蛋白信号肽和跨膜区预测文章

D 01：10. 13523/j .cb . 2101018信号肽在大肠杆菌分泌系统中的研究与应用进展何若昱1>2林福玉2高向东“刘金毅(1中国药科大学生命科学与技术学院南京210009 2北京三元基因药业股份有限公司北京102600)摘要大肠杆菌以其明显的优势成为表达重组蛋白常用的系统，但是大肠杆菌本身不具备细胞 内形成二硫键的氧化条件和分子机制，而且高水平表达时常容易聚集形成包涵体，限制了其使 用，改善这一缺点的重要方法是通过信号肽实现蛋白质的分泌表达。

信号肽一般存在于分泌蛋 白的氨基端，能够引导蛋白质通过大肠杆菌中的Sec 或/和T a t 系统分泌至周质空间。

简要概述 了大肠杆菌中两种跨膜分泌系统和信号肽的结构，并结合近年来常用6种信号肽的研究与应用进 展，阐述了信号肽在使用中存在的问题及改进措施。

旨在为研究者合理选择信号肽、优化重组蛋 白的表达提供更多可用的信息与策略。

关键词信号肽大肠杆菌分泌系统 中图分类号Q 816大肠杆菌是表达重组蛋白最常用的宿主菌，拥有 操作方便、生长周期短、遗传背景清晰、表达水平高等 诸多优点。

但是大肠杆菌胞质内还原性环境不利于蛋 白质—•硫键的形成，并且局水平表达的蛋白质谷易聚 集形成包涵体。

这些因素导致重组蛋白需要经过后期 烦琐的变复性过程才能够恢复活性。

为了能够方便下 游工艺的处理，其中一个重要方法是利用信号肽将重 组蛋白引导至周质空间中分泌表达。

与细胞质相反，大肠杆菌周质空间中具备了形成二硫键所需的氧化环 境和分子机制。

Hajihassan 等〜借助信号肽将重组激 活素分泌至大肠杆菌的周质空间，使其形成了正确的 二硫键空间结构。

通常情况下，分泌蛋白的氨基末端有延伸的信号 肽，胞内与分泌相关的蛋白质可以通过识别信号肽将 其靶向细胞膜，最后信号肽酶将信号肽进行切除。

大 肠杆菌中介导信号肽分泌的系统主要包括一般分泌(the general secretory , Sec )系统和双精氛酸易位（twin -arginine translocation , Tat ) 系统，分泌 蛋白通过何 种系统分泌主要取决于自身信号肽结构。

原核蛋白表达（上清表达）案例原核蛋白表达（上清表达）案例1.实验目的以客户提供的目的蛋白基因构建表达载体，通过原核蛋白表达体系获得目的蛋白A。

2.实验设计（1）分析客户提供的目的蛋白序列，设计蛋白表达方案；（2）选择钟鼎特色载体pCzn1，构建表达质粒pCzn1-A；（3）IPTG诱导进行目的蛋白表达，并且优化表达条件，将诱导条件调整至37℃，经分析目标蛋白主要呈可溶形式表达，通过Western Blot检测蛋白A是否表达；（4）通过上清纯化方式，Ni柱亲和纯化获得目的蛋白A，SDS-PAGE检测纯化蛋白纯度，BSA方法测定蛋白浓度。

3.蛋白分析（1）经EditSeq翻译目的蛋白A序列：m.w.=10.66kd，pI=6.64（2）经UniProt匹配，蛋白A物种来源：拟南芥（3）目的基因稀有密码子分析及蛋白结构分析蛋白亲疏水分析蛋白跨膜结构域分析蛋白信号肽预测分析结果：目的蛋白整体呈亲水性、无跨膜结构域、无信号肽序列，可尝试全长表达。

结论：将目的基因构建在钟鼎特色载体pCzn1上，可用于原核表达上清表达，利用载体自带信号肽分泌表达，并在目的蛋白N端添加His标签便于纯化。

4.表达载体构建4.1pCzn1-A质粒酶切验证：4.2 pCzn1-A 质粒测序验证：部分序列比对结果图5.蛋白表达及纯化钟鼎特色载体pCzn1酶切鉴定Marker: 200,500,800,1200,2000,3000,4500 Line1: 酶切前质粒 Line2: 酶切后质粒基因名称：A （OD260/OD280:1.82） 酶切位点：NdeI/XbaI5.实验结论目的蛋白A在IPTG诱导下进行可溶形式表达，蛋白表达成功。

