流式细胞术常见实验分析课件

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《流式细胞术贝克曼》课件

贝克曼流式细胞仪的应用
免疫学研究
贝克曼流式细胞仪在免疫学研究中广泛应用，可以用于检测免疫细胞的表面标志物、功能活性以
及免疫细胞的分选和培养等。
血液学研究
贝克曼流式细胞仪可以用于血液学研究，检测血细胞的表面标志物、血型抗原等，以及进行血细
胞的分选和培养等。
肿瘤研究
贝克曼流式细胞仪可以用于肿瘤研究，检测肿瘤细胞的表面标志物、肿瘤抗原等，以及进行肿瘤
辐射安全
废弃物处理
正确操作仪器，避免对实验人员造成辐射伤害。
按照规定处理实验废弃物，确保实验室环境的安全和环保。
贝克曼流式细胞仪的特点
高通量
贝克曼流式细胞仪具有高通量的特点，能够在短时间内处理大量细胞样本，提高了实验效率和检
测速度。
高灵敏度
贝克曼流式细胞仪采用先进的光电检测技术，能够检测到微弱的荧光信号，具有高灵敏度，能够检测到低浓度的细胞标记物。
多参数分析
贝克曼流式细胞仪可以同时检测多个参数，包括细胞大小、颗粒性、荧光信号等，从而对细胞进行多维度的分析和分选。
贝克曼流式细胞仪的原理
流式细胞术原理
流式细胞术是一种在液流中快速检测和分选细胞的技术。通过将单个细胞与荧光染料结合，利用激光束激发荧光，并通过光电倍增管检测荧光信号，实现对细胞的快速分析和分选。
贝克曼流式细胞仪的原理
贝克曼流式细胞仪是应用流式细胞术的仪器之一，其原理是将待测细胞与荧光染料结合后，通过高压液流将细胞送入流动室，在流动室内与激光束相遇，激发荧光信号，并通过光电倍增管进行检测和记录。
用于检测精子细胞和卵子细胞的活性与质量。
流式细胞术的发展历程
20世纪70年代

流式细胞分析精品PPT课件

Keylab of Medicine School of Su
Zhou University
6
流式细胞仪发展的历史
• 起源: 1934年--- 细胞计数仪
• 雏形: 1949年--- Coulter 计数器
•
1959年--- B型Coulter计数器
•
1972年: BD(Becton-Dickinson)
• ④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
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Zhou University
5
• 概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流
技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。FCM目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。
Zhou University
12
Keylab of Medicine School of Su
Zhou University
13
高流速适用于定性测量，如免疫表型。样本流变宽，细胞间距离缩短，这样在单位时间内流经激光照射区的细胞数量增加，可以快速获取数据。
低流速促使样本流变窄，单个细胞得以依次通过，这样大多数细胞可流经激光束的中心，细胞受激光照射的能量比较均一，因而低流速适用于检测分辨率要求高的实验，如DNA分析。
选出来，并且可将单个或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或板上，同时可选配多种波长和类型的激光器，适用于更广泛更灵活的科学研究应用。
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Zhou University
3
●流式细胞仪实物
BD-Calibur
BD FACSVantage

