流式细胞术检测T细胞亚群

T细胞亚群的检测—免疫荧光法【申请单】请完成申请单所要求项目×××市人民医院检验申请单姓名性别年龄门诊号住院号诊断或症状检验标本检验目的送检科室医师送检日期年月日【方法选择】表1-1 T细胞亚群的检测方法方法流式细胞术免疫荧光法AP-AAP桥联酶免疫法√本次检查选择【材料准备】1.抗CD McaB、兔抗鼠IgG荧光抗体。

2.受检者肝素（或EDTA）抗凝静脉血。

3.含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液。

4.细胞分离液。

5.细胞计数板。

6.离心机、落射荧光显微镜。

【操作方法】1.取肝素抗凝血1.5ml，与等量生理盐水混匀，轻轻叠加在3ml细胞分离液上，转速2000r/min离心，离心时间20min。

吸取单个核细胞层（PBMC），用RPMI1640培养液洗涤，1000r/min离心2次，每次10min.弃上清，加入RPMI1640培养液，配成5×106/ml细胞悬液。

2.按厂家说明稀释抗CD McaB至工作浓度，取0.1ml，加等量步骤1制好的细胞悬液，混匀后，4℃下静置45min。

离心弃上清，再用洗2次，弃上清；3.配制合适浓度兔抗鼠IgG荧光抗体，取0.1ml加入步骤2制好的沉淀细胞中混匀，4℃下静置30min，用RPMI 1640培养液洗涤，800r/min离心3min，共洗3次。

吸弃大部分上清液，混匀沉淀细胞，滴于细胞计数板后荧光显微镜下观察。

【观察结果】在落射荧光显微镜下进行观察，计数200细胞，以荧光强度≥2为阳性，计算阳性细胞百分比率。

【注意事项】1.严格按厂家说明书配置工作浓度试剂。

2.注意控制实验环境温度。

3.按顺序加入试剂，按操作规程进行操作，避免造成误差。

4.检测完毕后应仔细核对、记录、避免笔误。

5.不同的检测方法结果参考值有区别，参考区间为：CD3+细胞：（71.5±6.2）％或65-80％，CD3+CD4+细胞：45.7±5.3％，CD3+CD8+细胞：27.9±5.0％，CD4+/CD8+:1.66±0.33。

流式细胞术检测肺结核患者血清T淋巴细胞亚群分析【摘要】目的：分析流式细胞术检测中肺结核患者血清T淋巴细胞亚群的改变。

方法：将2015年6月-2016年6月医院收治的100例肺结核患者进行流式细胞术检测，进行血标本采集，随后观察肺结核患者经过治疗后血清T淋巴细胞亚群的改变情况，并且与未患病者进行比较。

结果：初至活动性肺结核患者血清中CD4+、CD4+/CD8+降低，而CD3+、CD8+升高，与正常对照组相比，CD8+、CD4+/ CD8+差异有显著性（P <0. 05）；病变范围广泛者的CD3+、CD4、CD4+/CD8+ 较病变范围小者低，CD3+ 差异有显著性；痰菌阳性者与阴性者比较，CD4+/CD8+ 下降，CD8+升高，但差异无显著性（P >0. 05）。

结论：初治活动性肺结核患者的T 细胞亚群变化存在其自身特点。

对肺结核患者 T 淋巴细胞亚群的检测有助于判断病情、了解抗结核治疗效果。

【关建词】流式细胞术检测；肺结核；T淋巴细胞亚群肺结核是由结核杆菌感染引发的一种慢性传染性疾病，据相关资料表明，我国是高居第二位的结核病高负担国家。

肺结核早期临床表现及体征同其他相关肺疾病相似，易导致误诊或漏诊，进而使病情延误。

T淋巴细胞作为机体执行细胞免疫主要效应细胞之一，其亚群改变对肺部疾病的发生及发展具有直接影响，因此，对T淋巴细胞亚群水平予以相关检测，直接关乎到患者机体免疫功能改善、肺部疾病病情的临床诊断及治疗。

