跨膜区分析

蛋白质序列、性质、功能和结构分析基于网络的蛋白质序列检索与核酸类似，从NCBI或利用SRS系统从EMBL检索。

1、疏水性分析ExPASy的ProtScale程序（/cgi-bin/protscale.pl）可用来计算蛋白质的疏水性图谱。

输入的数据可为蛋白质序列或SWISS-PROT数据库的序列接受号。

也可用BioEdit、DNAMAN等软件进行分析。

2、跨膜区分析蛋白质跨膜区域分析的网络资源有：TMPRED：/software/TMPRED_form.htmlPHDhtm:http:www.embl-heidelberg.de/Services/sander/predictprotein/predictpro tein.htmlMEMSAT: ftp://3、前导肽和蛋白质定位一般认为，蛋白质定位的信息存在于该蛋白自身结构中，并且通过与膜上特殊受体的相互作用得以表达。

这就是信号肽假说的基础。

这一假说认为，穿膜蛋白质是由mRNA编码的。

在起始密码子后，有一段疏水性氨基酸序列的RNA片段，这个氨基酸序列就称为信号序列（signal sequence）。

蛋白质序列的信号肽分析可联网到http://genome.cbs.dtu.dk/services/SignalP/或其二版网址http://genome.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/。

该服务器也提供利用e-mail进行批量蛋白质序列信号肽分析的方案（http://genome.cbs.dtu.dk/services /SignalP/mailserver.html），e-mail 地址为signalp@ genome.cbs.dtu.dk。

蛋白质序列中含有的信号肽序列将有助于它们向细胞内特定区域的移动，如前导肽和面向特定细胞器的靶向肽。

在线粒体蛋白质的跨膜运输过程中，通过线粒体膜的蛋白质在转运之前大多数以前体形式存在，它由成熟蛋白质和N端延伸出的一段前导肽或引肽（leader peptide）共同组成。

三、真核生物基因结构的预测分析1、蛋白质理化性质分析蛋白质理化性质是蛋白质研究的基础，分析包括分子质量、理论等电点（pI值）、氨基酸组成、原子组成、呈色反应、胶体沉淀、蛋白质的变形和复性、消光系数、半衰期、不稳定系数、脂肪系数和总平均疏水性等分析工具：ProtParam 工具/tools/protparam.htmlProtParam是基于蛋白质序列的组分分析，氨基酸亲疏水性等分析为高级结构预测提供参考分析方法（1）查找蛋白质的Swiss-Prot/TrEMBL AC号蛋白质的Swiss-Prot/TrEMBL AC号可以在UniProt（ /uniprot/index.html）中查找。

UniProt是欧洲生物信息学研究所EBI 将3个蛋白质数据库（即PIR 、SWISS-PROT和TrEMBL）统一起来而建立了一个蛋白质数据仓库在搜索框输入蛋白质名称（如Pichia pastoris Agglutinin-like protein 3）→Find（2）如果需要分析的蛋白是SWISS-PROT和TrEMBL数据库中已收录的蛋白质，则在输入蛋白质的Swiss-Prot/TrEMBL AC号(accession number)→点击“Compute parameters”（3）如果需要分析的是未知序列，则需在搜索框中粘贴氨基酸序列，返回结果即可得出结果分析：2、跨膜区分析使用工具：TMpredTMpred，它依靠一个跨膜蛋白数据库Tmbase（Hofmann和Stoffel，1993）。

