利用流式细胞术分析细胞周期时相(精)

流式细胞术检测细胞周期流式细胞术在许多题中常用到，但对其结果的分析却不是很清楚。

在此收集点相关资料并以实验中的一张图片为例，大家共同学习。

图中白色箭头及尾部G1,G2,S是我用PS加上去的，方便讨论。

首先来认识下图：1.纵坐标Cell Number：即计数到的有效细胞数；2.横坐标DNA Content：即DNA量，为什么用DNA量来区别各周期我们等下再讲；3.G1、G2、S三期在上图已经用箭头标示；4.右侧数字含义：Mean G1=195.4即G1期DNA含量平均值为195.4；%G1=73.6即G1期细胞数占总数的73.6%；以此类推……下面从细胞周期的角度看各参数的意义：1、细胞周期指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，所需的时间叫细胞周期时间。

可分为四个阶段（见图）：①G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间；②S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期；③G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间；④M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。

2、从增殖的角度来看，可将高等动物的细胞分为三类：①连续分裂细胞，在细胞周期中连续运转因而又称为周期细胞，如表皮生发层细胞、部分骨髓细胞。

②休眠细胞暂不分裂，但在适当的刺激下可重新进入细胞周期，称G0期细胞，如淋巴细胞、肝、肾细胞等。

③不分裂细胞，指不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞，如神经、肌肉、多形核细胞等等。

细胞周期的时间长短与物种的细胞类型有关，如：小鼠十二指肠上皮细胞的周期为10小时，人类胃上皮细胞24小时，骨髓细胞18小时，培养的人了成纤维细胞18小时，CHO细胞14小时，HeLa细胞21小时。

不同类型细胞的G1长短不同，是造成细胞周期差异的主要原因。

3、流式细胞结果图各参数的意义：前面讲过，常用的流式细胞术分析细胞周期的方法是依据细胞DNA含量（横坐标）来分析的：G1期：细胞DNA复制还没有开始，也是DNA含量最少的，即流式检测结果图的第一个峰；S 期：细胞开始复制，到完成复制，是一个一倍DNA到二倍DNA的过程，在流式结果图中显示期跨度特别大（第二个不高但很宽的峰）；G2期：DNA复制完成至分裂的一段时间，此时细胞内含二倍DNA，在流式结果图中的第二个峰；M期：细胞分裂过程，此时细胞内也是二倍DNA，用DNA含量的方法是无法与G2期分开，所以有第三峰明显升高时报告：G2/M期阻滞。

流式细胞术测定细胞周期一、实验原理碘化丙锭（PI）可以与细胞内DNA和RNA结合,采用RNA抑制剂将RNA 消化后,通过流式细胞术检测到的与DNA 结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA 含量的多少。

由于细胞周期各时相的DNA 含量不同,通常正常细胞的G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N),而G2/M期具有四倍体细胞的DNA 含量(4N),而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。

因此,通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时,可以将细胞周期各时相区分为G1/G0期,S期和G2/M 期,并可通过Multicycle软件计算各时相的百分率。

值得注意的是, PI不能通过细胞膜完整的细胞(如活细胞和早期凋亡细胞) ,在标本制备时,必须先用乙醇或其他破膜剂增强细胞膜的通透性,才能使PI进入细胞内与细胞内的核酸结合。

乙醇通常为终浓度为70%的冷乙醇。

二、实验准备1、试剂胰酶、PBS、纯乙醇（4℃）、RNase A、Triton X-1002、主要器材300目尼龙过滤网三、实验步骤1、每个样品细胞数不得少于100万。

2、胰酶消化，收集细胞（贴壁细胞）或1000rpm离心5分钟直接收集细胞（悬浮细胞）。

3、4℃ PBS洗一次，将细胞重悬于0.3ml 4℃ PBS，加入0.7ml 4℃的纯乙醇，将枪头伸入液面下，轻轻打入乙醇，轻柔混匀两次，4℃固定过夜。

4、1000rpm离心5分钟，去上清，加入染色缓冲液PI染色缓冲液：50 μg/ml PI0.1 mg/ml RNase A0.05% Triton X-100总体积1ml/样品，37℃孵育40分钟。