对此，现选取100例初治性肺结核患者，对其血清中T淋巴细胞亚群情况进行分析，相关结果总结并报告如下。

1 资料与方法1.1 一般资料（1）肺结核患者组：选取2015年6月-2016年6月医院收治的肺结核患者100例，其中男58例，女42例，年龄15-76岁，平均（43±2.85）岁，其中结核菌阴性56例，结核菌阳性44例。

诊断依据为：有结核中毒症状；X 线检查及CT 检查发现结核病灶，并提示结核活动；结核菌阳性者痰涂片、痰培养或气管镜刷检找到结核分枝杆菌；结核菌阴性者经诊断性抗结核治疗病灶吸收。

流式细胞术检测肺泡灌洗液T淋巴细胞亚群的诊断价值洪燕燕;杨芝红【摘要】目的探讨支气管肺泡灌洗液(BALF)中T淋巴细胞免疫活性对几种常见肺部疾病的临床诊断价值.方法选取该院2013-2015年住院患者61例,其中肺癌15例,肺结核10例,结节病13例,肺部感染15例,特发性肺间质纤维化(IPF)8例.流式细胞仪检测BALF中T淋巴细胞亚群水平.结果 CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+在肺癌组和结节病组变化最明显,与其他组比较,差异有统计学意义(P<0.05).肺癌组CD3+、CD4+下降,CD8+升高,CD4+/CD8+明显下降;而结节病组CD4+升高,CD8+降低,CD4+/CD8+明显升高.肺结核组与肺部感染组也表现为CD4+下降,CD8+相对升高,CD4+/CD8+下降,与结节病组及IPF组比较,差异有统计学意义(P<0.05).IPF组CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+均接近正常值.结论通过流式细胞技术检测BALF中T淋巴细胞亚群水平,在一定程度上可有效区分几种常见的肺部疾病,对了解患者免疫功能、疾病鉴别诊断及预后具有重要的临床价值.%Objective To evaluate the clinical diagnosis value of T-lymphocyte cell activenss in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)of patients with several common pulmonary diseases.Methods 61 cases of inpatients in this hospital from 2013 to 2015 were selected,including 15 cases of lung cancer,10 cases of pulmonary tuberculosis,13 cases of sarcoidosis,15 cases of pulmonary infection,8 cases of idiopathic pulmonary interstitial fibrosis(IPF).The levels of T lymphocyte subsets in BALF were detected by flow cytometry.Results CD3+,CD4+,CD8+ and CD4+/CD8+ were obviously changed in the group of lung cancer and sarcoidosis,the difference was statistically significant(P<0.05).In the group of lung cancer,CD3+ and CD4+were lowered,CD8+ was increased,and CD4+/CD8+ was significantly lowered.However,in the group of sarcoidosis,CD4+ was increased,CD8+ was lowered,and CD4+/CD8+ was significantly increased.In addition,in the group of tuberculosis and pulmonary infection,CD4+ was lowered,CD8+ was comparatively increased,and CD4+/CD8+ was significantly lowered,they were significantly different from sarcoidosis andIPF(P<0.05).In the group of IPF,CD3+,CD4+,CD8+ and CD4+/CD8+ were closed to normal value.Conclusion Detecting the level of T-lymphocyte subsets in BALF helps differentiating the above-mentioned pulmonary diseases effectively to some extent,thus it has important value in exploring the immune function of patients and disaese differential diagnosis and prognosis.【期刊名称】《检验医学与临床》【年(卷),期】2017(014)014【总页数】3页(P2051-2053)【关键词】流式细胞技术;肺泡灌洗液;T淋巴细胞亚群【作者】洪燕燕;杨芝红【作者单位】宁夏医科大学总医院,银川 750004;宁夏医科大学总医院,银川750004【正文语种】中文支气管肺泡灌洗检查可直接获取下呼吸道及肺泡上皮表面衬液，对其所含的炎性细胞、免疫细胞进行细胞计数和淋巴细胞亚群检测，可为肺部恶性肿瘤、肺结核、结节病、肺部感染及特发性肺间质纤维化(IPF)等疾病的鉴别诊断和疗效观察提供帮助[1]。

