细胞，
细胞内出现包涵体（inclusion
body），乃至细胞裂解等。

1、病毒的培养
若标本经过适当稀释进行接
种并辅以染色处理，病毒可
在培养的细胞单层上形成肉
眼可见的局部病损区域，即
蚀斑（plaque）或称空斑。

1、病毒的培养
植物病毒敏感植物叶片产生坏死斑，或称枯斑
四、病毒的培养和纯化
2、病毒纯化
病毒是有感染性的生物体
标准纯化的病毒制备物应保持其感染性病毒具有化学大分子的属性
纯化的病毒制备物的理化性质应具有均一性。

M13噬菌体空斑实验一、实验目的：1、了解M13噬菌体载体的一般结构、性质及感染特征。

2、学习并掌握M13噬菌体载体的空斑纯化技术。

二、实验原理：一个M13噬菌体的病毒颗粒感染一个细菌后形成一个噬菌斑。

从感染细菌释放出来的子代病毒颗粒感染临近细菌，后者又可释放下一代病毒颗粒；如果细菌在半固体培养基上生长，自带病毒颗粒的扩散受到一定限制，诸如M13等丝状噬菌体并不裂解细菌，但可以使细菌生长速度降低至原来的1/2，在上层琼脂中生长的菌台的背景下，生长缓慢细菌形成了一个不断扩大到肉眼可见的噬菌斑。

三、材料与试剂：1、M13噬菌体2、ER2738菌种3、LB培养基四、实验步骤1.1、取5ml LB液体培养基于10ml的试管中，加入5ul 四环素（20mg/ml），将大肠杆菌接入，37℃震荡（80-100rpm）培养过夜（12h）2.将2ml的ER2738培养液转入20ml的LB培养基中（1:10稀释），继续37℃震荡（80-100rpm）培养4.5h（不宜过快，否则，细菌性毛被破坏，噬菌体无法导入），即成为感受态细胞3.培养细菌时将水浴锅打开，43℃预热，并将LB 平板置于37℃预热备用4.用装有LB培养基的EP管10倍稀释噬菌体，理想的稀释范围：扩增过的噬菌体108-1010倍稀释，未扩增过的104-105倍稀释5.将顶层琼脂用微波炉或者电磁炉沸水融化，置于水浴锅中保温待用6.当大肠杆菌达到对数成长期，取大肠杆菌ER2738感受态细胞200ul于EP管中7.加入10ul-100 ul（或者一定体积）一定稀释度的噬菌体溶液，快速混合，室温孵育1-5min8.将感染过的大肠杆菌的培养液倒入43℃顶层琼脂中，用vortex迅速混匀，立刻在预热的LB培养基上倒平板，迅速摇晃平板使顶层琼脂均匀展开并铺满表面9.室温静置5min左右使平板冷却凝固，将培养皿倒置37℃培养过夜10.第二天观察平板，对培养皿中的噬菌斑进行计数，计算约含有10-100个数量级的平板噬菌斑的具体数目（y），计算噬菌体效价（pfu/ml）噬菌体效价=y*10x+2puf/ml分子生物学作业1、什么是细菌的转化？2、在哪些生物中，RNA是唯一的遗传物质？3、与单个氨基酸对应的碱基序列叫什么？4、DNA的复制是全保留还是半保留的？5、在半保留复制中，在第一、第二和第三轮复制中，分别有多少含有一条亲代链和一条子代链的双连DNA分子？。