流式细胞术课件

b.荧光抗体标记：使用同厂家、同批次抗体，足量、足程标记，抗体过少或过量均会出现问题.
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FCM使用注意事项
c.减少非特异染色：充分洗掉未结合抗体，使用间标抗体注意非特异背景干扰（如Fc受体）.
d.每批、每步实验条件要一致：如PBS、PH值、温度等 .
e.未固定样本在2h内，固定样本24小时内测定完毕：避免荧光强度衰减
完成仪器设置、数据获取、统（实习1）
1.开机
2.运行FACSComp：监测仪器工作状态并记录数据
3.建立获取模板
4.调出FACSComp生成的仪器条件 5.条件优化：用阴性和单阳性样本确定电压、补偿和域值，确定获取的目的细胞数＞10000 6.确定存储数据的地址
7.记录数据
8.分析数据：建立分析模板-调出已存储的原始数据-调整 Gate(门)或 Region(区域)-设置Marker(标尺)-显示象限统计框（Quadrant Stats） -打印分析数据
对计数绝对值
2）ProCOUNT：造血干/祖细胞自动化分析，报告CD34+细胞 3）HLA-B27分析软件：血液T淋巴细胞HLA-B27定量分析 4）ReticCOUNT：网织红细胞自动化分析
6
BD仪器软件
5）ModFit软件：DNA周期、倍体和凋亡的自动或手动分析 6）QuantiCALC：荧光定量分析，报告每个细胞抗体结合量（ABC），要检测白细胞表面分化抗原和细胞活化指标 7）PAINT-A-GATE：多维参数资料分析，同时分辨显示多个细胞群体 8）ATTRACTOR软件：多参数资料的自动快速批量分析
22
23
•DNA分析时，FSC、SSC和FL2都应使用线性模式采集信号。
•调节FL2的电压，使FL2-A的G1期细胞的峰位于200道数的位置上。

流式细胞术实验技巧及数据分析ppt课件

FITC+T red
488
568
FITC+PeCy5 488
FITC+ ECD
488
F+P +PeCy5
488
F+ ECD +PeCy5 488
F+P +PeCy5 +APC 488
633
525 、575
绿色、橙色
525
绿色
615
红色
525、 675
绿色、红色
525、 625
绿色、橙红色
525、575、675
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流式细胞术操作流程：
培养细胞新鲜组织石蜡包埋
单细胞悬液制备
荧光抗体标记
上机检测
表型测定细胞分选
统计学分析
FISH PCR
继续培养
18
单分散细胞
19
FSC
FSC信号的强弱与细胞的大小和活力相关
20
SSC
SSC信号的强弱与细胞内颗粒多少相关
21
细胞散色光信号
22
排除双联体细胞
27
细胞阻滞在G2M期
28
双克隆细胞周期分析
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BrdUrd和DNA双标记染色
溴脱氧尿嘧啶核苷( Bromodeoxyuridine， BrdUrd )是胸苷的一种类似物。它可以替代
胸腺嘧啶掺入到细胞新合成的DNA分子中，成为S 期细胞的一种标记物。流式细胞术采用抗BrdUrd 单克隆抗体免疫荧光和PI双参数检测细胞，不仅可检测一个细胞群体的动力学参数和DNA含量，同
层流是液体稳定流动的必要条件,管道中层流的形成要满足雷诺数

流式细胞术原理及应用通用课件

抗菌药物敏感性测试
通过流式细胞术可以检测细菌对抗菌药物的敏感性，为临床合理用药提供科学依据。
05 流式细胞术的数据分析与解读
数据文件类型与读取方式
FCS文件
流式细胞术数据文件常用FCS格式，可以使用专业软件（如FlowJo、Cytobank 等）或编程语言（如R、Python等）读取和处理。
快速检测。
多参数分析：可同时检测细胞的多个参数，如大小、形态、
内部结构、表面抗原等。
灵活性：可根据研究需求灵活调整检测参数和实验方案。
流式细胞术的应用范围
01
02
03

04
05
基础医学研究
临床医学诊断
用于细胞生物学、免疫学、辅助临床疾病的诊断、病
遗传学等领域的基础研究，情评估和疗效观察，如白
历史发展
起源：流式细胞术起源于20世纪60年代，当时为了满足生物医学研究中对细胞快速、准确分析的需求。
技术发展：随着激光技术、计算机科学和生物学的不断进步，流式细胞术逐渐发展成为一项高精度、高通量的细胞分析技术。
技术原理与特点
技术原理
液态样本流动：将细胞悬浮于液体中，形成细胞悬液，通过微管道连续流动。
数据读取方式
数据读取方式分为文件导入和实时获取两种。文件导入方式是将存储在硬盘中的 FCS文件导入到分析软件中，而实时获取方式则是通过流式细胞仪与电脑连接，直接将数据获取到分析软件中。
数据预处理与质量控制
数据清洗
去除噪声、杂质和不必要的信号，以减少分析时的干扰和误差。
补偿调整
对于多色荧光染色，需要进行荧光补偿调整，以消除荧光染料间的交叉干扰。
多模态流式细胞术
多模态流式细胞术允许在单个平台上整合多种检测技术，如荧光共振能量转移（FRET）、质量细胞术等，从而提供更丰富的细胞信息。

