GDNF及EGFP双基因共表达重组杆状病毒载体的构建及鉴定

GDNF和EGFP双基因共表达重组杆状病毒载体的构建及鉴定陈艳春;王俊;王士礼;蔡昌枰;李彪;张一帆;郭睿【摘要】目的构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的重组杆状病毒载体.方法将目的基因(EGFP和GDNF)克隆人杆状病毒表达载体pFastBacDual中,构建重组质粒pFB-EGFP-GDNF并予酶切鉴定;将pFB-EGFP-GDNF转化到含杆状病毒穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态菌中,获得重组杆状病毒载体Bacmid-EGFP-GDNF,抽提质粒并行PCR鉴定;脂质体转染法将Bacmid-EGFP-GDNF转染Sf9细胞包装病毒;免疫荧光法检测Sf9细胞EGFP和GDNF蛋白表达.结果目的基因片段正确插入pFastBacDual载体中;重组Bacmid 正确;Bacmid-EGFP-GDNF包装转染成功,获得较高病毒滴度;免疫荧光检测表明,Sf9细胞中GDNF和EGFP蛋白共表达.结论成功构建重组杆状病毒Bacmid-EGFP-GDNF,转染SD细胞共表达GDNF和EGFP蛋白,为进一步研究GDNF蛋白对内耳的保护作用奠定了实验基础.%Objective To construct a novel enhanced green fluorescent protein (EGFP) and glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) recombinant baculovirus. Methods The target gene(EGFP and GDNF) was cloned into baculovirus transfer vector pFastBacDual, pFB-EGFP-GDNF was constructed and restriction enzyme analysis was conducted. pFB-EGFP-GDNF was transposited with baculovirus shuttle vector (Bacmid) into DH10Bac competent cells, and recombination baculovirus vector Bacmid-EGFP-GDNF was constructed. The plasmid was extracted and PCR was performed for identification. Bacmid-EGFP-GDNF was transfected with Sf9 insect cell package virus by liposomal transfectionmethod. Immunofluorescent staining was employed to detect the expression of EGFP and GDNF protein in St9 cells. Results The target gene fragment was correctly cloned into pFastBaeDual vector, and recombinant Bacmid was constructed. Bacmid-EGFP-GDNF was successfully transfected, and higher virus titer was obtained. The coexpression of GDNF and EGFP protein in Sf9 cells was identified by immunofluorescent staining. Conclusion The recombinant baculovirus Bacmid-EGFP-GDNF can be successfully constructed, and the protein of EGFP and GDNF is coexpressed in St9 cells, which paves a way for the research of GDNF gene therapy.【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》【年(卷),期】2009(029)007【总页数】4页(P821-824)【关键词】胶质细胞源性神经营养因子;增强型绿色荧光蛋白;杆状病毒;蛋白表达【作者】陈艳春;王俊;王士礼;蔡昌枰;李彪;张一帆;郭睿【作者单位】上海交通大学,医学院瑞金医院耳鼻咽喉科,上海,200025;上海交通大学,医学院瑞金医院耳鼻咽喉科,上海,200025;上海交通大学,医学院瑞金医院耳鼻咽喉科,上海,200025;上海交通大学,医学院瑞金医院耳鼻咽喉科,上海,200025;上海交通大学,医学院瑞金医院核医学科,上海,200025;上海交通大学,医学院瑞金医院核医学科,上海,200025;上海交通大学,医学院瑞金医院核医学科,上海,200025【正文语种】中文【中图分类】Q78;R764感音神经性聋是影响人类生活质量主要的问题，基因治疗被认为是感音神经性聋最有希望的治疗方法之一。

中文摘要目的：对融合蛋白d-EGF二级、三级结构进行预测并分析其活性部位的可能影响，进行原核表达，并对表达产物进行分析鉴定。

方法：以融合蛋白质基因序列为基础，用DNAStar软件预测其蛋白质的二级结构；用Insight II软件对其三级结构进行建模预测。

在对融合蛋白理论预测的基础上，分别构建含β-defensin-3、EGF的重组质粒，应用重组PCR等方法，将EGF的基因序列融合到β-defensin-3 DNA序列的3’末端，将融合基因克隆入原核表达载体pET-SUMO,构建目的重组质粒pET-SUMO-d-EGF。

