7实验七 大鼠肝S9的制备

分析检测灵芝菌丝毒理学安全性评价研究孙国强1，董金颖1，曹发昊2（1.山西瑞芝生物科技有限公司，山西运城 044000；2.运城学院，山西运城 044000）摘　要：目的：对灵芝菌丝的食用安全性进行毒理学评价研究。

方法：依照国家相关标准和规定，首先采用最大耐受剂量法开展大、小鼠急性经口毒性试验，然后开展遗传毒性试验，最后以5.00 g·kg-1、2.50 g·kg-1、1.25 g·kg-1 3个剂量开展大鼠30 d喂养实验，观察大鼠体重、进食量及血常规等的变化，评价其毒理学安全性。

结果：以5.00 g·kg-1最大给药量的样品灌胃，未出现中毒症状，也无死亡；3项遗传毒性试验的结果也均为阴性；与对照组相比，30 d喂养试验发现各个剂量组的大鼠各项指标差异均不具有统计学意义（P＞0.05）。

结论：灵芝菌丝是无毒、无遗传毒性产品，可被开发为供消费者食用的产品。

关键词：灵芝菌丝；毒理学；安全性评价The Toxicological Safety Evaluation of Ganoderma lucidumMyceliumSUN Guoqiang1, DONG Jinying1, CAO Fahao2(1.Shanxi Ruizhi Biotechnology Co., Ltd., Y uncheng 044000, China; 2.Y uncheng University, Y uncheng 044000, China)Abstract: Objective: To conduct a toxicological evaluation study on the food safety of Ganoderma lucidum mycelium. Method: In accordance with national standards and regulations, the acute oral toxicity test in rats and mice was firstly carried out by the maximum tolerated dose method, then the genotoxicity test was carried out, and finally the 30-days feeding experiment in rats was carried out at 3 doses of 5.00 g·kg-1, 2.50 g·kg-1 and 1.25 g·kg-1 to observe the changes in body weight, food intake and blood, and to evaluate the toxicological safety of Ganoderma lucidum mycelium. Result: No toxic symptoms and no death occurred when the sample was gavaged at the maximum dose of 5.00 g·kg-1; the results of the three genotoxicity tests were also negative; compared with the control group, the differences in the indexes of the rats in each dose group were not statistically significant in the 30-days feeding test (P ＞0.05). Conclusion: Ganoderma lucidum mycelium is a non-toxic, non-genotoxic product that can be developed as a product for consumer consumption.Keywords:Ganoderma lucidum mycelium; toxicology; safety assessment灵芝（Ganoderma lucidum）也叫瑞草、仙草等，为名贵的药用真菌[1]。