Tmbase来源与Swiss-Prot库，并包含了每个序列的一些附加信息：跨膜结构区域的数量、跨膜结构域的位置及其侧翼序列的情况。

Tmpred利用这些信息并与若干加权矩阵结合来进行预测。

分析方法Tmpred的Web界面十分简明。

用户将单字符序列输入查询序列文本框，并可以指定预测时采用的跨膜螺旋疏水区的最小长度和最大长度。

影响物质跨膜运输的因素及曲线分析物质跨膜运输的方式有自由扩散、协助扩散和主动运输，因其特点各异，所以相应的影响因素和曲线就各有不同。

一、影响跨膜运输的因素1、自由扩散的因素：细胞膜内外物质的浓度差。

2、影响协助扩散的因素：（1）细胞膜内外物质的浓度差；（2）细胞膜上相应载体的数量。

3、影响主动运输的因素：（1）载体的种类和数量；（2）能量。

二、影响物质运输速率的曲线分析1、浓度（在一定范围内）对运输速率的影响曲线：（1）自由扩散的运输方向是由高浓度一侧到低浓度一侧，其动力是两侧溶液的浓度差，在一定浓度范围内，随物质浓度的增大，其运输速率越大。

（2）协助扩散或主动运输的共同特点是都需要载体协助，在物质浓度较低时，随物质浓度的增大，运输速率也逐渐增大，到达一定物质浓度时，由于受膜上载体数量的限制，运输速率不再随浓度增大而增大。

2、氧气浓度对物质运输速率的影响曲线：（1）自由扩散和协助扩散统称为被动运输，其运输方向都是从高浓度一侧到低浓度一侧，其运输的动力都是浓度差，不需要能量，因此与氧气浓度无关，运输速率不随氧气浓度增大而改变。

（2）主动运输方式既需要载体协助又需要消耗能量，在氧气浓度为零时，通过细胞无氧呼吸供能，但无氧呼吸产生能量较少，所以运输速率较低，在一定范围内随氧气浓度升高，有氧呼吸加强，产生的能量逐渐增多，所以运输速率不断加快，当氧气浓度足够高时，能量供应充足，但由于受到载体数量的限制，运输速率不再随氧气浓度增大而加快。

三、解题技巧◆渗透方向及浓度大小的判断1．判断溶剂渗透的总方向(1)若半透膜两侧是同种溶液，根据质量浓度或物质的量浓度判定。

(2)若半透膜两侧是不同的溶液，物质的量浓度才能体现溶质或溶剂分子数的多少，如半透膜两侧为质量分数相同的葡萄糖溶液和蔗糖溶液，则葡萄糖溶液一侧单位体积中葡萄糖分子数多(水分子数少)，水分子由蔗糖溶液一侧通过半透膜向葡萄糖溶液一侧扩散。

2．判断半透膜两侧溶液浓度大小若渗透平衡后，半透膜两侧液面仍存在液面差，则半透膜两侧溶液就存在浓度差，液面差越大，浓度差就越大，且液面高的一侧溶液浓度高。

(完整)物质跨膜运输分析物质跨膜运输的实例本节重点:观察植物细胞质壁分离和复原考点：1.渗透装置的原理：渗透作用（了解其发生条件）等渗是一种特殊的渗透作用（半透膜两侧浓度相等)实验室中的渗透装置涉及到高度差（平衡后高度越高，对应的浓度越大）2。

动物细胞吸水和失水（利用其吸水涨破的特性，进行制备细胞膜的实验）3.植物细胞的吸水和失水（由于某些植物细胞存在大液泡，会把细胞质挤成很薄的一层，所以植物细胞失水时会发生质壁分离的现象，注意这里的质是指的原生质层）4、植物细胞质壁分离和复原是细胞各个结构对应的名称，注意实验中的外界溶液为0。

3g/ml的蔗糖,选材是洋葱鳞片叶外表皮细胞（洋葱鳞片叶外表皮细胞的液泡是紫色，失水后和外界溶液有色差便于观察）应用:用黑藻叶片进行质壁分离实验（黑藻叶片中的叶绿体显绿色，液泡中细胞液的颜色接近无色,两者之间有颜色差异,因此叶绿体的存在不会干扰实验现象的观察）5．判断细胞能否发生质壁分离与复原(1)从细胞角度分析①死细胞、动物细胞及未成熟的植物细胞(如根尖分生区细胞）不发生质壁分离及复原现象。