5、1000rpm 离心5分钟，小心去除上清，加入1ml PBS，轻柔混匀，300目过滤，上机检测。

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流式细胞术检测细胞周期
1. 纵坐标Cell Number：即计数到的有效细胞数；
2. 横坐标DNA Content：即DNA量，为什么用DNA量来区别各周期
3. G1、G2、S三期在上图已经用箭头标示；
4. 右侧数字含义：Mean G1=19
5.4即G1期DNA含量平均值为195.4；%G1=73.6即G1期细胞数占总数的73.6%；
①G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间；
② S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期；
②G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时
间；④ M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。

③
3、流式细胞结果图各参数的意义：
前面讲过，常用的流式细胞术分析细胞周期的方法是依据细胞DNA 含量（横坐标）来分析的：
G1期：细胞DNA复制还没有开始，也是DNA含量最少的，即流式检测结果图的第一个峰；
S 期：细胞开始复制，到完成复制，是一个一倍DNA到二倍DNA 的过程，在流式结果图中显示期跨度特别大（第二个不高但很宽的峰）；
G2期：DNA复制完成至分裂的一段时间，此时细胞内含二倍DNA，在流式结果图中的第二个峰；
M期：细胞分裂过程，此时细胞内也是二倍DNA，用DNA含量的方法是无法与G2期分开，所以有第三峰明显升高时报告：G2/M期阻滞。

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流式细胞术检测细胞周期的原理及技术流程哎呀，这可是个不简单的活儿啊！今天我们就要聊聊流式细胞术检测细胞周期的原理及技术流程。

