Immunocytochemical staining免疫细胞化学染色实验方法步骤

免疫组织化学染色原理和操作步骤一、免疫组织化学原理免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。

免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。

间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。

PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和2个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP 复合物孵育标本，最后用H2O2和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。

生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。

亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。

ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。

在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB 进行显色。

ABC法的敏感性较PAP法更高。

图1. 免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》）SP法与ABC法相似，其不同于ABC法之处在于用生物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶。

在标本孵育过一抗和二抗后，加入链亲和素标记的过氧化物酶使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。

与亲和素相比，链酶亲和素的结合力与亲和素相似而非特异性结合较亲和素低。

中国海洋大学实验报告姓名：常天易系年级：海洋生命学院2012级专业：生物科学科目：分子细胞生物学实验学号：12050011006培养细胞的有被小泡免疫细胞化学染色与观察一、实验目的（1）掌握免疫细胞化学染色的基本原理和步骤；（2）对成笼蛋白有被小泡在细胞内的形态和分布有直观认识。

二、实验原理用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。

免疫组织化学技术是根据抗原抗体反应和化学显色原理,组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。

常用的标记物有荧光素、酶和放射性同位素：①、标记荧光素的称为免疫荧光法，常用的荧光素有异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明(rhodamine)等。

②、标记酶的称为免疫酶法，常用的酶有辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)等。

③、标记同位素的称为放射免疫法，常用的同位素有3H、14C、32S和31P等。

本实验免疫酶法。

用辣根过氧化物酶标记的二抗，然后用DAB(3,3-二氨基联苯胺)作为辣根过氧化物酶的作用底物来显色抗原存在部位，可见棕黄色产物。

标记抗原与抗体主要有两种方法：直接法与间接法。

本实验使用间接法，原因：①、对抗原的特异性标记较好，可以减少未标记上的一抗的干扰②、可以放大结合紧密的一抗的信号。

三、实验材料：海拉系细胞，PBS缓冲液，0.5% Triton X-100 PBS，0.1%吐温20 PBS，一抗，二抗，含DAB的染液四、实验方法：将盖玻片长有细胞的一面朝上，在PBS中浸泡v弃去PBS 缓冲液，加入3.7%的甲醛PBS 缓冲液3ml ，固定10min 弃去甲醛PBS ，加入PBS 缓冲液浸泡10min 弃去PBS ，加入0.5% TritonX-100 PBS 缓冲液处理10min 弃去0.5% TritonX-100 PBS 缓冲液，用PBS 浸泡10min 弃去PBS ，加入含1％BSA 的PBS 溶液3ml ，室温温育10分钟 弃去BSA PBS 向盖玻片上滴加稀释好的第一抗体液，平稳地放入37℃温箱中温育30分钟使用0.1%吐温20的PBS缓冲液室温洗2次，每次5分钟弃去吐温PBS，向盖玻片上滴加稀释好的第二抗体液，平稳地放入37℃温箱中温育30分钟使用0.1%吐温20的PBS缓冲液室温洗2次，每次10分钟弃去吐温PBS，加入染色液3ml，暗处染色10min向载玻片上滴加甘油，将盖玻片长有细胞的一面朝下，轻轻放上盖玻片，在显微镜下观察五、实验结果：观察到海拉系细胞中有被小泡六、总结：１、为了放大第二抗体的信号以及增加其结合的特异性，本实验采取以下措施：①、在甲醛固定后，加入含1％BSA 的PBS 溶液3ml ，室温温育10分钟是为了结合盖玻片上所有未结合蛋白的位点。

免疫细胞化学染色在胸腹水沉渣物检测中的应用谢小林刘家斌欧阳海红（上栗县人民医院，江西上栗337009）【摘要】目的研究免疫细胞化学染色在胸腹水沉渣物检测中的应用效果。

