Negative staining 阴性(负)染色法

北京雷根生物技术有限公司
磷钨酸负染色液(2%)
简介：
负染色又称阴性染色，是由Hall 发现的相对于普通染色(即正染色)而言的染色技术。

其原理在于利用重金属盐包绕低电子密度的样品，增强样本四周的电子密度，造成细微结构之间的＂质量－厚度”差异，增强散射吸收反差磷钨酸负染色液(2%)适用于显示大分子、细菌、病毒、原生动物、噬菌体、细胞器、核酸大分子、蛋白质晶体及其他大分子材料等。

染色后的样品图像呈现透明的亮光，而背景图像呈黑色。

组成：
操作步骤(仅供参考)：
(一)滴染法
1、样品低速离心或采用其他方法浓缩样品，制成悬浮液并且使其达到一定浓度和纯度。

2、将样品悬浮液直接滴于带有支持膜的载网上静。

3、用滤纸条从液滴边缘吸去多余液体，稍干燥。

1、 滴加负染色液静置。

5、吸去多余染色液，自然干燥，进行显微镜观察。

(二)漂浮法
1、样品低速离心或采用其他方法浓缩样品，制成悬浮液并且使其达到一定浓度和纯度。

2、将带有支持膜的载网置于样品液滴上漂浮以沾取样品。

3、载网置于负染色液上漂浮。

4、吸去多余染色液，自然干燥，进行显微镜观察。

染色结果：
注意事项： 1、 目的样本尽量新鲜。

2、 样品应为均匀的悬浮液，其纯度和浓度应适宜，否则无法与染色剂之间产生特异和清晰
的结合反应。

编号 名称 DZ0035 Storage 磷钨酸负染色液(2%) 100ml RT
使用说明书 1份 样品 透明的亮光 背景 黑色。

负染色操作步骤-概述说明以及解释1. 引言概述部分的内容可以按如下方式编写：1.1 概述负染色是一种常用的细胞和组织样品处理技术，它常被应用于生物学和医学研究中，用于观察细胞和组织内部的结构和特征。

相比于传统的正染色方法，负染色操作具有一些独特的优势和特点。

在负染色过程中，样本被浸泡在一种特定的染料溶液中，这种染料溶液往往是一种与样品的成分不相溶的物质。

负染色的关键在于利用染料的物理和化学性质，使其与样品发生作用，从而使样品的细节和特征得以显示。

负染色的操作步骤相对简单，但需要一定的技巧和经验。

本文将详细介绍负染色的操作步骤要点，旨在帮助读者快速掌握负染色技术并正确应用于实验中。

负染色的具体步骤将在接下来的章节中进行介绍，主要包括：样品制备、染料选择、染色操作、观察和分析等环节。

通过正确的操作步骤，可以获得清晰、可靠的负染色结果，从而进一步推进相关研究领域的发展。

总之，负染色作为一种常用的细胞和组织样品处理技术，具有独特的优势和特点。

本文将深入介绍负染色的操作步骤要点，希望能够为读者提供一份实用的参考，帮助其在实验中正确应用负染色技术。

文章结构部分的内容应该是关于整篇文章的组织结构和章节安排的介绍。

可以按照以下方式编写：文章结构：本文将按照以下结构进行叙述：1. 引言1.1 概述1.2 文章结构1.3 目的2. 正文2.1 负染色操作步骤要点12.2 负染色操作步骤要点23. 结论3.1 总结3.2 展望在引言部分，我们将简要说明本文的主题和目的，以及为什么负染色操作步骤的了解对于某些特定应用领域的重要性。

接下来的正文部分将分为两个要点，分别介绍负染色操作的具体步骤，包括所需材料、实验条件等重要信息。

通过对每个步骤要点的详细描述，读者将能够理解负染色操作的基本原理和实施方法。

最后，在结论部分，我们将对整篇文章进行总结，回顾负染色操作的关键步骤和要点，并展望未来在该领域的进一步研究和应用方向。

通过以上的文章结构安排，读者将能够清晰地了解整篇文章的内容组织和章节间的逻辑关系，从而更好地理解和掌握负染色操作步骤的相关知识。

1．菌落(co1ony)：单个微生物细胞在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到—定程度形成的肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。