话说这个方法可是科学家们研究细胞生长和分裂的重要工具呢，那咱们就好好聊聊吧！咱们得明白什么是细胞周期。

简单来说，就是细胞从一个生命周期阶段到另一个阶段的过程。

就像人一样，从出生到长大再到老去，每个阶段都有不同的特点和任务。

而细胞也是这样，它们也有自己的生命周期，从分裂开始，到分化成不同的细胞类型，再到死亡或修复损伤。

如何知道这些细胞在什么时候开始分裂、什么时候结束呢？这就需要用到流式细胞术了。

流式细胞术的原理其实很简单，就是通过激光或其他光源对细胞进行照射，然后利用特殊的摄像头捕捉不同颜色的荧光染料标记的细胞。

这些荧光染料会因为细胞内部的某些分子而发光，所以我们可以通过观察荧光的颜色和强度来判断细胞的状态和位置。

咱们就来看看流式细胞术的技术流程吧。

第一步，准备工作。

先要把待检测的细胞样本准备好，然后把它们稀释到一定浓度，这样可以让更多的地方都能看到荧光信号。

接着，要把样品放到流式细胞仪上，这里有一个小技巧：要尽量让样品均匀分布，这样才能保证检测结果的准确性哦！第二步，激光照射。

这时候要用到激光器或者其他光源对样品进行照射。

记住啊，这个过程一定要快，否则荧光信号可能会减弱或者消失。

不过不用担心，现在的流式细胞仪都设计得很聪明，能够自动调整激光功率和时间长度，以获得最佳的检测效果。

第三步，数据采集。

照射完成后，流式细胞仪就会自动记录下每个荧光信号的位置、强度和持续时间等信息。

这些数据会被传输到电脑上进行分析和处理。

别看这步骤听起来简单，实际上需要非常高的精度和速度才能做到哦！第四步，数据分析。

这一步主要是通过软件对收集到的数据进行分析和比对，找出其中的规律和异常情况。

比如说，我们可以通过观察不同细胞的荧光信号强度来判断它们的生命周期阶段；也可以通过比较不同样品之间的荧光信号差异来寻找潜在的疾病标志物等等。

流式细胞仪用于细胞周期分析细胞周期生物学基础细胞的生成依赖于细胞的割裂而产生两个子代细胞的进程。

在割裂进程最需要复制并传递给子代细胞的是细胞核，因为它包括了细胞的遗传信息载体-DNA。

在绝大多数情形下，一个生物体的每一个细胞都含有相等的DNA物质和相同成份的染色体。

因此，细胞在割裂前必需复制DNA如此它的子代细胞就可以够拥有与父代相同的DNA含量。

细胞由DNA含量增加至割裂，再由它的子代继续复制并割裂，那个进程称之为细胞周期。

在细胞周期中最具特征性的阶段是在割裂前的DNA含量增加并达到2倍量的时候，并在现在细胞开始割裂其自身-有丝割裂期。

细胞周期中这两个循环步骤通常以一字母来表示：S期（合成期）和M期（有丝割裂期）。

当细胞周期中的S期和M期被概念后，咱们可观察到在有丝割裂完成后和DNA合成刚开始之时有短暂的停顿或间隙，一样的停顿或间隙存在于DNA合成期后和有丝割裂开始之时。

这两个间隙咱们将之命名为G1和G2期。

如此整个细胞周期可划分为G1 →S →G2 →M →G1，如下图所示：图1显示了细胞周期中个环节在流式细胞仪上分析时的图谱特征当细胞没有进入割裂进程时（咱们机体中的绝大部份细胞），它们处于细胞周期的G1期的位置上。

因此G1细胞在数量上绝对是居各期细胞之首并在流式图谱上形成最高的信号峰。

在G1期细胞中有一群细胞特别安静而且没有进入细胞循环的任何生物学特征，咱们称这些细胞为G0期细胞。

一些发生在G1和G2期细胞内的生物进程现还不完全明了。

处于G1期的细胞已开始为割裂前的DNA的复制和细胞成长预备许多RNA和蛋白分子。

处于G2期的细胞则会修复在DNA复制进程发生的错误并识别出在M期时将DNA平均等分的切割位置。

细胞循环中这些阶段的长度因细胞种类的不同而不同。

典型细胞循环中各期的进展时刻为：G1期12小时，S期6小时，G2期4小时及M期小时。

分析和流式细胞术细胞周期分析流式细胞最初的应用之一即是检测细胞的DNA含量，它可快速将细胞循环中的其它阶段与有丝割裂期区别开来。

细胞周期的检测目录一、背景知识二、实验设计原则三、实验操作步骤四、实验结果分析一、背景知识1、细胞周期：G0/G1二倍体S二倍体---四倍体G2/M四倍体细胞周期(cell cycle)是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程。

共分为静止期(GO期)、DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)与分裂期(M期)。

在细胞周期的各个时期，DNA的含量随各时相呈现出周期性的变化。

通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以检测细胞周期。

2、细胞周期常用的核酸染料1.碘化丙啶(Propidium Iodide, PI) 是一种可以嵌合到双链DNA和RNA 的碱基对中，并与之结合的荧光染料，无碱基特异性。

其与双链DNA结合后可以产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。

细胞内的DNA被PI染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量的测定。

PI不能穿透细胞膜而被排斥在活细胞外，但是可以穿过破损的细胞膜而对核染色。

可用于区分活、死细胞。

利用这一特性，通常与Calcein-AM、Hoechst 33258或Hoechst 33342等活细胞荧光探针一起使用，同时对活细胞和死细胞染色和鉴定，用于细胞凋亡相关的研究。