方法回顾性分析2016年1月—2019年12月我院收治的40例疑似恶性肿瘤患者的临床资料，所有患者均行体液细胞学检测与免疫细胞化学染色。

根据临床检验结果对比分析两种检测方法的胸腹水诊断符合率。

结果免疫细胞学染色法诊断的胸腹水的符合率（90.00%）明显高于体液细胞学检测（67.50%），差异有统计学意义（P <0.05）。

结论免疫细胞化学染色可提高恶性胸腹水符合率，为临床诊断治疗提供可靠依据。

【关键词】胸腹水沉渣物免疫细胞化学染色体液细胞学检测诊断符合率Application of immunocytochemical staining in the detection of pleuroperitoneal fluid sediment Xie Xiaolin ，Liu Jiabin ，Ouyang Haihong.The People 鸳s Hospital of Shangli County ，Shangli ，Jiangxi 337009【Abstract 】ObjectiveTo study the application effect of immunocytochemical staining in the detection ofpleuroperitoneal fluid sediment.MethodsThe clinical data of 40patients with suspected malignant tumor whoadmitted in the hospital from January 2016to December 2019were retrospectively analyzed.All patients underwent humoral cytology test and immunocytochemical staining.The diagnostic coincidence rate of pleuroperitoneal fluid of the two detection methods was compared and analyzed according to the clinical test results.Results The diagnosticcoincidence rate of pleuroperitoneal fluid of immunocytochemical staining （90.00%）was higher than that of humoralcytology test （67.50%），and the difference was statistically significant （P <0.05）.Conclusion Immunocytochemicalstaining can increase the diagnostic coincidence rate of malignant pleuroperitoneal fluid ，which can provide reliablebasis for clinical diagnosis and treatment.【Key Words 】Pleuroperitoneal fluid sediment Immunocytochemical stainingHumoral cytology test Diagnoseaccordance rateDOI ：10.19435/j.1672-1721.2020.14.006院时间，费用更低，患者的心理、经济负担得以缓解。

免疫组织化学染色
免疫组织化学染色(Immunohistochemical Staining,IHC)是一种常见的组织学检测方法，用于确定细胞或组织中特定蛋白质的表达或位置。

这种技术实际上是将抗原源合成出抗体，利用免疫相互作用(两抗体一抗原)在细胞内或细胞外测定有无抗原物质。

这种技术有许多种变式，其中一种叫做实时双标定量免疫组织化学染色(RQ-IHC)，可以用来检测癌细胞内外的抗原表达。

染色十分具体：首先，切取患者的取样以供检测，然后将组织片放在真空显微镜的底部，将抗体滴在表面上并使其完全覆盖，然后将片子放置在一定温度的溶液中培养，以促成抗体和抗原之间的结合。

最后，借助细胞标记小分子，将抗原特异性滴在含抗体片上，以实现染色。

此外，还可以使用磁珠，是特殊磁性微球，将抗体带入抗原，从而改善抗体和抗原的结合，从而提高染色的特异性。

IHC 染色为临床检测提供了重要佐证，在临床组织活检及肿瘤监测中有着重要的作用。

它可以帮助医生的诊断和行医判断，帮助选择治疗方法，更好地控制肿瘤的发展，最大限度地减小病人的痛苦。

IHC 染色在其他方面也有重要应用，尤其是在器官移植和临床药物开发中，它能够有效提高细胞和组织质量，并帮助研究者准确地检测细胞和组织中蛋白质的表达。

通过IHC 染色，可以帮助我们准确了解细胞组织的结构和异常状态，从而改善对各种疾病的辅助检测、诊断和治疗。

这一技术为临床医生提供了坚实的诊断成果，给患者带来了良好的治疗效果。

免疫染色实验方法和步骤免疫染色(immunol staining)包括免疫荧光(immunol fluorescence)、免疫组化(immunol histochemistry)、免疫细胞化学(immunol cytochemistry)等，可以参考如下步骤进行操作。