采用PCR、测序等方法对目的基因是否正确重组进行鉴定；以重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21（DE3），以IPTG 诱导表达目的蛋白质，表达产物经过Ni-trap柱纯化，SDS-PAGE检测表达初产物及纯化产物。

最后用Western-blot对其特异性进行鉴定；用MTT法检测其促细胞增殖活性；用纸片扩散法药物敏感试验、微量稀释法检测其抗菌活性。

结果：采用DNAStar 软件的Gamier Robson 方法预测的结果表明，融合蛋白质d-EGF含较多的β折叠结构；Charge Density-Charge法预测蛋白质3-22、31-48区段带丰富的正电荷；Insight II软件分析显示重组蛋白d-EGF中原蛋白β-defensin-3、EGF三级结构中的活性必须的六个链内二硫键在融合蛋白中都能够正确形成，维持β-defensin-3三级结构的3个反向平行的β折叠片结构在融合蛋白中能够形成。

融合蛋白的结构含有原蛋白β-defensin-3、EGF的生物活性结构。

成功构建β-defensin-3、EGF 重组质粒，经重组PCR成功扩增出294bp的目的片段，重组体PCR结果与预期结果一致，测序正确。

转入重组质粒的E.coli BL21（DE3）经IPTG诱导、SDS-PAGE 分析得到28 kD左右的目的蛋白条带。

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。

方法：从E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。

然后用质粒DNA 的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。

再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。

将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。

用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。

最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。

结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。

关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取目录1 前言 (3)2 实验目的 (4)3 实验设备 (4)4 材料及试剂 (5)5 实验操作步骤 (5)5.1操作流程 (5)5.2质粒DNA的分离与纯化 (6)5.2.1 质粒的培养 (6)5.2.2 质粒的DNA的碱提取法 (6)5.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化 (7)5.3酶切及连接 (8)5.3.1 双酶切 (8)5.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收） (8)5.3.3 连接 (9)5.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 (9)5.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）.. 95.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法) (9)5.4.3 转化涂板 (10)5.5GFP蛋白的诱导表达 (10)5.6绿色荧光蛋白的粗提取 (11)参考文献 (11)附录 (12)1LB培养基的配制： (12)2.溶液Ⅰ (12)3.溶液Ⅱ (12)4.溶液Ⅲ（100ML） (12)5.DN ASE-FREE RN ASE A (13)6.TE缓冲液（P H8.0） (13)7.20×TBE (13)8.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液 (13)9．PEGFP-N3质粒全图谱 (13)10．P ET-28A质粒全图谱 (14)1 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

利用绿色荧光蛋白GFP作为报告基因检测转基因植物杨明瑜;刘翔;褚华硕;王晓光;朱文华;曲桂芹【期刊名称】《食品与生物技术学报》【年(卷),期】2008(027)002【摘要】GFP作为报告分子被广泛地运用在转基因植株检测中.利用PCR技术扩增得到番茄Bax inhibitor-1基因(LeBI-1),亚克隆到含GFP基因的pEGFP载体上,进一步将中间载体构建到植物表达载体pBI121上.重组pBI121-LeBI-1-EGFP经农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草,分化筛选后获得抗性烟草植株.利用GFP作为报告基因,采用PCR、southern blot及荧光方法验证外源基因LeBI-1成功转化到烟草中.分析讨论报告蛋白GFP不同检测方法的优缺点.【总页数】5页(P98-102)【作者】杨明瑜;刘翔;褚华硕;王晓光;朱文华;曲桂芹【作者单位】中国农业大学,食品科学与营养工程学院,北京,100083;中国农业大学,食品科学与营养工程学院,北京,100083;中国农业大学,食品科学与营养工程学院,北京,100083;中国农业大学,食品科学与营养工程学院,北京,100083;中国农业大学,食品科学与营养工程学院,北京,100083;中国农业大学,食品科学与营养工程学院,北京,100083【正文语种】中文【中图分类】Q344【相关文献】1.含绿色荧光蛋白(gfp)基因的植物重组表达载体pBI121-GFP-62390和pBI121-GFP-51780的构建 [J], 邓丽;刘红;杨万年2.构建携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的重组反转录病毒表达载体pLXSN-Kozak-EGFP及鉴定 [J], 杨天燕;王乃平;王劲;刘冠达;韦锦斌3.绿色荧光蛋白基因(GFP)在抗虫转基因植物研究中的应用 [J], 朱生伟;秦红敏;孙敬三;田颖川4.利用绿色荧光蛋白GFP研究不同启动子在蝉棒束孢菌中的表达活性 [J], 李栋; 刘常利; 刘靖宇; 孟俊龙; 王洪凯5.用绿色荧光蛋白(GFP)作为报告分子筛选有效的siRNA [J], 单志新;林秋雄;符永恒;邓春玉;李晓红;余细勇因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