流式细胞术在临床血液学ppt课件

*
*
*
AML-M4/M5
两型表型相似，但M4较M5表达更多的CD34（＋），CD45-SSC图上，不成熟细胞出现在单核区，重要的表型为CD13、CD33、HLA-DR、CD14和CD15，CD33可表达强于CD13。
*
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AML-M6
特征不明显，HLA-DR，CD34、CD13、CD33、CD19、CD22、CD5、CD7等均阴性，CD45－SSC图显示主要为CD45阴性区域为红系成份，高表达CD71。
*
*
AML-M2
M2与M1的主要区别是成熟度增加，原始细胞减少，CD15表达较M1显著，CD34弱于M1。 CD45-SSC图显示从髓系blast区至成熟骨髓细胞区的连续细胞带，CD45－SSC图有助于确定blasts比例。
*
*
AML-M3
高颗粒性，表现为较高的SSC，多数情况HLA-DR阴性或表达很少，CD34少于M2、一般CD13弱于CD33，大多表达CD117。 M3v低颗粒性，表现为较低的SSC。
CD80 CD86
CD80、CD86表达率（%）
*
对照组B淋巴细胞MHC-Ⅰ与MHC-Ⅱ表达
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CpG2006诱导B淋巴细胞MHC-Ⅰ与MHC-Ⅱ表达
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CpG2216诱导B淋巴细胞MHC-Ⅰ与MHC-Ⅱ表达
*
CpG诱导B淋巴细胞MHC分子表达
MHC-Ⅰ MHC-Ⅱ
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流式细胞仪基本工作原理
光路系统液路系统电路系统
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流式细胞仪光路图
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外周血FSC-SSC点图
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荧光信号（FL1、FL2、FL3）
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滤光片
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CD8-CD28+

实验九流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期时相资料讲解ppt课件

在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确
二、实验原理（continued）
膜联蛋白检测法
基于形态学观察的染色法基于DNA 片断化的检测法
细胞凋亡检测方法
Caspase酶分析法
流式细胞仪定量分析法
在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确
四、实验步骤
• 收集对数生长期细胞接种于6孔培养板中，每孔1.9mL（含4×105细胞）。 • 培养过夜后，加入不同浓度的药液100μL，对照组加入同体积的高糖DMEM
液。 • 作用不同的时间后，离心收集细胞，PBS洗涤2次，体积分数为0.70的乙醇-
20℃固定24h以上。 • 离心洗去乙醇，细胞重悬于PBS中，1,500r/min，离心5min去PBS后加PI染
二、实验原理（continued）
在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确
二、实验原理（continued）
在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确
仪器：流式细胞仪，细胞培养设备，离心机，水浴，冰箱材料：Hep-2细胞，离心管，封口膜，微量移液器，Tips 试剂： 70％乙醇（保存于4℃），RNase-A （10mg/ml,-
20℃保存），PI （650µg/ml，避光保存于-20℃）， PBS(pH 7.4，保存于4℃)
在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确

流式细胞术(免疫学检验课件)