1. 样品准备(Sample preparation)对于贴壁细胞：可以直接用多孔板，例如6孔板、24孔板等，培养细胞，然后到预定时间时进行固定等后续操作。

也可以用洁净的盖玻片，70%乙醇中浸泡后，用无菌的镊子放置到6孔板内，然后用无菌的生理盐水、PBS或培养液洗去残留的乙醇。

这时就可以种入细胞进行培养，待细胞贴在盖玻片上生长良好后，即可进行固定等后续操作。

对于悬浮细胞：把细胞先在固定液中固定，然后把细胞滴加在载玻片上，干燥后细胞会紧贴在载玻片上。

然后就可以进行后续操作。

如果细胞的粘附能力不佳，可以在载玻片上用PDL等物质进行处理，以增强载玻片的粘附能力。

对于冷冻切片：切片放置在载玻片上后，可以直接进行固定等后续操作。

对于石蜡切片：脱蜡：切片在二甲苯中脱蜡5分钟，再换用新鲜的二甲苯脱蜡，共用二甲苯脱蜡3次。

无水乙醇5分钟，两次。

90%乙醇5分钟，两次，70％乙醇5分钟，一次。

蒸馏水5分钟，两次。

抗原修复：根据不同的抗原和抗体，可以选择把切片放置在如下抗原修复液中，10mM柠檬酸钠，pH6.0，或1mM EDTA，pH8.0，或10mM Tris, pH10.0，95℃加热12分钟，大约在30分钟内缓慢冷却至室温。

2. 固定可以使用适当的固定液固定细胞或切片，例如碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)。

固定完毕后，可以用免疫染色洗涤液(P0106)洗涤两次，每次5分钟。

3. 封闭(Blocking)加入免疫染色封闭液(P0102)，封闭60分钟。

如果背景较高，可以4℃封闭过夜。

从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。

免疫组织化学及HE染色实验步骤免疫组织化学（immunohistochemistry，简称IHC）是一种用于检测组织切片中特定蛋白质的方法，其原理是通过特异性抗体识别目标蛋白质并将其可视化。

本文将介绍IHC实验的基本步骤和HE染色实验的步骤。

IHC实验步骤：1.组织切片制备：从取材到固定、包埋和切片，保证组织样本的质量和完整性。

2.抗原修复：将组织切片放入含有钠胼胝土缓冲液或其它抗原修复液中进行抗原修复。

可以选择使用高温或酶解等方法。

3.阻断非特异性结合：将组织切片浸泡在阻断液中，如BSA、牛血清蛋白等，以防止抗体与非特异性的蛋白质结合。

4.一抗孵育：将含有一抗的抗体溶液滴在组织切片上，孵育一段时间，使一抗与目标蛋白质发生特异性结合。

5.二抗孵育：选择与一抗宿主不同的二抗标记物，如荧光素、过氧化物酶等，将含有二抗的溶液滴在组织切片上进行孵育。

6.吸附剂清洗：将组织切片用洗涤缓冲液洗去未与标记物结合的二抗。

7.标记物检测：根据所选择的标记物，可以进行荧光显微镜观察、酶反应等，将目标蛋白质可视化。

8.盖片封装：将组织切片用适当的缓冲液封装至玻璃盖片上。

HE染色实验步骤：1.组织切片制备：从取材到固定、包埋和切片，保证组织样本的质量和完整性。

2.脱蜡：将组织切片放入甲醇中脱去石蜡包埋。

3. 染剂处理：将组织切片依次浸泡在嗜铬酸钾溶液中，漂洗后浸泡在碱性染剂中，如伊红（Eosin）染料。

4. 酸性染剂处理：将组织切片浸泡在酸性染剂中，如苏木红（Hematoxylin）染料。

5.脱染：将组织切片用酒精和醋酸溶液进行脱染。

6.脱水：将组织切片依次浸泡在酒精梯度中，脱去水分。

7.透明化：将组织切片逐渐浸泡在透明剂中，如苯酚乙醇、二甲苯等，使组织切片透明。

8.盖片封装：将组织切片用适当的透明剂封装至玻璃盖片上。

以上是免疫组织化学和HE染色实验的基本步骤。

通过这些步骤，可以标记和可视化组织切片中的特定蛋白质，进而获得研究和诊断所需的信息。

免疫组织化学（Immunohistochemistry，简称IHC）和免疫荧光染色（Immunofluorescence，简称IF）是两种常用的免疫细胞化学技术，用于在组织切片或细胞涂片上检测特定蛋白质或抗原的存在和分布。