②具有中央大液泡的成熟植物细胞可发生质壁分离及复原现象。

（2）从溶液角度分析①在一定浓度(溶质不能透膜）的溶液中只会发生质壁分离现象,不能自动复原(只有用清水或低渗溶液处理,方可复原)。

②在一定浓度（溶质可透膜）的溶液(如KNO3、甘油等）中可发生质壁分离后自动复原现象。

③在高浓度溶液中可发生质壁分离现象,但不会发生质壁分离复原现象。

6。

不同试剂对质壁分离和复原的影响分析（1）若使用浓度过高的蔗糖溶液，则质壁分离现象明显，但不能复原，因为溶液浓度过高，使细胞过度失水而死亡。

（2)若使用合适质量浓度的KNO3，NaCl、尿素、葡萄糖、乙二醇溶液，因为这些物质均可被细胞吸收,使细胞液浓度增大,所以细胞先发生质壁分离后又自动复原。

但浓度过高会使细胞失水过多而死亡.（3)若使用质量浓度为1 mol·L－1的醋酸溶液,则不发生质壁分离及复原现象。

1.膜蛋白有胞外区、跨膜区、胞内区。

跨膜区就是蛋白在细胞膜内的部分。

有的蛋白只有一个跨膜区，有的会有很多个跨膜区。

2，肽段可以既扮演信号肽作用，到了目的地发挥定位锚定作用的。

不是绝对的信号肽最终都要被剪切掉的3信号肽signal peptide：常指新合成多肽链中用于指导蛋白质跨膜转移（定位）的N-末端的氨基酸序列（有时不一定在N端），至少含有一个带正电荷的氨基酸，中部有一高度疏水区以通过细胞膜。

信号肽假说认为，编码分泌蛋白的mRNA在翻译是首先合成的是N末端带有疏水氨基酸残基的信号肽，它被内质网膜上的受体识别并与之相结合。

信号肽经由膜中蛋白质形成的孔道到达内质网内腔，随机被位于腔表面的信号肽酶水解，由于它的引导，新生的多肽就能够通过内质网膜进入腔内，最终被分泌到胞外。

4.信号肽-指在新合成的多肽链中用于指导蛋白质跨膜运输的氨基酸残基序列只有通过预测该蛋白有没有信号肽或跨膜域来判断该蛋白是膜蛋白或可溶性蛋白。

5．原核生物的蛋白运输机制原核生物细胞的结构比较简单，一般由细胞膜、细胞壁及周质空间等构成。

在细胞内合成的蛋白质需要通过转运到细胞的特定位置或分泌到细胞外行使其功能。

目前基于信号肽的蛋白运输途径研究主要有Sec途径和Tat途径。

基于信号肽的运输基本过程如下：核糖体上合成的新生肽，通过胞质中的各种定向伴侣蛋白识别N端信号肽，并引导其运送到膜上的移位机器上；使蛋白插入膜上或跨过膜分泌到膜外，此过程需要ATP或质子动力（pmf）供应能量；最后信号肽被剪除，蛋白折叠成正确构象。

1 信号肽及阻留(retention)信号此类信号决定新产生的蛋白运送到细胞的特定位置。

1.1 信号肽一般包括三个区域：N域、H域及C域。

现在鉴定的信号肽有：由SPaseI作用的信号肽I（通用的Sec信号肽），由SPaseII作用的信号肽II（脂蛋白的信号肽）及含模体R/K-R-x-#-#（＃为蔬水残基）的Tat信号肽。

1.2 各种运输到细胞特定结构上的蛋白有以下几种阻留信号：⑴跨膜域；⑵脂修饰作用（革兰氏阳性菌的脂蛋白经脂修饰后固定于外膜表面）；⑶细胞壁结合重复序列；⑷共价结合到细胞壁（一般N端有信号肽，C端有LPXGT/NPQTN的模体）。