双表达人Arid5a及报告基因eGFP的重组腺病毒载体的构建及鉴定王顺娟;夏海滨【期刊名称】《现代肿瘤医学》【年(卷),期】2013(21)5【摘要】目的:构建双表达人Arid5a(hArid5a)及报告基因eGFP的重组腺病毒载体,为研究Arid5a的生物功能打基础.方法:通过常规分子克隆方法及基因重组技术获得双表达hArid5a及eGFP的腺病毒载体.通过荧光显微镜观察eGFP的表达来确定病毒包装情况,Western blot检测Arid5a蛋白表达.结果:将hArid5a克隆到腺病毒穿梭载体中,获得pAd5-CMV-hArid5a载体,然后将Pac Ⅰ线性化的pAd5-CMV-hArid5a与Pac Ⅰ线性化的携带报告基因eGFP的病毒骨架通过基因重组,最终获得携带有报告基因eGFP及人Arid5a的腺病毒载体Ad5 CMV-hArid5a/eGFP.将纯化获得的腺病毒载体Ad5 CMV-hArid5a/eGFP感染U87细胞后,通过荧光显微镜观察eGFP的表达；通过Western blot检测到感染细胞中hArid5a表达.结论:成功构建了携带报告基因eGFP的hArid5a的腺病毒表达载体,为进一步研究hArid5a的生物功能奠定了基础.【总页数】4页(P938-941)【作者】王顺娟;夏海滨【作者单位】陕西师范大学生命科学学院基因治疗研究室,陕西西安710062;陕西师范大学生命科学学院基因治疗研究室,陕西西安710062【正文语种】中文【中图分类】R730【相关文献】1.HIF-1α和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 李永明;吕刚;范仲凯;曹阳;王岩松;庄培袁;张玉强;李刚2.HIF-1α和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 李永明;吕刚;范仲凯;曹阳;王岩松;庄培袁;张王强;李刚;3.构建携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的重组反转录病毒表达载体pLXSN-Kozak-EGFP及鉴定 [J], 杨天燕;王乃平;王劲;刘冠达;韦锦斌4.P1/Fas-CCL19双表达重组腺病毒载体的构建及表达鉴定 [J], 姜兆静;李纪强;张积仁5.含tk和EGFP双顺反子重组腺病毒载体的构建及其在鼠内皮细胞中的表达 [J], 贾俊;赵怡芳;张文峰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

含EGFP基因的重组质粒构建及在大肠杆菌中的表达201405189414级生物技术郑伟荣摘要：本实验设计了基因工程的一个基本过程。

将质粒pEGFP－N1的绿色荧光蛋白基因EGFP亚克隆到质粒pUC18中进行克隆和表达。

包括：PCR扩增分离目的DNA片段；载体质粒的抽提、纯化及检测；载体及目的DNA片段的限制性核酸内切酶酶切与连接；重组质粒转化大肠杆菌；重组子的筛选、重组质粒的抽提与鉴定。

关键词：pEGFP－N1绿色荧光蛋白基因EGFP pUC18Western blot质粒体外构建设计1.实验目的和设计原理1.1实验目的设计了基因工程的一个基本过程。