跨膜蛋白的表达过程跨膜蛋白是一类重要的膜蛋白，存在于生物体的细胞膜上。

它们具有跨越细胞膜的能力，并在细胞膜两侧发挥重要的生物学功能。

跨膜蛋白的表达过程涉及多个步骤，从基因转录到蛋白质合成再到转运和定位至细胞膜上。

本文将详细介绍跨膜蛋白的表达过程，并对相关的机制进行分析和探讨。

跨膜蛋白的表达过程可以从基因转录开始。

首先，细胞核内的DNA会解旋，形成一个可以用作mRNA合成模板的DNA链。

这个过程称为转录。

转录过程中，RNA聚合酶会通过识别和结合基因的启动子区域，开始合成mRNA链。

在跨膜蛋白的基因中，基因序列中会包含编码跨膜区域的信息。

在RNA合成结束后，转录过程会通过终止信号而终止。

这时，产生的mRNA链会进一步经历剪接过程。

剪接过程是一种将mRNA前体中的内含子序列移除，使编码剩余序列连接起来的过程。

跨膜蛋白的剪接过程往往复杂多样，它可以产生多种变体，编码不同长度和结构的跨膜蛋白。

在剪接后，mRNA会进入细胞质，在此过程中发生翻译，即mRNA合成蛋白质。

翻译是通过转运RNA（tRNA）和核糖体两个重要的分子机制来完成的。

在跨膜蛋白的翻译过程中，起始密码子将在核糖体的识别下与tRNA配对，开始合成蛋白质链。

在翻译过程中，tRNA会通过与mRNA上的密码子配对，带来氨基酸，以及位置信息，将氨基酸正确地连接起来，形成蛋白质链。

对于跨膜蛋白，翻译机器必须正确地合成包含跨膜螺旋结构的氨基酸序列。

在蛋白质合成完成后，新合成的蛋白质通常需要参与折叠、修饰和定位等一系列后续过程，以确保其正确的功能和位置。

对于跨膜蛋白，定位至细胞膜上是非常重要的。

通常，蛋白质在细胞质中会与伴体蛋白相互作用，并形成复合物。

这些伴体蛋白可以帮助新合成的蛋白质正确地折叠和定位。

跨膜蛋白通常具有一个信号序列，称为信号肽或膜领域，这个序列能够将蛋白质定位至细胞膜。

一些跨膜蛋白的信号序列位于蛋白质的氨基端，被称为氨基端信号肽，而另一些跨膜蛋白的信号序列则位于蛋白质的内部或羧基端。

拟南芥抗性基因RPS2的分析RPS2基因位于拟南芥4号染色体上，编码的RPS2蛋白是一种抗性蛋白，能够识别Pseudomonas syringae pv. Tomato的效应因子avrRpt2，从而激发拟南芥的ETI。

RPS2基因的cDNA全长3535bp，GC含量为43.5%，分子量为1095.29604kDa。

开放读码框的识别在NCBI的ORF Finder分析工具（/gorf/gorf.html）中进行预测，结果如图1-1。

100bp以上的ORF有18个，正向的4个，反向的14个。

最优结果为从第259bp到第2988bp之间的ORF，长度为2730。

图1-1，开放阅读框的预测。

如图所示，绿色区域为ORF,上面三条为正向阅读，下面三条为反向阅读。

启动子预测用Promoter Prediction工具（/seq_tools/promoter.html）对RPS2的cDNA进行启动子预测，结果如果2-1。

得分最高的启动子为302bp和351bp之间的序列tgtgtgaatctatgaatatggcggagagaagaggacataagactgatctt。

图2-1，RPS2基因启动子预测，如图所示，有三个预测结果得分在0.8以上，最高得分为0.93.CpG岛的预测用在线软件CpGPlot（/emboss/cpgplot/index.html）进行预测，结果如图3-1。