㊃短篇论著㊃温度㊁时间及抗凝剂对流式细胞术检测T淋巴细胞亚群的影响*任方刚1,张娜2,徐智芳1,张耀方1,张亚东3,覃艳红1,陈秀花1,王宏伟1ә(1.山西医科大学第二医院血液病分子诊疗山西省重点实验室,山西太原030001;2.山西医科大学第二医院检验科,山西太原030001;3.运城市第三医院检验科,山西运城044000)摘要:目的探讨流式细胞术检测T淋巴细胞亚群的理想温度,时间及抗凝剂㊂方法随机采集健康志愿者全血6份,分别用不同的抗凝剂抗凝,4ħ及室温(18~25ħ)保存,在不同时间点(0.5h㊁2h㊁5h㊁24h㊁36 h㊁48h及72h)分别使用荧光抗体标记,后上机检测;对同一份标本平行标记后,平分放于4ħ及室温,在不同的时间节点(0.5h㊁1h㊁3h㊁5h㊁7h㊁24h)检测C D3+T淋巴细胞㊁C D3+C D4+辅助性T细胞㊁C D3+C D8+杀伤性T细胞的阳性率及荧光强度㊂结果1h内上机检测,枸橼酸钠㊁肝素㊁乙二胺四乙酸,三者抗凝剂,避光与否,孵育温度(室温&37ħ)等因素对检测结果均没有明显影响;与E D T A抗凝,室温避光标记,40m i n内上机检测结果比较,标本室温保存时,C D3+T淋巴细胞和C D3+C D4+辅助性T细胞在48h时检测结果出现变化,而C D3+C D8+杀伤性T细胞在72h时出现变化;标本存放与4ħ,C D3+T淋巴细胞和C D3+C D8+辅助性T 细胞在2h时检测结果出现变化,而C D3+C D4+杀伤性T细胞在5小时时检测结果出现变化㊂标记后,无论标本存于室温还是4ħ,C D3+T淋巴细胞和C D3+C D4+辅助性T细胞在24小时时结果出现变化,而C D3+ C D8+杀伤性T细胞在1小时时就发生了变化㊂结论1小时内上机检测,抗凝剂,避光与否,孵育温度对检测结果无明显影响;抗凝标本应在室温保存,48h内完成检测;标记后标本应在1h内上机检测㊂关键词:流式细胞术;T淋巴细胞亚群;温度;时间;抗凝剂流式细胞术是一种集免疫学技术,单克隆抗体技术和计算机技术等技术为一体的实验室技术,是目前主要的微小残留病变监测的手段[1-2]T细胞亚群检测则是最常规的检测项目之一,而对于流式细胞术的质量控制却比较困难,除基本的每日f l o w-c h e c k校验光路,一定时间内地质控全血检测评价机器状态,定期的人员培训外,标本的预处理在质控环节中具有举足轻重的作用[3],特别是随着第三方检验实验室的日益增多,标本预处理在质控中的影响比重更加明显,如标本运送与储藏㊁标本质量㊁机器偶发故障等,均有可能导致流式检测结果的偏差或错误,因此,探讨科学规范的抗凝剂,标本保存温度和标记时间等标本处理规范有现实意义㊂1资料与方法1.1一般资料抽取空腹12h健康志愿者(即肝功能㊁肾功能㊁血脂㊁血糖㊁尿酸正常,血㊁尿㊁粪便常规正常,乙肝表面抗原阴性及体格检查正常者)外周静脉血,分为三份,分别使用乙二胺四乙酸二钾(E D T A-K2)㊁肝素和枸橼酸钠抗凝,其中男2例,女4例,年龄为24~28岁,中位年龄26岁㊂E D T A-K2抗凝静脉血均分两份,分别置于室温(18~26ħ)及4ħ保存,迅速进行预处理,平行标记标本后均分为处理3份,分别避光及不避光室温孵育和37ħ孵育,控制0.5h 内上机检测;3种不同抗凝标本进行平行避光标记处理,上机检测;分别对均分存放于室温(18~26ħ)及4ħ的E D T A-K2抗凝标本在2㊁5㊁24㊁36㊁48㊁72h等时间节点进行标记检测;E D T A-K2抗凝标本1h内标记处理完毕标本,均分为2份,分别至于室温(18~ 26ħ)及4ħ保存,在1㊁3㊁5㊁7㊁24h等时间节点进行上机检测,以上检测结果均与同一标本E D T A-K2抗凝,避光室温标记,0.5h上机检测标本的检测结果进行对比分析㊂1.2仪器试剂取12*75mm普通流式管,分别加入组合抗体C D45-F I T C/C D4-P E/C D8-E C D/C D3-P C5(B e c k m