S9代谢活化酶系统制备及蛋白含量的测定何黎黎;杨立开;邓黎;龚涛;孙迅;张志荣【摘要】目的:研究有效的S9代谢活化酶系统的制备方法. 方法:采用苯巴比妥钠作为诱导剂制备大鼠肝S9, 并采用Lowry法测定所制备的S9蛋白含量. 结果:成功制得大鼠肝S9, 并测定其蛋白含量为38.66mg/ml. 结论:苯巴比妥钠作为诱导剂可以成功制备出大鼠肝S9.【期刊名称】《西南民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(036)002【总页数】3页(P243-245)【关键词】S9制备;蛋白含量测定【作者】何黎黎;杨立开;邓黎;龚涛;孙迅;张志荣【作者单位】西南民族大学化学与环境保护工程学院,四川成都,610041;四川大学华西药学院靶向药物与释药系统教育部重点实验室,四川成都,610041;四川大学华西药学院靶向药物与释药系统教育部重点实验室,四川成都,610041;四川大学华西药学院靶向药物与释药系统教育部重点实验室,四川成都,610041;四川大学华西药学院靶向药物与释药系统教育部重点实验室,四川成都,610041;四川大学华西药学院靶向药物与释药系统教育部重点实验室,四川成都,610041【正文语种】中文【中图分类】R9许多致癌剂的生物转化是依赖细胞内微粒体混合功能氧化酶系来完成的. 大鼠肝S9(Hepatic post-mitochondrial supernatant)是许多体外实验常用的体外活化系统, 其主要有效成分为混合功能氧化酶(mixed function oxidase , MPO) 系统, 其中许多酶共同组成电子传递体系, 其中细胞色素P450(CYP450)在整个酶系中起着末端氧化酶作用, 具有活化氧分子和与底物结合的双重功能. CYP450在氧化活动和底物结合中的作用决定其在MPO系统中起决定作用[1], 苯巴比妥钠是目前大鼠肝S9常用的诱导剂[2,3], 能诱导活化许多致癌性化学物所需要的细胞色素. 因此, 本文采用苯巴比妥钠作为诱导剂, 制备S9, 并采用Lowry法测定所制备的S9的蛋白含量,进而研究有效的S9代谢活化酶系统制备方法和测定方法.1.1 药品与试剂KCl(分析纯), 苯巴比妥钠(分析纯), MgCl2 6 H2O(分析纯)PBS缓冲液(自配), 6-磷酸葡萄糖(glucose-6-phosphate, Sigma, 美国), 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(辅酶Ⅱ, nicotinamide -adenine dinucleotide phosphate, NADP, Sigma, 美国), Lowry法蛋白测定试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)1.2 仪器冷冻高速离心机(Beckman, AllegraTMX-22R, 美国)；紫外可见分光光度计() 1.3 实验动物Sprague –Dawley大鼠, 雄性, 体重约200g/只(四川大学华西动物实验中心)2.1 肝酶系统的诱导用苯巴比妥钠诱导制备大鼠肝脏S9[2,4]. 将苯巴比妥钠用生理盐水配置成10mg/ml的溶液. 选用体重约200克的Sprague –Dawley雄性大鼠腹腔注射苯巴比妥钠溶液80mg/kg(每日一次), 连续给药三日. 于第四日断颈处死.2.2 大鼠肝S9的制备取采用苯巴比妥钠诱导大鼠, 处死后立即无菌条件下冲洗并取出肝脏. 立即用4℃含有1.15% of KCl 的0.01M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)灌洗肝脏. 再按3 ml/g 湿重的比例加入含有1.15% of KCl 的0.01M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)于冰浴中匀浆. 合并匀浆, 并于冷冻高速离心机中9000×g离心30min, 取其上清液即为S9. 蛋白质含量按 Lowry 法测定. 测定合格者, 用离心管分装为1.0ml/管, -80℃冰箱中保存, 在实验使用前将冷冻的S9 缓慢融化. 将1 ml S9, 0.33 ml 1 M KCl, 0.32 ml 0.25 M MgCl2 6 H2O, 0.25 ml 0.2 M 6-磷酸葡萄糖, 1 ml 0.04 M NADP, 2.10 ml去离子水和5 ml 磷酸盐缓冲液 (pH 7.4)配制成代谢酶活化系统[5,6].2.3 Lowry法测定S9中蛋白含量2.3.1 标准曲线的绘制取6个带盖的1.5 ml离心管, 编好号后, 按下表顺序加入试剂：每管加入碱性铜试剂工作液后需立即混匀, 20～25℃放置10min后加入Folin-酚试剂, 混匀后, 20～25℃放置30min后在660nm下比色测定(1ml比色杯, 1cm光径测定). 以蛋白含量(μg/μl)为横坐标, 吸光值为纵坐标, 绘出标准曲线；2.3.2 自制S9样品的蛋白浓度测定分别取3份分装后的大鼠肝S9样品, 生理盐水稀释100倍, 取样品稀释液总体积为200μl, 加入碱性铜试剂工作液1000μl, 充分混匀, 置20～25℃水浴保温10分钟后, 加入1N Folin-酚试剂100μl, 20～250C放置30min后, 以标准曲线0号管做参比, 在660nm波长下比色, 记录吸光值. 根据所测样品的吸光值, 在标准曲线上即可查得相应的蛋白质含量(μg/μl), 乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度.3.1 Lowry法测定蛋白含量的标准曲线按照lowry法, 采用蛋白质标准工作液进行测定, 将蛋白含量对紫外可见吸收值(OD)作图, 得到标准曲线, OD=0.7662×C+0.0086, R2=0.9928, 线性关系良好, 线性范围为：0.1mg/ml-0.5mg/ml.3.2 自制大鼠肝S9蛋白质含量的测定根据3份自制大鼠肝S9稀释液测得的平均吸光度(OD值), 带入蛋白含量测定标准曲线, 即可求得平均蛋白含量. 测得所制备的大鼠肝S9平均蛋白含量为38.66mg/ml.在制备S9混悬液过程中, 应注意用新鲜冰冷的0.15 mol/l氯化钾溶液连续冲洗肝脏数次,以便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白. 所制备得到的S9应测定蛋白浓度[1,2], 本实验应用Lowry法测定大鼠肝S9 蛋白浓度, 其显色原理为Folin酚试剂与蛋白质的酷氨酸和色氨酸残基反应显蓝色, 可采用紫外分光光度法测定吸收值测定.【相关文献】[1] 王亚其, 李宏霞, 肖凯, 等. 两种诱导方法制备大鼠肝S9在两种遗传毒性试验中活性比较[J]. 现代预防医学, 2006, 33(4):457-459.[2] FABIANI R, ROSIGNOLI P, BARTOLOMEO AD, et al. DNA-damaging ability of isoprene and isoprene mono-epoxide (EPOX I) in human cells evaluated with the comet assay[J]. Mutat Res, 2007, 629: 7-13.[3] 程培英, 曲桂娟, 马红霞, 董晓庆. 苷肽注射液对鼠致突变作用的研究[J]. 吉林农业大学学报, 2007, 29 (3) :334-337.[4] AARON CS, BOLCSFOLDI G, GLATT HR, et al. Mammalian cell gene mutation assays working group report[J]. Mutat Res, 1994, 312: 235-239.[5] EREXSON GL, PERIAGO MV, SPICER C S. Differential sensitivity of Chinese hamster V79 and Chinese hamster ovary (CHO) cells in the in vitro micronucleus screening assay[J]. Mutation Research, 2001, 495: 75-80.[6] EKE D, CELIK A. Genotoxicity of thimerosal in cultured human lymphocytes with and without metabolic activation sister chromatid exchange analysis proliferation index and mitotic index[J]. Toxicology in vitro, 2008, 22: 927-934.。