即从载体和目的基因的选择和制备，目的基因的扩增，体外DNA的重组，重组DNA引入受体细胞，重组子的筛选，到重组DNA 的检测。

1.2目的基因目的基因即外源基因，我们使用的是EGFP基因，大小为720bp，EGFP（即增强绿色荧光蛋白）可以用来来研究基因表达，调控，细胞分化及蛋白质在生物体内定位和转运等。

在转移到载体中时，可以改变阅读框，使得原有的基因表达失败。

1.3载体本实验选择的载体为puc18质粒，该质粒主要由Ampr基因、复制起始序列ori 和lacZ－α肽基因等序列组成，lacZ－α肽基因的N端含有多克隆位点。

外源基因在多克隆位点插入后可用传统的蓝白筛选法识别重组子，靶基因可在lac启动子下表达，插入片段的阅读框与lacZ－α肽基因的阅读框一致时能进行融合表达。

1.4设计原理选择PUC18作为载体，选择EGFP基因作为目的基因。

首先用引物18F－E（sense）和18A－2（anti－sense）扩增pEGFP－N1中的EGFP基因，扩增产物纯化后除去引物和Taq等杂物，然后用EcoRI（G↓AATTC）和BamHI（G↓GATCC）双酶切，同时载体pUC18也进行相同的双酶切。

载体和靶基因的酶切液分别纯化除去小片段，再利用t4DNA连接酶把两个分子在体外连接起来构成重组DNA分子。

二实验方法“。

”４”１技术路线１．１质粒构建藉弼丈学矮士学柱论定椽穗杰结果１质粒ｐＣＤＮＡ３．１“）和ｐＥＧＦＰ一１的双酶切鉴定ｐＣＤＮＡ３．１（＋）质粒经过ＢａｍＩｔＩ、ＮｏｔＩ双酶切后，电泳结聚（见阉ｌ一８）显示有一条５。

４Ｋｂ麓絷带，穰据ｐＣＤＮＡ３。

ｉ（＋）瘊粒酶窃图谱分析，该质救含有ＢａｍＨｌ和ＮｏｔＩ酶切位点各一个，经过双酶切后得到线性化载体ｐＣＤＮＡ３．１（＋）和另外一个很短的片段，电泳时这令缀籁静冀蔽燕出了璩瓣糖凝黢，最蘑凝胶上褥剿的条带聿誊合线往化载体ｐＣＤＮＡ３．１（＋）的长度，故可以验证所获质粒确为ｐＣＤＮＡ３．１（十）质粒。

ｐＥＧＦＰ－１蒺载经过８ａ硎ｉ、Ｎｏｔ｛瑟酶切鑫，电濠结莱（冕圈ｌ—Ｃ）鼹示有瓶条分别为３．５Ｋｂ卸０。

７Ｋｂ的祭带，根据ｐＥＧＦＰ—ｌ质粮酶切图谱分析，该质粒同样含商ＢａｍＨＩ和ＮｏｔＩ酶切位点各一个，经过载酶切籁得嚣露静蘩茜ＥＧＦＰ片段帮勇终一个鞍长豹的片段，电泳时凝胶上的条带符合鼹个片段的长度，数可以验证雕获质粒确为ｐＥＧＦＰ一１质粮。

豳ｌｐＣＤＮＡ３．１（＋）羊¨ｐＥＧＦＰ—ｌ质粒的酶切分毫斥Ａ：ＤＮＡ分子量标记：Ｂ：ｐＣＤＮＡ３．１（＋）质粒ＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩ舣酶切Ｃ：ｐＥＧＦＰ－ｔ矮粒ＢａｍＨ｛、Ｎｏｔ｛鼹酶鞠鞫ｊｌ｜大学疆士学盈论文撩谗杰２垂缣质粒ｐＣＤＮＡ３．１（＋）－ＥＧＦＰ的酶稍釜定重组厦粒ｐＣＤＮＡ３。