物质跨膜转运的方式和各自的特点
物质跨膜转运是细胞内外物质交换的重要过程，它通过细胞膜上的蛋白通道或者载体蛋白来实现。

在细胞膜上，物质跨膜转运有两种主要的方式：主动转运和被动转运。

主动转运是细胞逆浓度梯度主动将物质由低浓度向高浓度方向转移的过程。

这一过程通常依赖于细胞内储存的能量，如腺苷三磷酸（ATP）的水解。

主动转运可分为原位转运和继承转运两种方式。

原位转运是指物质跨膜转运过程中外源能量直接参与，通过脱氧核苷酸的磷酸化和解磷酸高能键的方式实现。

继承转运则是指细胞内已存的能量矩阵通过转移向外源转运物质。

被动转运是细胞膜上物质自由通过膜的水平扩散来实现的过程。

被动转运的速率取决于物质浓度差和物质在膜上的可溶性。

受到物质性质的限制，被动转运方式主要包括简单扩散、浓度梯度扩散和电化学激励扩散等几种。

简单扩散是指没有利用细胞内储存的能量，而是通过物质自身的动力学原理，由高浓度区向低浓度区进行跨膜转运。

浓度梯度扩散则是指物质由高浓度区域向低浓度区域通过逐渐降低的浓度梯度进行转运。

而电化学激励扩散则是指离子根据膜电位和化学浓度梯度进行跨膜转运。

总体而言，物质跨膜转运是细胞内外物质交换的重要方式。

通过主动转运和被动转运两种方式，细胞能够灵活地调节物质的进出，维持细胞内外环境的平衡。

这些转运方式各自具有独特的特点和机制，对细胞的正常功能和生存至关重要。

物质跨膜运输跨膜层数分析外界空气中O2进入人体骨骼肌细胞被利用，至少要穿过的生物膜层数是11血浆中的1个葡萄糖分子进入组织细胞被彻底氧化分解，需要穿过3层细胞膜蛋白质的消化产物被人体所吸收并转化为组织蛋白的过程中，共穿过磷脂分子层数是141分子CO2从叶肉细胞的线粒体基质中扩散出来，进入一相邻细胞的叶绿体基质内，至少穿过的生物膜层数是6用同位素标记血液的葡萄糖分子，若该分子流经肾脏后又经过肾静脉流出，该分子穿过的细胞膜层数为0或8解析：m RNA属于生物大分子，mRNA是从核孔进入细胞质中与核糖体结合来完成翻译的，而原核细胞又无核膜。

因此，不管是什么细胞，其中的RNA分子从产生部位到作用场所都不需要穿过生物膜，即通过0层磷脂双分子层。

【例4】葡萄糖经小肠粘膜上皮进入毛细血管，需透过的磷脂分子层数是（）A 4层B 6层C 8层D 10层解析：首先要知道小肠粘膜上皮及其周围的毛细血管壁，都是由单层上皮细胞构成的；其次要明白葡萄糖经小肠进入毛细血管需穿过小肠粘膜上皮细胞和毛细血管壁细胞。

葡萄糖从小肠进入毛细血管一共要穿过4层细胞膜，而每层细胞膜都是由双层磷脂分子层构成。

所以共穿过8层磷脂分子层。

答案：C【例5】经内质网糖基化加工后的蛋白质分泌到细胞外需要经过的膜结构及穿过的膜层数分别为（）A.内质网→细胞膜，2层B.内质网→高尔基体→细胞膜，3层C.内质网→高尔基体→线粒体→细胞膜，4层D.内质网→高尔基体→细胞膜，0层解析：分泌蛋白形成的过程经过的途径为：内质网→高尔基体→细胞膜。

即经内质网糖基化加工后的蛋白质先通过内质网出芽形成小泡融合到高尔基体，接着高尔基体再出芽形成形成小泡融合到细胞膜，最后由细胞膜排出细胞外，而分泌蛋白始终没有穿过膜，而是以小泡的形式运输。

答案：D。

蛋白质序列分析蛋白质序列的基本性质分析是蛋白质序列分析的基本方面，一般包括蛋白质的氨基酸组成，分子质量，等电点，亲水性，和疏水性、信号肽，跨膜区及结构功能域的分析等到。