a n C o u l t e r美国,规格:50T,m o u s e I g G2b/I g G1/I g G1/I g G1)和C D45-F I T C/C D56-P E/ C D19-E C D/C D3-P C75(B e c k m a n C o u l t e r美国,规格: 50T,m o u s e I g G2b/I g G1/I g G1/I g G1),每种抗体各5μL,取抗凝全血各30μL分别加入各管,室温避光孵育15m i n,用o p t i l y s e C N O-w a s h l y s i n g s o l u t i o n (编号:A11895,B e c k m a n c o u l t e r美国)溶血试剂,裂解红细胞,10m i n后,用C y t o m i c s F C500流式细胞仪检测,使用C X P软件分析,S S C/C D45设门,获取10 000个淋巴细胞,分析淋巴细胞中各亚群的比例㊂1.3方法为保证实验结果的科学性,检测由同一名具有流式细胞仪操作培训资格认证的操作人员完㊃181㊃国际检验医学杂志2019年第40卷ZⅡ*基金项目:国家自然科学基金项目(81679126)㊂ә通信作者,E-m a i l:w a n g h w68@h o t m a i l.c o m㊂成,具体方法参照文献[3-4]㊂1.4统计学处理采用G r a p h p a d P r i s m5软件进行统计学分析㊂将3种抗凝剂㊁避光与否㊁不同储存条件下的标本及标记后标本的各个时间点的检测结果,分别同同一标本E D T A-K2抗凝,避光室温标记,0.5h 上机检测结果,若方差齐,进行配对t检验,否则进行非参数统计方法分析,P<0.05时认为有显著性差异㊂2结果2.1不同抗凝剂对分析结果的影响在1h内,对3种不同的抗凝剂抗凝的健康志愿者外周血标本,在平行实验条件下,对检测结果进行两两对比统计学分析,未发现明显差异(P>0.05)㊂2.2避光与否对分析结果的影响对同一份E D T A 抗凝全血标本置于两流式管,进行平行标记,一份避光孵育,一份不避光孵育,后于1h内上机检测,结果对比分析发现,无论是阳性细胞百分率还是平均荧光强度(M F I),两者之间均没有统计学差异(P>0.05)㊂2.3标本存放时间对检测结果的影响在不同的时间节点对标本进行检测发现,无论是室温还是4ħ保存标本,C D4和C D8分子的检测结果均在48h时出现显著性差异(室温:P=0.0085和P=0.0150,4ħ:P=0.0046和P=0.0174),而C D8分子则在2 h时就出现了显著性变化(室温:P=0.0109,4ħ: P=0.0013)㊂2.4标记后存放时间对检测结果的影响 E D T A抗凝标本,平行标记,避光孵育后,均分置于室温和4ħ,在不同的时间节点进行检测发现,在不同的存储条件下,C D4和C D3的检测结果,在24h内未出现显著性变化(P>0.05),而C D8的检测结果在1h时就出现了显著性变化(P<0.05)㊂3讨论流式细胞术以免疫学为基础,结合计算机㊁激光和光电转换等技术,用于对不同大小和荧光特征的细胞㊁细菌㊁囊泡等微粒进行快速定性及定量分析的一种技术,是临床诊断,预后评估的有用工具[1,5]㊂依据表面抗原的差异,可将T淋巴细胞分为细胞毒性C D8+T细胞㊁辅助性C D4+T细胞和调节/抑制性T细胞㊂作为T细胞表面受体的重要辅受体的C D4和C D8分子,能够特异性识别机体细胞的MH C,参与抗原递呈,与机体免疫防御功能密切相关[6-7],C D4+T细胞和C D8+T淋巴细胞的变化情况常被用来评价候选疫苗的免疫保护性以及监测疾病病情的发生㊁发展和转归[8-12],因此,国内使用流式细胞术对外周学淋巴细胞亚型进行分析,是临床最常见的项目之一㊂对于流式细胞术的质量控制的相关研究已有报道[4,13],然而国内关于标本的抗凝剂选择,标本的存储环境等报道较少㊂陈潇等建议各实验室应当以E