ｌ（＋）一ＥＧＦＰ经过ＢａｍＨＩ单酶切基，电溶结果（见图２一Ｂ）显示有一条单一的６．１Ｋｂ条带，根据ｐＣＤＮＡ３．１－ＥＧＦＰ强谱分析，该质粒含有单一的ＢａｍＨＩ酶切位点，全长为６．１Ｋｂ左右。

耋组质粒ｐＣＤＮＡ３．１（＋）～ＥＧＦＰ经过ＢａｍＨｌ、ＮｏＬＩ双酶切蜃，电泳结果（见网２一Ｃ）显示有两条分别为５．４Ｋｂ和０．７Ｋｂ的条带，符台线赣ｐＣＤＮＡ３。

ｌ（十）载体和ＥＧＦＰ片段的长发，故可以验证所较质粒确为耋缀质粒ｐＣＤＮＡ３，ｌ《＋）－ＥＧＦＰ。

增强型绿色荧光蛋白原核表达载体的构建及其表达刘华伟;张宏;孙超;王庆贺;宋艳瑞【摘要】In this study, EGFP was cloned into pGEX-4T-l vector to construct prokaryotic expression vector pGEX-4T-EGFP, the recombinant plasmids were transformed into E.coli BL21 (DE3) and induced with IPTG for protein expression, then the EGFP protein was detected by UV irradiation and SDS-PAGE. It can be used to provide a new report gene and selective marker for prokaryotic expression system.%以EGFP为标记基因,原核表达质粒pGEX-4T-1为载体,成功构建重组质粒pGEX-4T-EGFP,并将其转入大肠杆菌BL21 (DE3).用IPTG进行诱导表达,通过紫外照射和SDS-PAGE检测其在大肠杆菌中的表达情况,为原核表达系统提供新的报告基因和筛选标记.【期刊名称】《西北农业学报》【年(卷),期】2012(021)002【总页数】4页(P103-106)【关键词】EGFP;克隆;重组质粒;原核表达【作者】刘华伟;张宏;孙超;王庆贺;宋艳瑞【作者单位】西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】Q786绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是源于多管水母属等海洋无脊椎动物的发光蛋白，其在蓝光或紫外光下可发出明亮的绿色荧光，可以作为报告基因检测蛋白的特异性表达或进行细胞定位研究。

杆状病毒表达系统制备的重组禽腺联病毒的鉴定作者：崔潇婷顾玲玲吴萌张继玲王安平来源：《江苏农业科学》2019年第05期摘要：为对杆状病毒表达系统制备的重组禽腺联病毒进行生物学特性的鉴定，将含GFP 报告基因及AAAV两侧末端重复序列的重组杆状病毒rBac-GFP、表达AAAV结构蛋白的重组杆状病毒rBac-VP、表达AAAV功能蛋白的重组杆状病毒rBac-Rep以感染复数为5，同时感染摇瓶培养中的昆虫细胞Sf9，72 h后收集细胞沉淀，反复冻融3～5次后，离心取上清。

经滤膜过滤、氯仿抽提和PEG沉淀后，进行电镜观察和Western blot分析，并体外感染鸡成纤维细胞和鸡肝细胞系。

SDS-PAGE结果显示，rAAAV得到了较好的纯化，电镜下可观察到大小约20 nm的典型细小病毒样粒子，Western blot分析数据显示rAAAV由3个结构蛋白组成，与野生病毒相似。

体外表达试验结果显示，rAAAV能介导GFP报告基因在鸡细胞中稳定持久地表达。

表明杆状病毒表达系统制备的rAAAV具有与野生病毒相似的性质，可应用于后继研究和开发应用。

关键词：重组禽腺联病毒;杆状病毒表达系统;鉴定中图分类号：S852.65;; 文献标志码： A; 文章编号：1002-1302（2019）05-0153-03收稿日期：2017-11-21基金项目：国家自然科学基金（编号：31302096）;江苏省科技支撑计划（编号：BE2013415）;江苏省六大人才高峰项目（编号：NY-009）。