2．菌苔(lawn)：固体培养基表面众多菌落连成一片时所形成的微生物生长群体。

3．平皿(Petri dish)：由玻璃或透明塑料制成的圆形皿底和皿盖组成，皿盖可覆盖于皿底之上，防止空气中微生物的污染。

其英文名称是为纪念其发明者Richard Petri。

4．纯培养物(pure culture)：由一种微生物组成的细胞群体，通常是由一个单细胞生长、繁殖所形成。

5．培养基(culturemedium)：供微生物生长、繁殖的营养基质，根据其中固化剂含量的不同可分为固体、半固体、液体3种。

6．无菌技术(aseptic technique) 在分离、转接及培养纯种微生物时，防止其被环境中微生物污染或其自身污染环境的技术。

7．培养平板(cultureplate) 常简称为平板，指固体培养基倒人无菌平皿，冷却凝固后所形成的培养基平面。

8．稀释倒平板法(pour plate method) 将待分离的材料稀释后与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后制成可能含菌的培养平板，保温培养后分离得到的微生物菌落生长在固体培养基表面和里面。

9．涂布平板法(spread plate method) 在培养平板表面均匀涂布经过稀释的微生物悬液后，保温培养，在固体培养基表面得到生长分离的微生物菌落。

10．平板划线法(streakplatemethod) 用接种环在培养平板表面划线接种微生物，使微生物细胞数量随着划线次数的增加而减少，并逐步分开。

保温培养后，在固体培养基表面得到生长分离的微生物菌落。

11．稀释摇管法(dilutionshakeculturemethod) 将待分离的材料稀释后与已熔化并冷却至50~C左右的琼脂培养基混合，摇匀后用石蜡封盖，保温培养后分离得到的微生物菌落生长在琼脂柱中间。

微生物习题集第一章绪论一、术语或名词1．微生物(microorganism)因太小，一般用肉眼看不清楚的生物。

这些微小生物包括：无细胞结构不能独立生活的病毒、亚病毒(类病毒、拟病毒、朊病毒)；具原核细胞结构的真细菌、古生菌以及具真核细胞结构的真菌(酵母、霉菌、蕈菌等)、单细胞藻类、原生动物等。

但其中也有少数成员是肉眼可见的。

2．微生物学(microbiology)研究肉眼难以看清的称之为微生物的生命活动的科学，分离和培养这些微小生物需要特殊技术。

3．分子微生物学(molecular microbiology)在分子水平上研究微生物生命活动规律的科学。

4．细胞微生物学(cellular microbiology)重点研究微生物与寄主细胞相互关系的科学。

5．微生物基因组学(microbic genomics)研究微生物基因组的分子结构、信息含量及其编码的基因产物的科学。

6．自生说(spontaneous generation)一个古老的学说，认为一切生命有机体能够从无生命的物质自然发生的。

7．安东·列文虎克(AntonyvanLeeuwenhoek，1632—1723)荷兰商人，他是真正看见并描述微生物的第一人，他利用自制放大倍数为50～300倍的显微镜发现了微生物世界(当时被称之为微小动物)，首次揭示了一个崭新的生物世界——微生物界。

8．路易斯·巴斯德(Louis Pasteur，1822—1895)法国人，原为化学家，后来转向微生物学研究领域，为微生物学的建立和发展做出了卓越的贡献，成为微生物学的奠基人。

主要贡献：用曲颈瓶实验彻底否定了“自生说”，从此建立了病原学说，推动了微生物学的发展；研究了鸡霍乱，发现将病原菌减毒可诱发免疫性，以预防鸡霍乱病；其后他又研究了牛、羊炭疽病和狂犬病，并首次制成狂犬疫苗，证实其免疫学说，为人类防病、治病做出了重大贡献；分离到了许多引起发酵的微生物，并证实酒精发酵是由酵母菌引起的，也发现乳酸发酵、醋酸发酵和丁酸发酵都是不同细菌所引起的，为进一步研究微生物的生理生化和工业微生物学奠定了基础。