也可以用作多重荧光染色的复染剂，兼容于各种细胞标记技术，包括直接或者间接的荧光抗体检测，mRNA原位杂交，细胞结构特异性的荧光探针检测法以及组织染色。

PI的单独染色也可以进行细胞周期的检测。

PI的摩尔吸光系数相对比较低，但是其具有足够大的斯托克斯频移来同时检测核酸DNA和荧光标记抗体，只需要使恰当的滤片。

PI适用于荧光显微镜，共聚焦显微镜，流式细胞仪以及荧光计分析。

2.7-氨基放线菌素(7-amino-actinomycinD，7-AAD) 是一种核酸染料。

它不能通过正常细胞膜。

7-AAD同PI有着相似的荧光特性，但其发射波谱较PI窄，对其他检测通道的干扰更小，在多色荧光分析中是PI的最佳替代品。

细胞周期和DNA倍体流式细胞术分析细胞周期是指细胞从一个有丝分裂开始到下一次有丝分裂开始所经历的一系列连续的时期。

细胞周期通常被分为四个阶段：G1期（Gap1期，细胞生长期）、S期（DNA合成期）、G2期（Gap2期，前期细胞准备期）和M期（有丝分裂期）。

细胞周期具有非常重要的生物学意义，它决定了一个细胞的生长、分化和复制过程。

了解细胞周期的调控机制对于研究细胞增殖、肿瘤发生机制等具有重要的意义。

DNA倍体流式细胞术是一种通过荧光染料标记DNA，利用流式细胞术分析细胞DNA含量和细胞周期的技术。

该技术通过细胞破碎和DNA染色使细胞DNA可见，并将细胞通过流式细胞术导入流式细胞仪中进行分析。

DNA倍体流式细胞术可以帮助我们了解细胞的DNA含量和倍体状态，从而推测细胞的生活循环和增殖能力。

DNA倍体流式细胞术的主要步骤包括：1.细胞处理：将细胞收集并进行预处理，使其达到适宜测量的状态；2.细胞固定：使用适当的化学物质固定细胞，以便于后续的染色和分析；3.DNA染色：通过DNA染色剂（如荧光素染剂）染色细胞DNA，使其可见；4.流式细胞术：将染色后的细胞通过流式细胞仪分析流式细胞术；5.数据分析：根据细胞染色的荧光强度和形态学特征来判断细胞周期和DNA倍体状态。

细胞周期和DNA倍体流式细胞术在分析细胞生命活动和基因组复制状态方面具有广泛的应用前景。

首先，细胞周期和DNA倍体流式细胞术可用于研究肿瘤的发生和发展机制。

在肿瘤细胞中，由于基因突变等原因，细胞周期的调控失去平衡，细胞周期的不正常分布和DNA倍体异常常常出现。

通过检测细胞周期和DNA倍体状态，可以更好地了解肿瘤细胞的生物学特性，从而为肿瘤治疗提供理论依据。

其次，细胞周期和DNA倍体流式细胞术还可用于研究细胞分化和发育过程。

细胞分化和发育是多个细胞周期的连续进行，通过细胞周期和DNA 倍体状态的测量，可以揭示不同细胞类型的分化和发育过程的调控机制，进一步推测细胞分化和发育的时序和关系。

细胞周期检测方法细胞周期检测是指利用特定的实验方法和技术来研究和分析细胞的生命周期和不同阶段的变化。

细胞周期是指细胞从一个时间点开始进行DNA复制，到下一个DNA复制结束之间的时间段。

细胞周期检测方法可以帮助我们了解细胞的增殖、分化和死亡过程，并在生物医学研究中发挥重要作用。

本文将介绍几种常用的细胞周期检测方法。

一、流式细胞术流式细胞术是一种常见的细胞周期检测方法，通过利用细胞在流式细胞仪中流动时吸收和散射光的不同特性来分析细胞的周期。

在流式细胞术中，可以使用DNA 染料（如普罗津红或荧光素）将细胞的DNA染成不同浓度的颜色，根据DNA 含量的不同来分析细胞处于不同的细胞周期阶段。

此外，流式细胞术还可以利用蛋白标记和单克隆抗体来检测特定细胞周期蛋白的表达水平。

流式细胞术准确、快速、灵敏，可以同时检测大量的细胞，因此被广泛应用于细胞周期的研究和生物医学领域。

二、免疫荧光染色法免疫荧光染色法是一种利用免疫学技术和荧光探针对特定蛋白进行定位和分析的方法。

在细胞周期检测中，可以利用特定蛋白的表达来反映细胞处于不同的细胞周期阶段。

例如，细胞周期蛋白D（Cyclin D）在G1期表达增加，在细胞周期的S期和G2期表达较低。

通过使用与Cyclin D特异性结合的荧光探针，可以在细胞中观察和分析Cyclin D的表达情况，从而判断细胞处于细胞周期的哪个阶段。

三、细胞核酸染色法细胞核酸染色法主要利用染色剂（如乙锭、Hoechst33342等）染色DNA分子，观察和分析细胞核的形态和DNA含量的变化来判断细胞的细胞周期阶段。