作者简介：崔潇婷，女，江苏如皋人，讲师，主要从事兽用生物制药的研究。

E-mail：419445466@。

通信作者：王安平，博士，副教授，主要从事兽用生物制药的研究。

E-mail：wap4017@。

腺联病毒（adeno-associated virus，AAV）又称腺病毒相关病毒，作为一种新型的病毒载体，与其他重组病毒载体相比较，具有对宿主没有致病性、免疫原性极低、宿主范围广、表达时间持久等优点[1]，因此被认为是一种比较理想的基因转移载体，目前广泛地用于基因治疗和基因工程疫苗等方面的研究。

携带hTERT-P2A-EGFP基因的真核表达质粒的构建及鉴定目的构建真核表达质粒pRRL-hTERT-P2A-EGFP,探讨重组质粒在HEK293FT细胞中的表达和转染效率。

为进一步研究hTERT基因的功能及构建永生化细胞系奠定基础。

方法真核质粒pRRL-hTERT-P2A-EGFP的构建:(1)以pBABE-puro-hTERT和pRRL-EGFP质粒为模板利用PCR技术分别扩增目的基因hTERT、P2A和EGFP,对PCR产物进行胶回收纯化。

(2)以凝胶回收的3个目的片段为模板,采用重叠PCR 法获得目的片段hTERT-P2A-EGFP。

(3)载体pRRL-与目的片段hTERT-P2A-EGFP酶切处理后进行重组反应。

(4)重组质粒的序列测定和定点突变,设计含有突变位点正确碱基的引物,利用FastDigestDpnⅠ,进行定点突变。

真核质粒pRRL-hTERT-P2A-EGFP的鉴定:(1)复苏冻存的HEK293FT细胞,并进行传代培养。

(2)经脂质体介导重组质粒转染到HEK293FT细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白在细胞中的表达。

(3)利用流式细胞仪检测重组质粒在HEK293FT细胞中的转染效率。

(4)四质粒系统包装病毒,利用lipo2000将已合成的所需质粒转染到293FT细胞系中,收集病毒进行浓缩、滴定、流式检测,从而获悉病毒滴度及感染力。

(5)重组病毒感染人胚胎肝脏细胞后,提取细胞RNA,RT-PCR法检测细胞hTERT基因的表达水平。

结果1.PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果显示目的基因hTERT、P2A和EGFP的片段分别为3500、110和720bp,与预期结果一致。

2.目的基因片段hTERT-P2A-EGFP的电泳结果约4300bp,与预期片段大小一致。

3.测序结果显示,目的基因1547位点发生了突变。

利用定点突变技术成功诱变,再次测序后目的基因序列与GenBank公布的基因序列完全一致。

通用腺伴随病毒载体的构建及表达报告基因GFP的实验研究郑国玺，韦俊荣，祝康，侯瑾，施典羽，朱嘹亮，杨广笑，王全颖【关键词】重组腺伴随病毒；载体；报告基因；基因医治；NIH3T3摘要：目的构建基因医治通用型腺伴随病毒(AAV)载体并检测其转染外源基因作用。

方式利用限制性内切酶切除pSSV9int质粒中的AAV病毒Rep和Cap基因元件后，插入了重组腺病毒专用穿梭质粒pACCMVpLpA的含有CMV启动子、多克隆位点(MCS)和多聚腺苷酸信号(PolyA)的表达盒，构建了重组AAV通用载体质粒pSSHGCMV。

在该质粒MCS插入绿色荧光蛋白(GFP)基因后，利用pSSHGCMVGFP、GFP140和pAAV/Ad三种质粒共转染293包装细胞，制备GFP重组AAV。

应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度，并将该病毒感染新生大鼠NIH3T3细胞，荧光显微镜观看GFP表达。