革兰氏染色实验革兰氏染色（Gram Staining）是用来鉴别细菌的一种方法：这种染色法利用细菌细胞壁上的生物化学性质不同，可将细菌分成两类，即革兰氏阳性（Gram Positive）与革兰氏阴性（Gram Negative）。

(这种染色法是由一位丹麦医生汉斯·克里斯蒂安·革兰于1884年所发明)。

未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。

染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。

阳性紫色，阴性红色革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌：革兰氏阳性菌：葡萄球菌属（主要是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等）、链球菌属（肺炎链球菌、草绿色链球菌、肠球菌等）、白喉杆菌、炭疽杆菌、破伤风杆菌、蜡样芽孢杆菌等，其中，金黄色葡萄球菌、肠球菌等为临床重要的病原菌。

革兰氏阴性菌：埃希氏菌属、枸橼酸菌属、假单胞菌属（绿脓杆菌等）、莫拉菌属（卡他莫拉菌等）、奈瑟菌属（淋球菌、脑膜炎双球菌等）、不动杆菌属（鲍曼不动杆菌、罗菲不动杆菌等）、克雷伯菌属（主要是肺炎克雷伯杆菌）、沙门氏菌属、志贺氏菌属（痢疾杆菌等）、黄杆菌属、变形杆菌属、军团菌属、耶尔森菌属、嗜血杆菌属（杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌等）、产气杆菌属、霍乱弧菌、阴沟肠杆菌等。

革兰氏阴性菌在院内感染中的细菌感染中占了大约65%，且大多菌株容易对抗菌药物耐药，产生“新德里金属酶”（NDM-1）的绝大多数细菌都是革兰氏阴性菌（主要是大肠杆菌、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯杆菌）。

革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌是利用革兰氏染色法来鉴别的两大类细菌。

大多数化脓性球菌都属于革兰氏阳性菌，它们能产生外毒素使人致病，而大多数肠道菌多属于革兰氏阴性菌，它们产生内毒素，靠内毒素使人致病。

细胞形态和结构细胞的基本结构包括细胞壁和原生质体两部分。

原生质体位于细胞壁内，包括细胞膜（细胞质膜）、细胞质、核质和内含物。

超氧化物歧化酶活性正、负染色方法的比较超氧化物歧化酶（SOD）是帮助人体抗衰老的最重要的一种内源性酶，它的活性直接反映了细胞的氧化应激状态。

在实验室研究中，研究人员常常使用染色方法研究SOD活性。

正负染色方法是目前最被广泛应用的SOD活性评价工具。

本文的主题是比较正负染色方法对SOD活性的测定效果。

一、正染色方法正染色方法是检测SOD活性最常用的方法，它可以还原多巴胺（MPO）以检测SOD活性。

该方法利用可能影响细胞性状的MPO所产生的单套抗原作为正染色技术，通常在聚脲凝胶上展示。

它是一种由单一细胞提供协助的染色法：其中MPO可能将过氧化物（如丙二醛）氧化为过氧化氢，进而破坏SOD的活性，也称为SOD检查试验。

二、负染色方法负染色方法检测的是细胞氧化应激状态，它与高通量技术结合在一起，采用某种氧化物来定量检测SOD活性。

氯硝基酚（PT）是一种常用的氧化剂，具有高抗氧化性，当它在酶活性环境中受到过氧化物的氧化作用时，它会发生质变，从而使其可以被检测。

它的变化可以用像素提供的可用结果来建立统计模型，从而评估细胞的SOD活性。

三、正负染色方法的比较正染色方法和负染色方法都可用于检测SOD活性，比较其异同如下：正染色方法是利用多巴胺（MPO）作为正染色因子，通常在聚脲凝胶上展示，能够清楚地反映出单个细胞之间SOD活性的差异，是SOD活性检测中更为常用的方法。

负染色方法则是利用氯硝基酚（PT）作为抑制染色因子，通过氧化剂的质量变化而可以检测到SOD的活性，这一方法本质上是一种高通量技术，可以在短时间内大量地同时开展实验，适合于大规模SOD活性检测。