Region设置 Gate设置
第四节 FCM的临床应用
一、淋巴细胞亚群分析
淋巴细胞是机体免疫系统中的一群重要细胞群，是执行免疫功能和参与免疫调节的免疫活性细胞，主要分为T细胞、B细胞和NK细胞3大类。
不同淋巴细胞表达的CD抗原都有独自的抗原特性，在临床疾病发生过程中对各淋巴细胞的CD抗原进行测定，对于判断机体免疫功能状态、了解免疫相关疾病的发病机制具有十分重要的意义。
最常用的方法是酶消化法、机械法、化学处理法和表面活性剂处理法等。
（四）石蜡包埋组织单细胞悬液制备
该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应用范围，有利于进行临床回顾性研究和利用。
常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂脱蜡法和甲氧-双氧水处理法。
石蜡切片一般适宜厚度是40μm~50μm，脱蜡须彻底，获取组织后，用酶进行消化处理，消化时间不宜过长，以免细胞核被消化溶解，经过滤、漂洗后即可获得单细胞悬液。
三、三参数直方图
三维坐标均为参数（散射光或荧光）而非细胞数
对复杂的细胞亚群观察更为直观、准确，但对其数据的统计分析较难
四、多参数组合分析
FCM常常需要分析三个以上的参数，但软件技术能够无法显示四维空间结构。
随着FCM多色荧光信号检测的发展，所得到的荧光信号和散射光信号需根据需要进行组合分析以获得所需的信息。
SSC信号的强弱与细胞内颗粒结构的质量成正比，用于检测细胞内部结构属性
前向散射光示意图细胞大小
结构复杂程度
侧向散射光示意图
血
液
白
细
胞
粒细胞
散
点
单核细胞
图
淋巴细胞
荧光信号：由待检细胞上标记的特异性荧光染料受激光激发后产生。

流式细胞术精品PPT课件

4
四、流式细胞术的应用
1 细胞DNA含量检测：
细胞固定后用PI染色，因为PI特异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI 的结合量呈良好的线性关系，根据这个原理，并通过专用的DNA分析软件，可测出细胞的DNA含量。用于细胞周期、细胞倍体以及凋亡的检测。
5
• 肿瘤诊断：
•
DNA异倍体的出现是癌变的一个重
• 一、流式细胞术的概念流式细胞术（FCM）就是对在的鞘
液包括下的细胞、粒子进行分析和分选的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧光标记的。其特点是测量速度快，每秒钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进行多参数测量，另一特点是在分析的同时可把具有指定特征的细胞分离出来，这就是分选技术。
1
二、流式细胞仪的工作原理
产生及发展，现在CD系统已有247种之多。
细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用
流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析
出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性
细胞的CD分子的相对含量。标记的方法一
般用直标法，也可用间标法。荧光探针多
为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、
APC等。
9
淋巴细胞分类：
•
红细胞表面CD59缺失
18
5 细胞内蛋白的分析：
•
细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧
光标记，用流式细胞仪进行测量分析，同表型
分析一样，可以测量出这种阳性细胞的数量和
这种蛋白的相对含量。并且，结合细胞表型分
析，进行多标记和多参数分析，可以检测出含
这种蛋白的细胞是属于哪一种表型的细胞。多
用间标法，荧光探针多为FITC。也可以与周期
27
•
流式细胞仪对一个样品提供的结果是否可

流式细胞仪结果分析课件PPT

何形成单个细胞流）
免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片技术是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对不同检测物的乳胶微球混地结合，经激光照射后不同待测特产生不同颜色，并可进行定量分析。
易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性
光束成形器：两十字交叉放置的透镜
前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0. 乙醇或甲醇保存法（2周）
区阈（region, R）与门(gate, G ) 是两个相关的概念，区阈可与门对应，但是也可以包含于门。用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。 D3 CD4- /CD3-
• 多参数分析免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片技术是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入
二维等高图光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
流式细胞仪常检测的细胞特性（二）免疫荧光染色的质控
假三维等高图假三维等高图
由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。三、免疫胶乳颗粒技术的应用
• 三参数直方图同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的未标记单抗作为对照调整和设置电压，以保证特异性。
同型对照为免疫荧光标记中的阴性对照，可使荧光标记单抗的信号保持其特异性。流式细胞仪的基本结构：
• 双参数直方图:点图光束成形器：两十字交叉放置的透镜
流式细胞仪分析中前向散射光、侧向散射光和荧光的检测意义。用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。