结果重组AAV的滴度在浓缩前可达2×1011cfu/mL，浓缩后可达2×1013cfu/mL，说明成功地构建了重组AAV载体。

插入外源基因GFP后，在包装病毒和辅助质粒的联合作用下，能产生具有感染性的重组AAV。

感染了重组GFPAAV的大鼠NIH3T3细胞表达了明显的GFP荧光。

结论构建的重组AAV通用载体pSSHGCMV 可转染外源基因，这为进一步的基因医治奠定了基础。

关键词：重组腺伴随病毒；载体；报告基因；基因医治；NIH3T3Construction of a gengeral adenoassociated virus vector and GFP expression in rat NIH3T3 transduced by the rAAV vectorABSTRACT: Objective To construct a universal adenoassociated virus (AAV) vector and to detect the ability of the rAAV vector to transfer gene into the target cell. Methods By using recombinant technique, the gene elements of AAV Rep and Cap genes between ITRs of pSSV9int- plasmid were replaced by expressing cassette in pACCMVpLpA plasmid, a recombinant adenovirus shuttle vector. The expressing cassette included a CMV promoter, a multicloning sites (MCS) and a polyA signal. The new plasmid constructed was named pSSVHGCMV, which was a universal adenoassociated virus (AAV) vector. After GFP report gene was inserted into MCS of the plasmid, the rAAV vector expressing GFP, pSSVHGCMVGFP plasmid, have been constructed and then it introduced into 293 cell by method of Ca3(PO4)2 using three plasmids of pSSVHGCMVGFP, pGF140 and pAAV/Ad. After the cell was transfected for 72h, the rAAV was harvestd and the titrations of rAAV stocks and rAAV concentrated were detected by dotblot test using digGFP probe. The GFP expression in ratNIH3T3 was observed by fluorescence microscop after the cell was infected for 24, 48 and 72h. Results Titration of rAAV stock produced using new rAAV vector and procedure ranged between 1×1011 and 2×1012 total practicles/mL, and it was increased 100 times in rAAV concentrated than it did in rAAV stock. The NIH3T3 infected rGFPAAV expressed significantly GFP fluorescence, which showed that rGFPAAV was infectious virions. Conclusion The rAAV vector constructed in this paper, pSSHGCMV plasmid, can transfer exterior gene into the target cell using proceeding of recombinant AAV and it may be used in research of gene therapy.KEY WORDS: recombinate adenoassociated virus; vector; report gene; gene therapy; NIH3T3感音神经性耳聋是现今危害人类健康的重大疾病。

IL-7和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体的构建宁昌;余长林;李建军;胡锴勋【期刊名称】《现代肿瘤医学》【年(卷),期】2011(19)12【摘要】Objective:To construct the adenoviral vector co - expressing interleukin - 7( IL -7 ) and enhanced green fluorescent protein( EGFP),to lay a experimental foundation for further study on the infection into stem cell. Methods: The target gene IL -7 was cloned into the shuttle plasmid expressed the report gene EGFP. Then the re-combinant shuttle plasmid was transformed into Dh5a bacteria to recombine with backbone vector pAdxsi. Next,the plasmid pAd - EGFP - mIL7 was amplified in H293 cells and purifired, then the viral titer was determined. Results: The recombinanted shuttle plasmid pShuttle - EGFP - mIL7 digested with restriction endonucleases was confirmed by two products which length were respectively about 0. 5kb and 5. 1kb; the recombinanted plasmid pAdxsi - EGFP -mIL7 digested with restriction endonucleases was confirmed by seven products which length were respectively about14K,11.8K,3. Lkb,2.66kb,2.47K,1.45K and 0.6K; recombinant adenoviral amplifired with titer of 2×l010pfu/ ml. Conclusion: The recombinant adenoviral vector pAdxsi - EGFP - mIL7 was successfully constructed.%目的:构建白细胞介素7(IL-7)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)共表达的重组腺病毒载体,为进一步感染干细胞奠定基础.方法:将目的基因IL-7克隆到含有报告基因EGFP的穿梭质粒中,然后再将构建的重组穿梭质粒转移至pAdxsi载体中,构建重组腺病毒载体质粒,继而在H293细胞中扩增,纯化后测定病毒滴度.结果:pShuttle-EGFP-mIL7重组穿梭质粒经酶切鉴定得到0.5kb和5.1kb 2条带;pAdxsi-EGFP-mIL7重组腺病毒载体质粒经酶切鉴定得到14K、11.8K、3.1kb、2.66kb、2.47K、1.45K、0.6K 7条带;TCID50法测定纯化后的病毒滴度为2×1010pfu/ml.结论:pAdxsi-EGFP-mIL7重组腺病毒载体构建成功.【总页数】4页(P2401-2404)【作者】宁昌;余长林;李建军;胡锴勋【作者单位】解放军161医院肿瘤科,湖北,武汉,430010;解放军军事医学科学院附属307医院血液科,北京,100071;解放军总政治部门诊部,北京,100011;解放军军事医学科学院附属307医院血液科,北京,100071【正文语种】中文【中图分类】R730.4【相关文献】1.双表达人Arid5a及报告基因eGFP的重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 王顺娟;夏海滨2.HIF-1α和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 李永明;吕刚;范仲凯;曹阳;王岩松;庄培袁;张玉强;李刚3.HIF-1α和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 李永明;吕刚;范仲凯;曹阳;王岩松;庄培袁;张王强;李刚;4.VEGF121和BMP2双基因共表达重组腺病毒载体的构建及其在HEK293中的表达 [J], 栗刚;吴秀成;钟声;王巍;李媛;刘丹平5.血管内皮生长因子121和骨形态蛋白2双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 钟声;刘丹平;刘素伟;李晓禹;李谌;李媛因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