蛋白质的很多功能特征可直接由分析其序列而获得。

例如，疏水性图谱可通知来预测跨膜螺旋。

同时，也有很多短片段被细胞用来将目的蛋白质向特定细胞器进行转移的靶标(其中最典型的例子是在羧基端含有KDEL序列特征的蛋白质将被引向内质网。

WEB中有很多此类资源用于帮助预测蛋白质的功能。

基本理化性质分析：信号肽预测：在生物内，蛋白质的合成场所与功能场所常被一层或多层细胞膜所隔开，这样就涉及到蛋白质的转运。

合成的蛋白质只有准确地定向运行才能保证生命活动的正常进行。

一般来说，蛋白质的定位的信息存在于该蛋白质自身结构中，并通过与膜上特殊的受体相互作用而得以表达。

在起始密码子之后，有一段编码疏水性氨基酸序列的RNA片段，这个氨基酸序列就这个氨基酸序列就是信号肽序列。

含有信号肽的蛋白质一般都是分泌到细胞外，可能作为重要的细胞因子起作用，从而具有潜在的应用价值。

糖基化位点预测：跨膜区分析：TMORED蛋白质序列含有跨膜区提示它可能作为膜受体起作用，也可能是定位于膜的锚定蛋白或者离子通道蛋白等，从而，含有跨膜区的蛋白质往往和细胞的功能状态密切相关。

蛋白酶的结构功能进行预测和分析：同源建模分析：二级结构及折叠类预测：Predictprotein特殊结构或结构预测：COILS MacStripe疏水性分析：ExPASy的ProtScale基于序列同源性分析的蛋白质功能预测：至少有80个氨基酸长度范围内具有25%以上序列一致性才提示可能的显着性意义。

类似于核酸序列同源性分析，用户直接将待分析的蛋白质序列输入NCBI/BLAST()，选择程序BLASTP就可网上分析。

基于motif、结构位点、结构功能域数据库的蛋白质功能预测蛋白质的磷酸化与糖基化对蛋白质的功能影响很大，所以对其的分析也是生物信息学的一个部分。

培优讲堂(七)——物质在血浆、组织液等内环境与细胞之间的跨膜分析[疑难讲解]1．几种由单层细胞形成的结构人体中有很多由单层细胞构成的管状或泡状结构：如毛细血管、毛细淋巴管、小肠绒毛、肺泡、肾小球和肾小管等，这些非常薄的结构有利于物质交换，物质透过这些管壁或泡壁时，要经过两层细胞膜。

2．细胞、生物膜、磷脂双分子层、磷脂分子层数间的关系(1)1层细胞＝2层生物膜(2)1层生物膜＝1个磷脂双分子层＝2层磷脂分子(3)若物质出入细胞内的线粒体需多跨越线粒体内外膜(4层磷脂分子)3．外界空气中O2进入组织细胞被利用跨膜层数分析从图1可知，在肺通气和肺泡内的气体交换的过程中，O2要穿过肺泡壁(一层上皮细胞)、毛细血管壁(一层上皮细胞)及红细胞膜，共计5层生物膜，才能与血红蛋白结合；从图2可知，经过组织里的气体交换，O2进入组织细胞要透过红细胞膜、毛细血管壁(一层上皮细胞)和一层组织细胞的细胞膜(合计4层生物膜)，再加上O2最终要进入线粒体参与有氧呼吸，而线粒体是具有双层膜的细胞器，故共合计6层膜。

由此可知，外界空气中O2进入人体骨骼肌细胞被利用，至少要穿过的生物膜层数是11层。

4．消化道(小肠)中葡萄糖分子进入组织细胞被利用跨膜层数分析食物中的淀粉在消化道中被淀粉酶和麦芽糖酶分解成葡萄糖，主要在小肠中被吸收，其吸收过程如图所示：肠腔中的葡萄糖经过小肠绒毛上皮细胞(2层膜)＋绒毛内毛细血管壁(2层膜)＋组织处毛细血管壁(2层膜)＋组织细胞膜(1层膜)＝7层膜；而1层膜由2层磷脂分子构成，所以共穿过14层磷脂分子层。