病毒空斑实验原理病毒空斑实验是一种常用的分子生物学技术，用于研究病毒的感染和复制机制。

通过观察病毒在寄主细胞中形成的空斑，可以揭示病毒的传播途径、寄主范围和致病机制。

本文将介绍病毒空斑实验的原理及其应用。

病毒空斑实验的原理主要基于病毒在寄主细胞中的感染和复制过程。

在实验中，病毒颗粒首先侵入寄主细胞，然后利用细胞的生物机制进行复制和扩散。

当病毒感染细胞后，会在细胞内形成一定数量的病毒颗粒，并导致细胞的变化，形成可见的病毒空斑。

通过观察这些病毒空斑的形成和扩散情况，可以了解病毒在细胞内的复制过程和对寄主细胞的影响。

病毒空斑实验通常使用寄主细胞培养物和病毒悬浮液进行。

首先，将寄主细胞培养在培养皿中，形成单层细胞。

然后，在细胞上均匀涂抹病毒悬浮液，使病毒感染细胞。

随着病毒的复制和扩散，细胞表面会出现圆形或不规则形状的病毒空斑。

通过显微镜观察这些病毒空斑的形态和数量变化，可以对病毒的感染和复制过程进行定量和定性的分析。

病毒空斑实验在病毒学研究中具有重要的应用价值。

首先，它可以用于鉴定和鉴定病毒株系。

不同的病毒株系对不同的寄主细胞具有不同的感染能力和复制速度，因此可以通过病毒空斑实验来鉴定和鉴定病毒的株系。

其次，病毒空斑实验可以用于病毒的毒力测定。

通过观察病毒空斑的形成和扩散情况，可以了解病毒对寄主细胞的致病能力和毒力大小。

此外，病毒空斑实验还可以用于研究病毒的传播途径和寄主范围，为病毒防控和治疗提供重要的参考依据。

综上所述，病毒空斑实验是一种重要的病毒学研究方法，通过观察病毒在寄主细胞中形成的空斑，可以揭示病毒的感染和复制机制。

病毒空斑实验的原理简单易懂，应用价值广泛，是病毒学研究中不可或缺的技术手段。

希望本文的介绍能够帮助读者更好地理解病毒空斑实验的原理及其应用，促进病毒学研究的进展和应用。

空斑实验步骤嘿，咱今儿就来说说空斑实验那些事儿！这空斑实验啊，就好像是一场神秘的探索之旅。

首先呢，你得准备好合适的细胞，这就好比是搭建舞台，细胞就是那舞台上的主角呀。

把这些细胞小心翼翼地培养起来，给它们提供一个舒适的“家”。

然后呢，把要研究的病毒稀释到合适的浓度。

这就像是给这场探索之旅准备好独特的“道具”，可不能太浓也不能太稀哦，得恰到好处。

接下来，就把稀释好的病毒液加到细胞上啦。

哎呀，这就像是让“主角”和“道具”相遇，看看会碰撞出什么样的火花。

然后呀，要给它们足够的时间相互作用。

这时候可别急，得耐心等待，就像等待一朵花慢慢开放一样。

等过了一段时间，你就会发现细胞上出现了一些小小的斑点，嘿嘿，这就是空斑啦！就好像是舞台上出现了特别的标记。

这时候，还得仔细地观察和计数这些空斑。

可别小看了这一步，这就像是在数宝藏一样，得认真仔细，一个都不能少。

你想想看，这不就像是在破解一个神秘的密码吗？每一个空斑都可能隐藏着重要的信息。

在整个过程中，每一个环节都得精心呵护，稍有不慎可能就会影响结果哦。

就像走钢丝一样，得稳稳当当的。

而且啊，做这个实验可不能马马虎虎，得像个细心的侦探，不放过任何一个小细节。

不然怎么能发现那些隐藏在细胞和病毒之间的秘密呢？做实验不就像是一场冒险吗？每一次尝试都可能带来新的发现和惊喜。

虽然可能会遇到困难和挫折，但只要坚持下去，总会找到属于自己的“宝藏”。

所以啊，要做好空斑实验，就得有耐心、细心和恒心。

只有这样，才能在这场神秘的探索之旅中满载而归呀！你说是不是呢？。

病毒空斑实验原理
病毒空斑实验是一种常用的分子生物学实验方法，用于研究病
毒的感染机制、复制过程以及宿主细胞对病毒的抵抗能力。

该实验
通过在宿主细胞中引入病毒基因组的部分序列，观察病毒基因组在
宿主细胞中的复制和表达情况，从而揭示病毒与宿主细胞之间的相
互作用关系。

下面将介绍病毒空斑实验的原理及操作步骤。

首先，进行病毒空斑实验需要准备病毒基因组的部分序列，通
常是通过PCR扩增或合成基因片段的方式获取。

这些基因片段可以
是病毒的基因组的一部分，也可以是编码病毒蛋白的基因。

接下来，将这些基因片段与适当的载体连接，构建成重组质粒。

这些重组质
粒可以是质粒载体，也可以是病毒载体。

然后，将构建好的重组质粒转染至宿主细胞中，使其表达病毒
基因组的部分序列。

在转染后的一段时间内，观察宿主细胞的生长
情况，以及病毒基因组的复制和表达情况。

如果病毒基因组的部分
序列对宿主细胞有毒性，那么在转染后的一段时间内，宿主细胞会
出现空斑，即细胞死亡区域。

最后，通过对空斑进行染色或其他适当的检测方法，可以观察
到病毒基因组的复制和表达情况。

通过比较不同条件下空斑的形成情况，可以揭示病毒基因组的复制和表达机制，以及宿主细胞对病毒的抵抗能力。

总之，病毒空斑实验是一种重要的研究病毒感染机制的实验方法，通过该实验可以揭示病毒与宿主细胞之间的相互作用关系，为病毒的防治和治疗提供重要的理论依据。

希望本文介绍的病毒空斑实验原理及操作步骤能够对相关研究工作提供帮助。