血管生成素1和报告基因EGFP双基因共表达腺病毒的构建孟国林;段春光;刘建;吕昌伟;杨旻;袁志;胡蕴玉【期刊名称】《第四军医大学学报》【年(卷),期】2008(029)011【摘要】目的:构建并制备血管生成素-1和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体.方法:采用基因克隆技术克隆目的基因ANG-1,并将得到的基因亚克隆至含有报告基因EGFP的穿梭载体pAdTrack-CMV;使用Padeasy-1腺病毒系统将含有目的基因的穿梭载体与腺病毒骨架质粒在细菌BJ5183中同源重组,产生重组腺病毒载体;线性化重组的腺病毒转染入QBI-293A细胞中对重组的腺病毒进行包装并扩增. 结果:ANG-1基因与腺病毒穿梭载体连接成功,经Xho I/EcoR V双酶切后琼脂糖电泳可见在1.5 kb处出现特异性条带,证明pAdTrack-CMV-ANG-1重组质粒构建成功;重组的穿梭载体与pAdeasy-1质粒重组后,产物经Pac I酶切后琼脂糖电泳可见一大一小两个片段. 大小约为30 kb和4.5 kb,与预期结果相符,证明重组腺病毒pAd-ANG-1-EGFP构建成功;线性化重组的腺病毒转染入QBI-293A细胞后包装成功. 扩增后病毒滴度为2×1014 v.g./L,EGFP活性检测腺病毒感染细胞阳性率在30%以上. 结论:成功制备了pAd-ANG-1-EGFP腺病毒. 为骨组织工程血管化的研究打下基础.【总页数】3页(P1002-1004)【作者】孟国林;段春光;刘建;吕昌伟;杨旻;袁志;胡蕴玉【作者单位】第四军医大学西京医院骨科,陕西,西安,710033;第四军医大学西京医院骨科,陕西,西安,710033;第四军医大学西京医院骨科,陕西,西安,710033;第四军医大学西京医院骨科,陕西,西安,710033;第四军医大学西京医院骨科,陕西,西安,710033;第四军医大学西京医院骨科,陕西,西安,710033;第四军医大学西京医院骨科,陕西,西安,710033【正文语种】中文【中图分类】R743.32;Q782【相关文献】1.VCAM-1和EGFP双基因共表达重组腺病毒的构建 [J], 司英健;张曦;陈幸华;刘耀;高蕾;高力;张诚;彭贤贵;王庆余2.双表达人Arid5a及报告基因eGFP的重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 王顺娟;夏海滨3.IL-7和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体的构建 [J], 宁昌;余长林;李建军;胡锴勋4.HIF-1α和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 李永明;吕刚;范仲凯;曹阳;王岩松;庄培袁;张玉强;李刚5.HIF-1α和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 李永明;吕刚;范仲凯;曹阳;王岩松;庄培袁;张王强;李刚;因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。