总之，正负染色方法都可以应用于检测SOD活性，不同之处在于检测方法、抗氧化因子及所能反映出的细胞氧化应激差异等方面，可根据实验需要任意选择。

同时，研究者们还可以开发出新的技术和方法，更有效地测定SOD活性。

微生物考研名词解释汇总【20XX年】1.纯培养物（pure culture）：由一种微生物组成的细胞群体，通常是由一个单细胞生长、繁殖所形成。

【2章微生物的纯培养和显微技术】2.负染色（negative staining）：染料使背景颜色加深而样品没有着色的染色法。

【2章微生物的纯培养和显微技术】（2013、2007）3.糖被(glycocalyx)：指包被于某些细菌细胞壁外的一层厚度不定的胶状物质。

糖被有数种：1.形态固定、层次厚的为荚膜。

2.形态固定、层次薄的为微荚膜。

3.形态不固定、结构松散的为粘液层。

4.包裹在细胞群体上有一定形态的糖被称为菌胶团。

糖被的主要功能是保护菌体免受干旱损伤或宿主免疫活性细胞的吞噬。

荚膜的功能：1、保护作用2、贮藏养料3、保护屏障4、表面附着5、信息识别6、堆积代谢物【3章微生物细胞的结构域功能】4.PHB（poly-β-hydroxybutyrate，聚β-羟丁酸）:PHR是存在于许多细菌细胞质内属于类脂性质的碳源类贮藏物。

具有贮藏能量、碳源和降低细胞内渗透压的作用。

是细菌独有的可作为医用材料。

【3章微生物细胞的结构域功能】5.原养型微生物（prototroph）：与自然发生的同种其他个体一样，具有相同营养需求的微生物。

【4章微生物的营养】6.基因转位（group translocation）：物质通过载体帮助，在一个较复杂的运输系统的作用下进行的跨膜主动运输，被运输物质在该过程中化学性质发生改变。

【4章微生物的营养】（2013、2011、2009）7.对数生长期(logarithmic phase)：微生物经过延滞期后，以最大的速度进行生长和分裂至微生物数量呈对数增加的时期。

在对数生长期微生物各成分按比例有规律增加，微生物呈平衡生长。

（也称指数生长期或指数期。

）【6章微生物的生长繁殖及其控制】（2013、2010）8.同步培养（synchronous culture）：使群体中不同步的细胞转变成能同时进行生长或分裂的群体细胞的培养方法称为同步培养。

负染色技术负染色又称阴性染色，是相对于普通染色(称正染色)而言的。

负染色首先由Hall在1955年提出。

Hall在病毒研究中用磷钨酸染色后，发现图像的背景很暗，而病毒象一个亮晶的"空洞"被清楚地显示出来。

在超薄切片的染色中，染色后的样品电子密度因染色而被加强，在图像中呈现黑色。

而背景因未被染色而呈光亮，这种染色称为正染色。

而负染色则相反，由于染液中某些电子密度高的物质(如重金属盐等)"包埋"低电子密度的样品，结果在图像中背景是黑暗的，而样品像"透明"地光亮。

两者之间的反差正好相反，故称为负染色。

对于负染色的机制目前还不十分了解。

对颗粒状的生物材料的研究而言，负染色技术与超薄切片方法相比具有分辨率高(可达15Å)，简单快速等优点。

因此，在生物学研究中得到越来越广泛的应用。

它可以显示生物大分子、细菌、病毒、分离的细胞器以及蛋白质晶体等样品的形状、结构、大小以及表面结构的特征。

尤其在病毒学中，负染色技术成为不可取代的实验技术。

[编辑]负染色液的制备用作负染色的负染色剂应具有：较强的电子散射能力以产生足够的图像反差；熔点高，在电子束的轰击下不会升华；溶解度大，不易析出沉淀；在电镜下不呈现出可观察到的结构；分子小，容易渗入不规则表面的凹陷处；与样品不起化学反应等。

目前最常用的负染液是磷钨酸、磷钨酸钾和磷钨酸钠(分别简称为PTA、KPT、NaPT)。

此外醋酸铀、甲酸铀、硅钨酸、钼酸铵等也常作负染色剂用。

它们的配制方法如下：磷钨酸、磷钨酸钠、磷钨酸钾溶液通常用双蒸水或磷酸缓冲液配制成1％～3％的溶液，使用时应用1 mol／L氢氧化钠溶液将负染色液的pH值调至6.4～7.0或实验所需的值。