.起始位点为第358bp，终止与615bp，长度为258bp。

图3-1.RPS2基因CpG岛预测碱基同源性分析运用NCBI信息库的BLAST程序对RPS2的cDNA进行碱基同源性分析，网址为http://smart.embl-heidelberg.de/。

分析结果如下图4-1.RPS2基因在拟南芥不同生态型里的同源性很高。

图4-1.RPS2基因同源性分析二级结构和功能分析对RPS2最大的ORF（259-2988）翻译的蛋白的一些二级结果和功能域进行分析，包括信号肽预测、疏水性分析、磷酸化位点分析、跨膜区分析、亚细胞定位和二级结构预测。

分析蛋白结构域(Domains)的三种方法生物信息编程2009-09-24 23:55:50 阅读1235 评论0 字号：大中小订阅三种分析蛋白结构域(Domains)的方法1，SMART入门，蛋白结构和功能分析SMART介绍SMART (a Simple Modular Architecture Research Tool) allows the identification and annotation of genetically mobile domains and the analysis of domain architectures. More than 500 domain families found in signalling, extracellular and chromatin-associated proteins are detectable. These domains are extensively annotated with respect to phyletic distributions, functional class, tertiary structures and functionally important residues. Each domain found in a non-redundant protein database as well as search parameters and taxonomic information are stored in a relational database system. User interfaces to this database allow searches for proteins containing specific combinations of domains in defined taxa. For all the details, please refer to the publications on SMART.SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)，可以说是蛋白结构预测和功能分析的工具集合。