D-T A-K2抗凝为宜,以18ħ的室温保存效果最好,3d 内检验结果与采集后1h内检验的结果差异无统计学意义[3-4]㊂本研究却发现,与0.5h内上机检测的E D-T A抗凝避光室温孵育的标本比较,3种临床常用的抗凝剂抗凝㊁避光与否㊁孵育温度等因素均对检测结果未发现明显影响,这可能和单克隆抗体及荧光偶联技术的不断优化和进步㊁复合型去红细胞试剂中所含细胞固定剂的使用有关㊂室温保存标本C D4+T和C D8+T细胞在48h时发生了显著性变化,而C D3+T细胞在72h时发生了变化,然而在4ħ保存标本时,C D8+T和C D3+T细胞在2h时发生了显著性变化,而C D4+T的检测结果在5h时也发生了变化,同时,我们还检测了C D4+T 的M F I,也得出了同样的结果,因此我们认为,标本应该储存于室温而不是4ħ,这与文献报道一致,而标本应于48h内检测完毕,而不是72h,这与文献报道不同[3]㊂机器的突发故障,人员的突发离岗等将会导致标记后的标本不能及时上机检测,因此标记后标本的储存条件及时效性,是实验室要关注的问题㊂本研究通过把E D T A抗凝标本,平行标记处理后,分别放于室温及4ħ,在不同的时间节点进行检测,结果与室温放置0.5h内上机检测结果进行对比,发现无论是室温与4ħ,C D4+T和C D3+T细胞的检测结果在24h 时发生了显著性变化,而C D8+T在1h时就发生了变化,未发现4ħ保存优于室温保存,这与文献不同[14]㊂标记标本能保持稳定,可能与溶血素中含有多聚甲醛(p a r a f o r m a l d e h y d e,P F A)成份的作用,这与文献报道一致[14-15],而C D8+T细胞的检测值在标记后很快就发生了变化,其机制还需要进一步探讨㊂本研究所用单克隆抗体均为荧光素-抗体直接藕联模式,而对于非荧光素直接偶联的单克隆抗体或复合抗体处理等标本,其结论如何,需要进一步研究㊂总之,对于使用流式细胞术检测外周血T细胞亚群,在0.5h内上机检测,3种常用抗凝剂抗凝㊁避光与否㊁孵育温度(室温&37ħ)㊁均对检测结果无明显影响,标本应储存于室温,并于48h内处理,标记后标本应储存于4ħ,C D4+T和C D3+T细胞的检测在24h时完成,C D8+T细胞检测在1h内完成㊂4结论利用流式细胞术检测T淋巴细胞亚群时,在1小时内上机检测,结果不受抗凝剂,避光与否,孵育温度等因素等影响;抗凝标本应在室温保存,48h内完成检测;标记后标本应在1h内上机检测,本研究结论仅局限于外周血T淋巴细胞亚群的检测,和相关文献有㊃281㊃国际检验医学杂志2019年第40卷ZⅡ相同也有差异的地方,也提示各实验室应建立自己实验室的流式细胞术S O P ,以保证流式细胞术结果的客观准确㊂参考文献[1]K e r s t G ,K r e y e n b e r g H ,R o t h C ,e t a l .C o n c u r r e n t d e t e c -t i o n o f m i n i m a l r e s i d u a l d i s e a s e (M R D )i n c h i l d h o o d a -c u t e l y m p h o b l a s t i c l e u k a e m i a b y f l o w c y t o m e t r y a n d r e s l -t i m e P C R [J ].B r J H a e m a t o l ,2005,128(6):774-782.[2]赵书涛,武晓东,王策,等.流式细胞仪的原理㊁应用及最新进展[J 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t淋巴细胞亚群测定检测内容淋巴细胞是免疫系统中的重要细胞群，包括T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞等。