醋酸铀：通常使用双蒸水配制成0.2％～0.5％水溶液(pH4.5)。

醋酸铀染色液应是新鲜的，最好使用前配制。

醋酸铀溶解需15～30分钟，在黑暗中能稳定几小时，使用前用1mol／L的氢氧化钠溶液将pH值调至4.5。

革兰氏染色一、定义革兰氏染色（Gram Staining）是用来鉴别细菌的一种方法：这种染色法利用细菌细胞壁上的生物化学性质不同，可将细菌分成两类，即革兰氏阳性（Gram Positive）与革兰氏阴性（Gram Negative）。

这一染色方法由丹麦医生汉斯·克里斯蒂安·革兰于1884年所发明，最初是用来鉴别肺炎球菌与克雷白氏肺炎菌之间的关系，后推广为鉴别细菌种类的重要特性之一，对由细菌感染引起的疾病的临床诊断及治疗有着广泛用途。

二、原理通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。

三、实验方法步骤般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：1）涂片固定。

2）草酸铵结晶紫染1分钟。

3）蒸馏水冲洗。

4）加碘液覆盖涂面染约1分钟。

5）水洗，用吸水纸吸去水分。

6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。

7）蕃红染色液（稀）染1分钟后，蒸馏水冲洗。

干燥，镜检。

四、可能误差在实验中经常会出现假阳性和假阴性的结果，假阳性主要是由于脱色不完全，可能是由于涂片过厚，或者是结晶紫染色过度，导致脱色不完全。

假阴性可能是因为细胞固定过度，造成细胞壁通透性的改变，而出现假阴性结果；另外，细胞培养时间太长，可能已经有部分细胞发生死亡或者自溶，也导致细胞壁通透性的改变而出现假阴性结果。

1.自生说（spontaneous generation）:一个古老的学说，认为一切生命有机体能够从无生命的物质自然的发生的。

2.路易斯·巴斯德（Louis Pasteur，1822—1895）：法国人，原为化学家，后来转向微生物学研究领域，为微生物学的建立和发展做了卓越的贡献，成为了微生物学的奠基人。

（1）.用曲颈试验彻底否定了“自然发生说”，建立了病原学说。

（2）.证实了发酵由微生物引起的。

（3）首次制成狂犬疫苗，证实其免疫学说。

（4）发明了巴氏消毒法。

3.罗伯特·柯赫（Robert Koch，1843—1910）：德国人，著名细菌学家，对病原细菌的研究做出了突出贡献。

（1）证实了炭疽病菌是炭疽病的病原菌。

（2）分离培养了结核病的病原菌。

（3）提出了某种微生物是否为某种疾病病原体的基本原则—柯赫氏定律。

（4）创造的细菌染色的方法。

4.SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome)：严重急性呼吸道综合症，即我国称为的非典型肺炎，也简称非典。

5.微生物（microorganism）：因为太小，一般用肉眼看不清楚的生物。

这些微小生物包括，无细胞结构不能独立生活的病毒、亚病毒，具原核细胞结构的真细菌、古细菌，以及具真核细胞结构的真菌、单细胞藻类、原生生物等。

也有少数成员是肉眼可见的。

6.纯培养物（pure culture）：仅有单一一种微生物繁殖得到的培养物。

7.培养基（culture medium）：由人工配置的，供微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。

8.无菌技术（aseptic technique）：在分离转接及培养微生物时，防止其被环境中微生物污染或其自身污染环境的技术。

9.富集培养（enrichment culture）：利用不同微生物间生命活动特点的不同，指定特定的环境条件，使劲适应于该环境条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，从自然界中分离到特定的微生物。