[易错提醒](1)物质进入血浆后，由循环系统转运到全身各处的毛细血管，该过程是不跨膜的。

(2)分泌蛋白由合成至分泌出细胞跨膜层数为“0”①内质网上的核糖体合成肽链后直接进入内质网中加工，不跨膜。

②蛋白质在内质网中完成初步加工后，经“出芽”形成囊泡与高尔基体融合，不跨膜。

③高尔基体对蛋白质进一步加工后，成熟蛋白也以囊泡形式分泌，并与细胞膜融合，以胞吐方式分泌出细胞，整个过程均不跨膜。

1.膜蛋白有胞外区、跨膜区、胞内区。

跨膜区就是蛋白在细胞膜内的部分。

有的蛋白只有一个跨膜区，有的会有很多个跨膜区。

2，肽段可以既扮演信号肽作用，到了目的地发挥定位锚定作用的。

不是绝对的信号肽最终都要被剪切掉的3信号肽signal peptide：常指新合成多肽链中用于指导蛋白质跨膜转移（定位）的N-末端的氨基酸序列（有时不一定在N端），至少含有一个带正电荷的氨基酸，中部有一高度疏水区以通过细胞膜。

信号肽假说认为，编码分泌蛋白的mRNA在翻译是首先合成的是N末端带有疏水氨基酸残基的信号肽，它被内质网膜上的受体识别并与之相结合。

信号肽经由膜中蛋白质形成的孔道到达内质网内腔，随机被位于腔表面的信号肽酶水解，由于它的引导，新生的多肽就能够通过内质网膜进入腔内，最终被分泌到胞外。

4.信号肽-指在新合成的多肽链中用于指导蛋白质跨膜运输的氨基酸残基序列只有通过预测该蛋白有没有信号肽或跨膜域来判断该蛋白是膜蛋白或可溶性蛋白。

5．原核生物的蛋白运输机制原核生物细胞的结构比较简单，一般由细胞膜、细胞壁及周质空间等构成。

在细胞内合成的蛋白质需要通过转运到细胞的特定位置或分泌到细胞外行使其功能。

目前基于信号肽的蛋白运输途径研究主要有Sec途径和Tat途径。

基于信号肽的运输基本过程如下：核糖体上合成的新生肽，通过胞质中的各种定向伴侣蛋白识别N端信号肽，并引导其运送到膜上的移位机器上；使蛋白插入膜上或跨过膜分泌到膜外，此过程需要ATP或质子动力（pmf）供应能量；最后信号肽被剪除，蛋白折叠成正确构象。

1 信号肽及阻留(retention)信号此类信号决定新产生的蛋白运送到细胞的特定位置。

1.1 信号肽一般包括三个区域：N域、H域及C域。

现在鉴定的信号肽有：由SPaseI作用的信号肽I（通用的Sec信号肽），由SPaseII作用的信号肽II（脂蛋白的信号肽）及含模体R/K-R-x-#-#（＃为蔬水残基）的Tat信号肽。

1.2 各种运输到细胞特定结构上的蛋白有以下几种阻留信号：⑴跨膜域；⑵脂修饰作用（革兰氏阳性菌的脂蛋白经脂修饰后固定于外膜表面）；⑶细胞壁结合重复序列；⑷共价结合到细胞壁（一般N端有信号肽，C端有LPXGT/NPQTN的模体）。

三种分析蛋白结构域(Domains)的方法三种分析蛋白结构域(Domains)的方法1，SMART入门，蛋白结构和功能分析SMART介绍SMART (a Simple Modular Architecture Research Tool) allows the identification and annotation of genetically mobile domains and the analysis of domain architectures. More than 500 domain families found in signalling, extracellular and chromatin-associated proteins are detectable. These domains are extensively annotated with respect to phyletic distributions, functional class, tertiary structures and functionally important residues. Each domain found in a non-redundant protein database as well as search parameters and taxonomic information are stored in a relational database system. User interfaces to this database allow searches for proteins containing specific combinations of domains in defined taxa. For all the details, please refer to the publications on SMART.SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)，可以说是蛋白结构预测和功能分析的工具集合。