这两种技术都依赖于抗体与抗原之间的特异性结合反应。

免疫组织化学是一种使用酶标记抗体来检测抗原的方法。

在这个过程中，首先将组织切片与特定的初级抗体（针对目标抗原的抗体）孵育，然后洗涤以去除未结合的抗体。

接下来，将切片与带有酶标记的次级抗体（针对初级抗体的抗体）孵育。

再次洗涤后，加入酶的底物，它会在酶的作用下产生颜色沉淀，使得抗原的位置在显微镜下可见。

常用的酶包括过氧化物酶和碱性磷酸酶。

这种方法的优点是可以产生永久性的记录，因为颜色沉淀是稳定的。

免疫荧光染色则涉及使用荧光染料标记的抗体来检测抗原。

在这个过程中，初级抗体和次级抗体都带有荧光标记。

当这些抗体与抗原结合时，它们发出的荧光可以在荧光显微镜下观察到。

这种方法的优点是可以同时使用多种颜色的荧光染料来检测多个不同的抗原，而且荧光信号通常比免疫组织化学的颜色反应更强。

两种技术都有其应用范围。

免疫组织化学常用于病理学诊断，因为它可以用于存档的组织样本，并且结果可以用常规显微镜观察。

而免疫荧光染色则更适合于研究目的，特别是在活细胞成像和多标记实验中，因为它可以提供更丰富的信息和更高的灵敏度。

总之，免疫组织化学和免疫荧光染色都是强大的工具，它们使得科学家能够在细胞和组织水平上可视化蛋白质的表达和定位。

选择哪种技术取决于实验的具体需求和可用的设备。

常用免疫组织化学染色方法免疫组织化学染色是通过将抗原与抗体结合来检测组织中特定蛋白质的染色方法。

它是现代生物医学中常用的一种技术，可以用于研究分子生物学、细胞生物学、病理学等领域。

以下是一些常用的免疫组织化学染色方法介绍：1. 免疫组化染色(Immunohistochemistry, IHC)：免疫组化染色是免疫组织化学中最常用的方法之一、其基本原理是使用一种与目标抗原特异性结合的抗体，将抗原与抗体结合，然后通过染色方法将表达该抗原的细胞或组织可视化。

常用的染色剂包括多聚酶、酶标、荧光素和放射性同位素。

IHC可以用于检测细胞表面抗原、细胞器中的抗原以及胞内蛋白质的定位。

2. 免疫荧光染色(Immunofluorescence, IF)：免疫荧光染色利用荧光标记的抗体来检测特定抗原。

它可以提供高度特异性和灵敏度的探测，可以用于研究蛋白质的亚细胞定位、蛋白质相互作用等。

利用该方法可以用于检测多种类型的标记（单标记、双标记、复合标记等），从而实现多重染色或共定位染色。

3. 免疫电镜染色(Immunoelectron microscopy, IEM)：免疫电镜染色是一种将金粒标记的抗体用于电子显微镜下观察并定位特定抗原的方法。

通过将金粒结合到抗原-抗体复合物上，可以在电子显微镜下清晰地观察到抗原的位置和分布。

这种方法具有高分辨率和高特异性的优点，广泛应用于超微结构的研究。

4. 免疫酶标染色(Immunoenzyme staining, IES)：免疫酶标染色是使用酶作为标记物，通过化学反应将抗原与酶标记的抗体结合，从而显示出特定抗原的位置和分布。

常用的标记物包括辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP)等。

在检测抗原时，标记物可以与染色底物产生反应生成可见色素，形成染色，以显示抗原的位置和分布。

5. 免疫组织化学原位杂交(Immunohistochemical in situ hybridization, IHC-IS)：免疫组化原位杂交技术是一种结合了原位杂交和免疫组化技术的方法。