泛素化蛋白检测方法泛素化是一种重要的蛋白质修饰方式，通过共价连接泛素蛋白到靶蛋白上，调控靶蛋白的稳定性、活性和亚细胞定位。

因此，泛素化蛋白的检测对于研究细胞信号传导、蛋白质降解和细胞周期调控具有重要意义。

本文将介绍几种常用的泛素化蛋白检测方法，希望能够为相关研究工作者提供一些参考和帮助。

1. 免疫印迹（Western blotting）。

免疫印迹是一种常用的蛋白质检测方法，可以用于检测泛素化蛋白。

首先，将待检测样品进行SDS-PAGE凝胶电泳分离，然后转膜到聚丙烯膜上，接着用抗泛素抗体进行孵育，最后通过化学发光或者显色底物进行检测。

免疫印迹方法具有高灵敏度和高特异性，可以检测低水平的泛素化蛋白。

2. 免疫荧光染色（Immunofluorescence staining）。

免疫荧光染色是一种用于检测细胞内蛋白质的方法，也可以用于检测泛素化蛋白。

将待检测细胞固定后，用抗泛素抗体进行孵育，然后再与荧光标记的二抗结合，最后通过荧光显微镜观察。

免疫荧光染色方法可以直观地显示泛素化蛋白的亚细胞定位和表达水平。

3. 免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation）。

免疫共沉淀是一种用于检测蛋白质相互作用的方法，也可以用于检测泛素化蛋白和其底物蛋白的相互作用。

首先，将待检测样品与抗泛素抗体进行孵育，然后加入蛋白A/G琼脂糖糖珠进行共沉淀，最后用免疫印迹或质谱等方法进行检测。

免疫共沉淀方法可以帮助研究者确定泛素化蛋白与其底物蛋白的相互作用关系。

4. 质谱分析（Mass spectrometry）。

质谱分析是一种高通量的蛋白质检测方法，也可以用于检测泛素化蛋白。

通过将待检测样品进行蛋白水解和质谱分析，可以确定泛素化位点和泛素化蛋白的亚型。

质谱分析方法具有高灵敏度和高分辨率，可以全面地分析泛素化蛋白的修饰情况。

综上所述，泛素化蛋白的检测方法多种多样，研究者可以根据实际需要选择合适的方法进行检测。

希望本文介绍的方法能够为相关研究工作者提供一些参考和帮助，推动泛素化蛋白的研究进展。

1．菌落(co1ony)：单个微生物细胞在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到—定程度形成的肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。

2．菌苔(lawn)：固体培养基表面众多菌落连成一片时所形成的微生物生长群体。

3．平皿(Petri dish)：由玻璃或透明塑料制成的圆形皿底和皿盖组成，皿盖可覆盖于皿底之上，防止空气中微生物的污染。

其英文名称是为纪念其发明者Richard Petri。

4．纯培养物(pure culture)：由一种微生物组成的细胞群体，通常是由一个单细胞生长、繁殖所形成。

5．培养基(culturemedium)：供微生物生长、繁殖的营养基质，根据其中固化剂含量的不同可分为固体、半固体、液体3种。

6．无菌技术(aseptic technique) 在分离、转接及培养纯种微生物时，防止其被环境中微生物污染或其自身污染环境的技术。

7．培养平板(cultureplate) 常简称为平板，指固体培养基倒人无菌平皿，冷却凝固后所形成的培养基平面。

8．稀释倒平板法(pour plate method) 将待分离的材料稀释后与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后制成可能含菌的培养平板，保温培养后分离得到的微生物菌落生长在固体培养基表面和里面。

9．涂布平板法(spread plate method) 在培养平板表面均匀涂布经过稀释的微生物悬液后，保温培养，在固体培养基表面得到生长分离的微生物菌落。

10．平板划线法(streakplatemethod) 用接种环在培养平板表面划线接种微生物，使微生物细胞数量随着划线次数的增加而减少，并逐步分开。

保温培养后，在固体培养基表面得到生长分离的微生物菌落。

11．稀释摇管法(dilutionshakeculturemethod) 将待分离的材料稀释后与已熔化并冷却至50~C左右的琼脂培养基混合，摇匀后用石蜡封盖，保温培养后分离得到的微生物菌落生长在琼脂柱中间。