在染色前后使用不同颜色的荧光染料来观察和分析细胞核的变化。

通过测量细胞核中DNA含量的变化，可以确定细胞处于细胞周期的哪个阶段。

此外，细胞核酸染色法还可以与流式细胞术或免疫荧光染色法相结合使用，进一步提高细胞周期的检测准确性和灵敏度。

四、蛋白质组学方法蛋白质组学方法是一种通过比较和分析细胞中蛋白质的表达、修饰和互作来研究细胞功能和生命周期的方法。

基于流式细胞术的细胞周期分析细胞周期是生命科学中一个非常重要的概念。

细胞周期指的是细胞在生命周期中的一次分裂过程的全过程，包括从细胞生长、DNA复制到细胞分裂等一系列过程。

细胞周期的控制与细胞的增殖和分化、肿瘤的发生和发展密切相关。

因此，研究细胞周期对于我们深入了解生命活动、疾病发生机制以及治疗等方面都有着重要意义。

细胞周期的研究手段有很多，其中流式细胞术技术是一种经典且重要的方法。

流式细胞术是一种将细胞悬浮液通过装置推进以获得细胞个体某些特征的技术，它可以同时获得大量的细胞特征信息，包括细胞的大小、形态、DNA含量等参数，并且可以对这些参数进行统计分析。

在细胞周期研究中，通过采用流式细胞术对细胞进行染色分析，可以准确测定细胞周期的各个阶段，对细胞周期的研究提供了非常有力的工具。

细胞周期可以分为四个主要阶段：G1期、S期、G2期和M期。

G1期为生长期，细胞的体积增大，蛋白质合成增加，准备进行DNA复制。

S期为DNA合成期，细胞的DNA复制分为前期和后期两部分，复制完成后，细胞核内将有两套完全相同的DNA序列。

G2期为后生长期，细胞生长和检查DNA复制的准确性。

M期为分裂期，包括前期、中期和后期三个分阶段。

其中中期时细胞染色体粘附到纺锤体纤维上并完成分离，后期时新核膜形成，染色体解缠并核质分划，两个新的细胞膜形成。

在细胞周期分析中，可以通过多种方法染色来区分不同时期的细胞。

例如，DNA染色剂如荧光素-二乙酸盐（PI）染色，可以区分G1期、S期和G2期细胞；利用蛋白质抗体标记技术可以检测细胞的分裂状态，还可以用流式细胞术探测特定分子（如细胞周期蛋白等）的表达量来分析细胞周期进程。