跨膜蛋白定向转运的过程跨膜蛋白是细胞膜上的一类重要蛋白质，它们在细胞内外之间扮演着重要的信息传递和物质转运的角色。

然而，跨膜蛋白在合成后需要准确地定向转运到细胞膜上，以发挥其功能。

本文将介绍跨膜蛋白定向转运的过程。

跨膜蛋白定向转运的过程可以分为合成、折叠、定向转运三个主要步骤。

首先是合成阶段。

跨膜蛋白的合成通常发生在内质网（endoplasmic reticulum，ER）内。

在合成过程中，核糖体将mRNA翻译成蛋白质，并通过信号肽（signal peptide）引导这些蛋白质进入内质网。

信号肽通常位于蛋白质的N末端，它能够与内质网上的信号识别粒子结合，并将蛋白质导向内质网。

接下来是折叠阶段。

在内质网内，跨膜蛋白需要正确地折叠成具有稳定结构的形态，以保证其功能的正常发挥。

为了帮助跨膜蛋白正确折叠，细胞内还存在一系列分子伴侣，如辅助折叠酶和伴侣蛋白。

它们能够与跨膜蛋白相互作用，协助其正确折叠并防止其聚集。

最后是定向转运阶段。

已经折叠好的跨膜蛋白需要被定向转运到细胞膜上。

这一过程通常涉及到一系列的分子机器和信号序列。

其中，转运途径的选择主要依赖于跨膜蛋白所具有的信号序列。

根据信号序列的不同，跨膜蛋白的定向转运可以通过囊泡介导的方式或直接插入到细胞膜上。

囊泡介导的定向转运是一种常见的方式。

在此过程中，跨膜蛋白在内质网上形成囊泡，然后通过囊泡融合的方式将其运输到细胞膜上。

这一转运过程涉及到多个分子机器的参与，如囊泡蛋白和膜融合蛋白。

通过这些蛋白的相互作用，跨膜蛋白能够被准确地转运到细胞膜上。

另一种方式是直接插入到细胞膜上。

在这种情况下，跨膜蛋白的信号序列能够直接与细胞膜上的特定受体相互作用，从而实现其定向转运。

这种方式通常适用于某些特定的跨膜蛋白，如离子通道蛋白。

跨膜蛋白定向转运的过程涉及到合成、折叠和定向转运三个主要步骤。

在细胞内，跨膜蛋白通过信号肽进入内质网，然后在内质网内正确折叠，并最终通过囊泡介导或直接插入到细胞膜上完成定向转运。

原核蛋白（包涵体）表达案例
原核蛋白（包涵体）表达案例
1.实验目的
以客户提供的目的蛋白基因构建表达载体，通过原核蛋白表达体系获得目的蛋白A。

2.实验设计
（1）分析客户提供的目的蛋白序列，设计蛋白表达方案；
（2）选择钟鼎特色载体pCzn1，构建表达质粒pCzn1-A；
（3）IPTG诱导进行目的蛋白表达，并且优化表达条件，将诱导条件调整至37℃，经分析目标蛋白主要呈包涵体形式，通过Western Blot检测蛋白A是否表达；（4）通过Ni柱纯化获得目的蛋白A，SDS-PAGE检测纯化蛋白纯度，BSA方法测定蛋白浓度。

3.蛋白分析
（1）经EditSeq翻译目的蛋白A序列：m.w.=23.25kd，pI=5.22
（2）经UniProt匹配，蛋白A物种来源：人类
（3）蛋白性质分析
蛋白亲疏水分析
蛋白跨膜结构域分析
蛋白信号肽预测
分析结果：
目的蛋白整体呈亲水性、无跨膜结构域、无信号肽序列，可尝试全长表达。

结论：将目的基因构建在钟鼎特色载体pCzn1上，利用载体自带信号肽分泌表达。

4.表达载体构建
4.1pCzn1-A质粒酶切验证：
4.2 pCzn1-A 质粒测序验证：
部分序列比对结果图
5. 蛋白表达及纯化
钟鼎特色载体pCzn1 酶切鉴定
Marker: 200,500,800,1200,2000,3000,4500
Line1: 酶切前质粒 Line2: 酶切后质粒
基因名称：A （OD260/OD280:1.82） 酶切位点：NdeI /XhoI
6.实验结论
目的蛋白A在IPTG诱导下进行包涵体形式表达，蛋白表达成功。

G蛋白偶联受体的结构和功能分析G蛋白偶联受体是细胞膜上的一类受体，能够与G蛋白结合并激活其下游信号通路，从而调节细胞的生理功能。

目前已知的G蛋白偶联受体有超过800种，它们广泛分布于人体各个组织和器官中，参与多种生理和病理过程。

本文将从结构和功能两个方面进行G蛋白偶联受体的分析。

一、G蛋白偶联受体的结构G蛋白偶联受体的结构包括三个主要部分：N端外部结构域、跨膜区和C端内部结构域。

N端外部结构域通常包括一个信号肽序列、一个多肽链和一个糖蛋白。

这个部分对于识别外源物和生物体内的信号分子是非常重要的。

跨膜区是G蛋白偶联受体的最长部分，大约有7个α螺旋，形成一个七膜结构。

这个部分通常是一个细胞膜上的固定位置，而其他部分则可以向外部或内部开放。

所有G蛋白偶联受体都具有一个高度保守的区域，即7个跨膜区的中央区域。

C端内部结构域包含多个功能性结构域和蛋白激酶结构域。

这些结构域能够与下游信号通路的分子进行作用，并激活下游信号通路。

一般而言，G蛋白偶联受体的结构比较复杂，形成了一个高度保守的结构，这种结构在不同的受体之间基本上是相似的。

二、G蛋白偶联受体的功能G蛋白偶联受体的功能复杂多样，涉及到多种生理过程。

通过激活下游信号通路，可以促进或抑制细胞内多种生理活动，同时也与多种疾病相关。

下面将具体探讨其功能：1. G蛋白偶联受体的呈现和识别G蛋白偶联受体通常在细胞膜中表达。

通过识别外源物和自身信号分子，它们能够调控细胞内多种生理过程。

例如，多巴胺能够通过与多种G蛋白偶联受体结合，调节中枢神经系统的功能。

2. G蛋白偶联受体和心血管系统G蛋白偶联受体在心血管系统中扮演着重要的角色。

例如，β肾上腺素能够与β肾上腺素受体结合，激活下游信号通路，促进心脏跳动和肌肉收缩。

另外，肌酸磷酸也能够与G蛋白偶联受体结合，从而产生类似于β肾上腺素的作用。

3. G蛋白偶联受体和中枢神经系统在中枢神经系统中，多种神经递质和神经肽能够与G蛋白偶联受体结合，并调节细胞功能。