其中，T淋巴细胞又可分为多个亚群，如辅助性T细胞（CD4+ T细胞）、细胞毒性T细胞（CD8+ T细胞）等。

这些不同的淋巴细胞亚群在免疫应答中发挥着不同的作用，具有重要的生理功能。

T淋巴细胞亚群的检测对于研究免疫功能的状态、诊断某些免疫相关疾病、评估治疗效果等具有重要意义。

通过测定T淋巴细胞的各个亚群的比例和数量，可以了解机体的免疫状态及炎症程度。

例如，在免疫抑制治疗后，CD4+ T细胞数量减少，容易导致感染的发生。

而在某些自身免疫性疾病中，CD8+ T细胞可能异常激活，导致炎症反应增加。

T淋巴细胞亚群的检测方法有多种，常用的包括流式细胞术、酶联免疫吸附法等。

这些方法在具体的实验室操作中都有一定的局限性，需要严格控制实验条件，确保检测结果的准确性和可靠性。

此外，对于正常值的确定和不同实验室之间的结果比对也是一个重要的问题，需要更多的研究和标准化操作的制定。

除了在科研领域中的应用，T淋巴细胞亚群的检测在临床诊断和治疗中也有着广泛的应用。

例如，在HIV感染者的监测中，CD4+ T细胞计数是评估疾病进展和治疗效果的重要指标之一。

通过监测CD4+ T细胞的数量，可以及时调整治疗方案，有效控制病情发展。

在肿瘤的免疫治疗中，T淋巴细胞亚群的检测也可以辅助判断患者的免疫状态，选择最合适的治疗方案。

在未来，随着免疫疗法的发展和个体化治疗的需求增加，T淋巴细胞亚群的检测将变得越来越重要。

我们需要进一步深入研究不同T淋巴细胞亚群在免疫反应中的作用机制，发现新的治疗靶点，并开发更加灵敏、准确的检测技术。

通过不断地探索和创新，我们可以更好地利用T淋巴细胞亚群的信息，为免疫相关疾病的诊断和治疗提供更好的支持。

nkt细胞流式指标
NKT细胞（自然杀伤T 细胞）是一类特殊的T细胞亚群，具有自然杀伤和调节免疫应答的功能。

流式细胞术（flow cytometry）是一种常用于分析和鉴定细胞表面标志物的技术。

以下是一些与NKT细胞相关的可能用于流式细胞术的指标：
1.CD3：
•CD3是T细胞的标志物，用于标识T细胞的存在。

2.CD4和CD8：
•CD4和CD8是T细胞的亚群标志物，可以帮助区分NKT 细胞的亚群。

3.CD56：
•CD56是自然杀伤（NK）细胞标志物，但在一些情况下也用于标识NKT细胞的亚群。

4.TCRαβ：
•NKT细胞通常表达特定的T细胞受体（TCR）亚基，如TCRα和TCRβ。

5.Vα24-Jα18和Vβ11：
•NKT细胞的一个亚群是Vα24-Jα18阳性，Vβ11阳性的细胞。

这两个标志物可用于区分NKT细胞亚群。

6.CD161：
•CD161（也称为NK1.1）是一种NK细胞和NKT细胞的标志物。

请注意，具体的NKT细胞流式细胞术指标可能会因研究目的、细胞来源、研究模型等因素而有所不同。

建议参考最新的研究文献和实验室方法以获取特定研究条件下的相关信息。