通过不同的染色方式，我们可以精准地区分不同的细胞周期阶段，实现对细胞周期的深入研究。

细胞周期研究的应用范围非常广泛。

在肿瘤学领域，流式细胞术被广泛应用于分析肿瘤细胞的分裂、生长特性和药物处理后的变化。

通过对细胞周期阶段特异性化合物的筛选，可以发现对某些恶性肿瘤的治疗非常有效的药物。

流式细胞仪检测细胞周期原理和方法流式细胞仪（Flow Cytometry）是一种现代生物学实验技术，主要用于检测和分析细胞的形态、结构、功能及其分子水平的变化。

它通过利用激光传感器探测透过细胞的激光散射或荧光信号，同时可以通过细胞的大小、荧光强度和荧光波长的变化将细胞分为不同的亚群。

流式细胞仪的使用已经广泛应用于细胞生物学、免疫学、肿瘤学、生殖医学等领域。

流式细胞仪检测细胞周期的原理主要基于细胞的DNA含量不同于不同细胞周期阶段。

细胞周期通常分为G1期（细胞生长期）、S期（DNA复制期）、G2期（前期）、M期（有丝分裂期）和G0期（休止期）。

在细胞周期中，细胞会通过分子调控机制从一个阶段进入到下一个阶段。

细胞在G1期，其DNA含量为单倍体（2N）。

G1/S转变时，细胞准备开始进入DNA复制期（S期），在S期中，细胞的DNA含量翻倍，达到二倍体（4N）。

接下来，细胞进入G2期，准备进入有丝分裂期（M期），在M期，细胞的DNA含量达到四倍体（8N），细胞核开始分裂。

而G0期，则代表细胞处于休眠或未分裂状态，DNA含量不变（通常是2N）。

1.细胞样本制备：首先需要制备良好的单细胞悬浮液，通常通过细胞消化酶处理细胞集落或组织样本，将细胞分散为单细胞。

同时，还要对细胞进行化学固定或冷冻处理，以保持其形态和结构的完整性。

2.细胞染色：将细胞进行荧光染色或抗体标记。

如果使用荧光染料，可以直接将染料加入到细胞悬浮液中，使其与DNA结合。

如果使用抗体标记，先将抗体与细胞混合，然后再加入荧光二抗进行染色。

3.流式细胞仪检测：将样品注入流式细胞仪仪器中。

细胞悬浮液在仪器中通过微细管道流动，激光通过细胞悬液时，细胞会散射激光，形成散射信号。

同时，荧光标记的细胞也会发出荧光信号。

4.数据分析：通过流式细胞仪仪器，可以获取每个单个细胞的散射与荧光信号。

利用仪器中的分析软件，可以对细胞的散射与荧光信号进行分析和计数。

根据荧光信号强度，可以对细胞进行不同周期阶段的区分和计数。

细胞周期检测点的流式细胞术分析一、概述细胞周期检测点的流式细胞术分析是一种先进的生物学研究方法，它结合了流式细胞术的高通量、高精度特点与细胞周期检测点的关键生物学意义，为研究者提供了深入理解细胞生长、增殖和分化过程的强大工具。

细胞周期是指细胞从一次分裂结束到下一次分裂结束所经历的全过程，包括DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2期）以及细胞分裂期（M期）。

在每个周期阶段，细胞都会进行特定的生理活动，如DNA复制、蛋白质合成等。

而检测点则是细胞周期中确保各个阶段顺利进行的关键环节，它们能够监测并应对各种可能影响细胞周期进程的内外因素。

流式细胞术是一种可以对细胞进行快速、定量分析和分选的技术。

通过利用不同荧光物质标记的单克隆抗体，流式细胞术能够检测细胞周期中各个阶段的特异性标志物，从而实现对细胞周期的精确分析。

流式细胞术还具有高通量、高灵敏度和高准确性的优点，能够在短时间内处理大量样本，并获取丰富的数据信息。

细胞周期检测点的流式细胞术分析在多个领域具有广泛的应用价值。

在基础研究中，它可以帮助我们深入了解细胞周期的调控机制以及检测点在细胞周期中的作用在临床医学中，它可以用于诊断肿瘤、评估治疗效果以及预测疾病进展等在药物研发中，它可以作为筛选具有细胞周期特异性作用的药物的重要手段。

细胞周期检测点的流式细胞术分析是一种强大的生物学研究方法，它将为我们揭示细胞周期的奥秘提供有力的技术支持。

1. 细胞周期检测点的重要性细胞周期是生物体细胞生长、分裂和繁殖的基础过程，它确保了遗传信息的准确传递和细胞功能的正常维持。

在这个过程中，细胞周期检测点扮演着至关重要的角色。

检测点是细胞周期中的特定阶段，它们能够监测细胞内的各种条件和状态，确保只有在满足特定条件时，细胞才能继续其周期进程。

细胞周期检测点对于维护基因组稳定性至关重要。

在DNA复制和染色体分离的过程中，任何错误都可能导致基因突变或染色体异常，进而影响细胞的正常功能。

流式细胞仪检测细胞周期操作步骤取对数生长期的A549细胞，按1×106 cells/ mL以1mL接种于100mm培养皿内↓24h后，进行所需的处理（比如加药,照射）↓特定时间后终止培养，进行下一步的实验↓收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml离心管中↓1000rpm离心5min（短时低速离心）↓弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细胞悬液内的细胞碎片↓加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇，混匀后，于4℃固定30min,或-20℃长期保存。

↓1000r/min,离心5min↓将乙醇吸除，加PBS清洗混匀↓1000r/min,5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去↓吸除离心管内PBS，加入200ul PBS和2ul的RNA酶（0.25mg/ml）(37℃下孵育30min)↓加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min↓将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP管中（PI 具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标记EP管↓提前一天网上预约↓开机（先开仪器后开软件）↓流式细胞仪的结构一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。