流式细胞仪分析技术应用ppt课件

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荧光抗体的选择
种属来源：人 •正常造血干细胞分选标记：Lin-CD34+CD38CD45RA-CD90+CD49f+Rholow •白血病干细胞的分选标记：CD34+CD38-CD71CD90-CD117-CD123+CD96+CD47+ 种属来源：鼠 •F正lk2常- 或造者血干Li细n-S胞ca分-1选+c-标Ki记t+C: LDi1n5-S0c+aC-D1+4c8--Kit+CD34•SMcaL-1L--cA-KFi9t+ACMDL1白6/3血2+病CD干3细4+胞或的c-分K选it+G标r-记1-: Lin•BCR-ABL CML 白血病干细胞的分选标记: LinSca-1+c-Kit+
胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。
7
第二节数据的显示与分析
• 参数：FS,SS,FL • 数据显示方式（单参数直方图、双
参数散点图、二维等高图、假三维等高图、三参数散点图） • 设门分析技术
8
一、参数
FS：反映颗粒的大小 SS：反映颗粒的内部结构复杂程度 FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少
液流断裂成液滴
空白液滴不充电
弃去
含细胞的液滴充电
偏转落入收集器
6
（二）分选的技术要求
• 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬
液中细胞的含量成正比。
• 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞
的百分率。
• 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过
测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。

流式细胞术ppt课件

可区分高FL细胞与低FL细胞。一般的流式细胞仪装有一个激光光源（488nm），可
测出三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪装有三个激光光源（488nm、633nm和407nm），可测出13个FL。
2、荧光信号
双色直接染色
二、荧光染料的选择
选择荧光染料要考虑: 1、流式细胞仪配置的激光可否激发该荧光染料； 2、流式细胞仪可否检测该荧光染料的发射波长； 3、使用多种荧光染料时，要考虑荧光染料之间的干扰。
二、荧光染料的选择
颜色补偿
➢荧光染料的发射波长范围一般宽于检测器检测到的波长范围；检测范围之外的波长可能会进入相邻的检测器被检测，从而造成荧光信号之间的干扰。流式细胞仪可以通过“颜色补偿”校正这一干扰。 ➢ 单标管用于调补偿。
Fluorescein (FITC)
300 nm
400 nm
Excitation
500 nm
Wavelength
Emisson
600 nm
700 nm
400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
Phycoerytherin (PE)
300 nm 400 nm
Excitation Emisson
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
FITC和PE荧光光谱
直接染色
间接染色
样品制备过程中常见的问题及解决对策
常见问题细胞密度低非特异荧光
强
碎片多细胞聚集
荧光弱
原因细胞损失抗体不纯、死细胞多
细胞死亡、机械损伤消化不完全
抗体少、反应时间短
解决对策增加离心时间、弃上清选择纯度高的抗体、用同型对照抗体或双标记排除非特

流式细胞术及其临床应用课件(1)

光源与光学系统
➢ 激发光源 ➢ 光学系统
信号收集与光电转换系统
计算机与分析系统
细胞分选与浓缩系统
激发光源滤光片
流动室、鞘液和样本流
信号检测器
计算机分析
（二）激光光源与光学系统
（一）激发光源：激光器
气体激光器：氩离子(488nm、355nm)、氦氖(633nm)、氪离子 (647nm)、氪氩(568nm)；
（四）计算机和分析系统
十字门
线性门
流式细胞仪特点
流式细胞术的最大特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获得多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选
细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量
目前国内主要流式细胞仪厂家 Beckton Dickinson(BD) BACKMAN COULTER
淋巴细胞亚群分析
试剂：BD Multitest IMK Kit 标本：外周血（常用）配色：CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC
（三）荧光信号
目前常用FCM配置（BD Calibar） 488nm激光管常用染料有第一通道（FL1）：FITC (Fluorescein Isothiocyanate) 第二通道（FL2）：PE (Phycorey- thrin) 第三通道（FL3）：PerCP (Peridinin Chlorophyll Protein) PE-Cy7、PE-Cy5、 PerCP-Cy5.5 633nm激光管常用染料有
1
10
2 700
3 720
4
15
……
Counts
0…………101…………102…………103