负染色技术负染色又称阴性染色，是相对于普通染色(称正染色)而言的。

负染色首先由Hall在1955年提出。

Hall在病毒研究中用磷钨酸染色后，发现图像的背景很暗，而病毒象一个亮晶的"空洞"被清楚地显示出来。

在超薄切片的染色中，染色后的样品电子密度因染色而被加强，在图像中呈现黑色。

而背景因未被染色而呈光亮，这种染色称为正染色。

而负染色则相反，由于染液中某些电子密度高的物质(如重金属盐等)"包埋"低电子密度的样品，结果在图像中背景是黑暗的，而样品像"透明"地光亮。

两者之间的反差正好相反，故称为负染色。

对于负染色的机制目前还不十分了解。

对颗粒状的生物材料的研究而言，负染色技术与超薄切片方法相比具有分辨率高(可达15Å)，简单快速等优点。

因此，在生物学研究中得到越来越广泛的应用。

它可以显示生物大分子、细菌、病毒、分离的细胞器以及蛋白质晶体等样品的形状、结构、大小以及表面结构的特征。

尤其在病毒学中，负染色技术成为不可取代的实验技术。

[编辑]负染色液的制备用作负染色的负染色剂应具有：较强的电子散射能力以产生足够的图像反差；熔点高，在电子束的轰击下不会升华；溶解度大，不易析出沉淀；在电镜下不呈现出可观察到的结构；分子小，容易渗入不规则表面的凹陷处；与样品不起化学反应等。

目前最常用的负染液是磷钨酸、磷钨酸钾和磷钨酸钠(分别简称为PTA、KPT、NaPT)。

此外醋酸铀、甲酸铀、硅钨酸、钼酸铵等也常作负染色剂用。

它们的配制方法如下：磷钨酸、磷钨酸钠、磷钨酸钾溶液通常用双蒸水或磷酸缓冲液配制成1％～3％的溶液，使用时应用1 mol／L氢氧化钠溶液将负染色液的pH值调至6.4～7.0或实验所需的值。

醋酸铀：通常使用双蒸水配制成0.2％～0.5％水溶液(pH4.5)。

醋酸铀染色液应是新鲜的，最好使用前配制。

醋酸铀溶解需15～30分钟，在黑暗中能稳定几小时，使用前用1mol／L的氢氧化钠溶液将pH值调至4.5。

第二章微生物的纯培养和显微镜技术一、要点提示1．由于微生物个体微小，在绝大多数情况下对微生物的研究、利用都是使用其群体，称为培养物。

由于一般情况下只有纯培养物才能提供可以重复的结果，因此从混杂的天然微生物群中分离获得某特定的微生物纯培养，是研究和利用微生物的最重要的环节之一。

采用稀释涂布或平板划线技术在琼脂平板上得到微生物的单菌落是最常用的纯种分离手段，而在分离、转接及培养微生物纯培养时防止被其他微生物污染的无菌操作技术是进行微生物学研究的基础，并广泛地被其他学科和生产实际所利用。

2．通过分离纯化得到的微生物纯培养物，必须通过各种保藏技术使其在一定时间内不死亡、不会因发生变异而丢失重要的生物学性状、不会被其他微生物污染或因自身泄漏而污染环境，否则就无法真正保证微生物研究和应用工作的顺利进行。

传代培养、冷冻真空干燥保藏、低温冰箱保藏及液氮保藏是通常使用的微生物菌种保藏技术。

3．微生物个体微小，通常必须通过显微镜才能观察到其个体形态，而进行显微观察时，分辨率和反差是决定显微观察效果的两个最重要的因素。

它们与显微镜的特性有关，也取决于样品的制备与观察技术。

无论是光学显微镜还是电子显微镜，其设备和技术发展迅速，应用面越来越广泛和深入。

4．在显微镜下微生物的大小与形态千差万别，丰富多彩，是区分不同微生物和对其进行分类、鉴定的重要依据之一。

二、重点、难点剖析1．无菌技术是最基本的微生物学实验操作技术，其核心是无菌概念的建立，以及正确而严格地按实验教材和实验课的要求，掌握在各种情况下的具体应用原则和操作规范。

2．分离获得某特定的微生物纯培养，是研究和利用微生物的基础。

获得纯培养的方法有固体培养基分离、液体培养基分离和单细胞挑取3大类(表2-1)，其中用固体培养基获得单独的微生物菌落是最常用、最基本的方法。

此外还有活细胞或活体分离法，如噬菌体和动植物病毒纯培养的分离等。

3．保证所用菌种性状的稳定是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。