↓检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上↓流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱↓液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（488nm激发光源）↓荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞DNA分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例）↓在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出结果分析——Modfit软件分析——Flowjo软件分析图片拷贝：直接Ctrl+CFCM-DNA量分析 1 个细胞增殖群时，可将DNA 含量分布组方图分为三部分，即 G0/1、S、G2M。

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流式细胞术检测细胞周期
1. 纵坐标Cell Number：即计数到的有效细胞数；
2. 横坐标DNA Content：即DNA量，为什么用DNA量来区别各周期
3. G1、G2、S三期在上图已经用箭头标示；
4. 右侧数字含义：Mean G1=19
5.4即G1期DNA含量平均值为
195.4；%G1=73.6即G1期细胞数占总数的73.6%；
1 G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间；
② S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期；
2 G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时
间；④ M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。

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3、流式细胞结果图各参数的意义：
前面讲过，常用的流式细胞术分析细胞周期的方法是依据细胞DNA含量（横坐标）来分析的：
G1期：细胞DNA复制还没有开始，也是DNA含量最少的，即流式检测结果图的第一个峰；
S 期：细胞开始复制，到完成复制，是一个一倍DNA到二倍DNA的过程，在流式结果图中显示期跨度特别大（第二个不高但很宽的峰）；
G2期：DNA复制完成至分裂的一段时间，此时细胞内含二倍DNA，在流式结果图中的第二个峰；
M期：细胞分裂过程，此时细胞内也是二倍DNA，用DNA含量的方法是无法与G2期分开，所以有第三峰明显升高时报告：G2/M期阻滞。

细胞周期同步化在细胞培养过程中，细胞多处于不同的细胞周期时相中，其中有少数细胞在进行有丝分裂活动，其余细胞分别处于G1、S和G2各期.不同时相的细胞对药物干预存在不同反应，会影响实验的重复性,因此，需要获得周期一致性的细胞。

利用细胞同步化技术可使细胞大量的处于同一细胞时期,并可获得该时期大量的物质，如细胞中期时的染色体.细胞周期同步化（synchronization）是指为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、基因表达或凋亡,借助某种自然或人为的实验手段，使细胞群体中处于细胞周期不同时相的细胞停留在同一时相（除了G0期的细胞）的现象.细胞同步化本质上包括用一定的方法获得一定数量的同步化细胞群和使细胞进入同步化生长的两层含义。

DNA 合成抑制法是通过抑制DNA合成将细胞同步于同一时期的方法。

高浓度TdR（胸腺嘧啶核苷)双阻断法是目前常用的抑制DNA 合成的同步化方法。

它可逆地抑制DNA 合成，而不影响其他时期细胞的转运,最终可将细胞群阻断在S 期或G1 /S 交界处。

其原理是：TdＲ是细胞DNA 合成不可缺少的前体，但向培养基中加入过量TdＲ，可形成过量的三磷酸腺苷，后者能反馈抑制其他核苷酸的磷酸化，从而抑制DNA 合成。

它将细胞同步于G1 /S 期交界处，同步化程度高，适用于任何培养体系，可将几乎所有的细胞同步化,但是容易产生非均衡生长，个别细胞体积增大.TdＲ双阻断法因为简单易行且可逆，在肿瘤药理方面对细胞周期同步化的实验中得到了广泛的应用。

羟基脲、5-氟脱氧尿嘧啶、阿糖胞苷、氨甲蝶呤和高浓度ADR、GDR也属于DNA合成抑制剂，它们与TdR作用相似，均可通过抑制DNA合成达到同步化的目的.中期阻断法是利用破坏微管的药物将细胞阻断在M期从而得到同一时期细胞的方法，常用的药物有秋水仙素等。

秋水仙素通过抑制微管的聚合,进而抑制有丝分裂装置的形成，将细胞阻断于有丝分裂中期然后再释放使细胞达到同步化。

中期阻断法非平衡生长问题不明显，但可逆性比较差,当阻断时间过长时,许多细胞产生异常分裂。