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结果分析
用488nm激发，黄光和绿光通道收集荧光信号，调补偿纠正绿色荧光（单体）和黄色荧光（聚合物）的重叠部分。线粒体膜电位采用比例法，即根据绿色荧光与黄色荧光阳性百分率之比。
Ratio=G.M./Y.M. 比值升高，膜电位降低，膜受损。
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2.2 DNA含量检测与周期分析
2.2.1 DNA倍体分析——PI染色法 2.2.2 S期特异性检测 2.2.3 M期特异性检测
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2.2.1 DNA倍体分析——PI染色法
基本原理：
细胞周期与DNA含量变化极其FCM分析直方图
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AnnexinⅤ -FITC单染
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优缺点：
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2.1.3 线粒体膜电位法
1.2 样本采集文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
edit WL
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结果分析
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——Guava原软件分析
H
A
W
Red-A
Red-A
Red-W
Red-W
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在用第三方软件分析之前，请将流式结果按如下所示导出。
结果分析
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基本原理：
线粒体膜电位下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。
JC-1：亲脂性阳离子荧光染料，特异性地与线粒体内膜结合，膜电位高时呈聚合体，膜电位低时呈单体。
正常细胞凋亡细胞
488nm
+
-
+
-++
+
-+
590nm
488nm +
-+
529nm
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2. 四种常见流式细胞术
2.1 细胞凋亡的检测与分析
2.1.1 PI单染法 2.1.2 Annexin-Ⅴ-PI双染法 2.1.3 线粒体膜电位法
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1. Guava easycyte 8HT 操作流程
2. 四种常见流式细胞术
❖ 细胞凋亡的检测与分析 ❖ DNA含量检测与细胞周期分析 ❖ 胞内活性氧水平的检测与分析 ❖ 细胞表面分子的检测与分析 ❖ 组合实验
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凋亡启动
凋亡早期
凋亡晚期
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2.1.1 PI单染法
基本原理： • 正常细胞DNA含量：2n~4n • 凋亡细胞：核内DNA断裂，乙
醇固定后膜通透性增加，小片段DNA穿膜丢失，胞内DNA含量减少。PI染色后，荧光强度减小而形成一个DNA含量小于 2n的分布区（亚G1峰）。
• 1.3 分析
见具体实验的分析。
• 1.4 关机
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1.5 日常维护
保持空气干燥，会使激光器的使用寿命长一些。桌面不要有震动，以免光路发生偏移。上机前检查废液瓶是否已满，若已满或将满请倒掉，用超纯水冲洗两
遍，放回原位；洗涤液瓶若已空或将空请补满（ICF：ddH2O=1：4）。实验台面保持整洁，废物缸请及时倒掉。自己的东西实验后请收走，
磷脂酰丝氨酸（PS）能与连接素 Ⅴ（AnnexinⅤ）发生特异结合； PI是核酸荧光染料，不能透过正常细胞膜，只能进入已经破损的细胞膜。
正常细胞：膜完整，PS不外翻——PI-/AnnexinⅤ凋亡早期：膜完整，PS翻转——PI-/AnnexinⅤ+ 凋亡晚期：PS外翻，膜通透性增加——PI+/AnnexinⅤ+ 坏死细胞：膜严重破损，PS不外翻——PI+/AnnexinⅤ+
流式专用的物品请不要带走。做完请记得登记。每周在周一进行一次easycheck。
（自己在做实验之前也可进行easycheck，流程见下面。）
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easycheck
微珠：10μL（用前震荡混匀） Buffer：190μL
操作方法与结果分析见细胞周期部分。
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优缺点：
• 优点：简便，快捷，价廉，应用普遍。
• 缺点：
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2.1.2 Annexin-Ⅴ-PI双染法
基本原理：
1. Guava easycyte 8HT 操作流程 ——Incyte模块
1.1 开机-清洗
（原则：先开仪器后开软件，开机必清洗）
1.2 采集样本 1.3 分析 1.4 关机
（原则：先关软件后关仪器，关机前必清洗）
1.5 日常维护
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几乎不存在膜结构——PI+/AnnexinⅤ-
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结果分析
阴性对照
PI
Annexin Ⅴ-FITC
PI/Annexin Ⅴ-FITC
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荧光交叠
荧光补偿原理