文献综述：鼠伤寒沙门氏菌试验（Ames试验）摘要：食品安全无论如何怎样强调都不会过分，迅速而准确地检测致癌物质是食品安全问题的重要方面。

美国科学家Dr. Bruce Ames及其同事创立了一种方法，叫鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验（Ames试验），它是利用一组组氨酸营养缺陷型菌株加入待测物在有或没有微粒体活化系统条件下，发生回复突变的特征鉴定化学物质的诱变活性，现已成为初步筛选化学物潜在致突变的首选方法。

关键词：鼠伤寒沙门氏菌试验；基本原理；一般步骤；应用及其研究进展；1 前言污染物对人体的潜在危害，引起人们的普遍关注。

世界上已发展了百余种短期快速测试法，检测污染物的遗传毒性效应。

美国科学家Dr. Bruce Ames等经十余年努力，于1975年建立并不断发展完善的沙门氏菌回复突变试验（亦称Ames试验）已被世界各国广为采用。

该法比较快速、简便、敏感、经济，且适用于测试混合物，反映多种污染物的综合效应。

众多学者有的用Ames试验检测食品添加剂、化妆品等的致突变性，由此推测其致癌性；有的用Ames试验检测水源水和饮用水的致突变性（比如，美国派斯净水器就通过了Ames 试验），探索较现行方法更加卫生安全的消毒措施；或检测城市污水和工业废水的致突变性，结合化学分析，追踪污染源，为研究防治对策提供依据；有的检测土壤、污泥、工业废渣堆肥、废物灰烬的致突变性，以防止维系生命的土壤受致突变物污染后，通过农作物危害人类；检测气态污染物的致突变性，防止污染物经由大气，通过呼吸对人体发生潜在危害；用Ames 试验研究化合物结构与致变性的关系，为合成对环境无潜在危害的新化合物提供理论依据；检测农药在微生物降解前后的致突变性，了解农药在施用后代谢过程中对人类有无隐患；还有用Ames试验筛选抗突变物，研究开发新的抗癌药等等[1]。

2 定义2.1 回复突变（Reverse mutation）细菌在化学致突变物作用下由营养缺陷型回变到原养型(prototroph)。

绞股蓝丹参三七提取物混合粉毒理学安全性评价【摘要】目的进行绞股蓝丹参三七提取物混合粉毒理学安全性评价。

方法采用限量法的雌、雄性大鼠急性经口毒性试验，遗传毒性试验（细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验），90天经口毒性试验，致畸试验。

结果在本试验条件下，绞股蓝丹参三七提取物混合粉雌、雄性大鼠急性经口毒性试验的LD50大于20.0g/kg.bw，根据急性毒性剂量分级标准，该样品属实际无毒级；细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验结果均为阴性；绞股蓝丹参三七提取物混合粉以5g/kg.bw、10g/kg.bw、15g/kg.bw的剂量经口给予大鼠90天，受试动物一般情况良好，体重、食物利用率、脏器重量、脏器系数均无异常改变；眼部检查未发现异常变化；尿液指标、血液学指标及生化指标结果显示，各项指标均在正常范围内；各脏器病理组织学检查均未见与受试样品有关的病理改变。

绞股蓝丹参三七提取物混合粉对大鼠未见母体毒性、胚胎毒性和致畸性。

结论绞股蓝丹参三七提取物混合粉长期食用是安全的。

【关键词】绞股蓝；丹参；三七；毒理学绞股蓝［Gynostemma Pentaphyllum（Thumb）Mak］又名“七叶胆”，是葫芦科绞股蓝属植物。

经临床及实验证明，绞股蓝具有抗疲劳，降低过氧化脂质，促进细胞新陈代谢以及临床治疗气虚、阳虚、白发及防治老年病、抗癌方面有积极作用[1]。

《中华人民共和国药典》则归纳丹参的功用为祛瘀止痛，活血通经，清心除烦”。

说明丹参具有多方面的功效。

在临床应用方面丹参制剂可用于治疗心血管系统疾病如冠心病、缺血性卒中等。

使我们对丹参的认识更加全面和深入[2]。

三七是中国的特有药用植物，三七可止血生肌、活血化瘀、消肿定痛、补血健体。

到近代三七应用广泛，已被列为“参茸桂七”并列名药之首。

同时数百成方中加入三七使皆得益彰，就是在名药“云南白药”中亦是重要的原料之一。

胃肠安丸的CHL细胞染色体畸变试验研究单位：军事医学科学院毒物药物研究所国家北京药物安全评价研究中心专题负责人：马华智（高级实验师）实验操作人员：孙艳丽（助理实验师）闫小娇（实验员）质量保证人员：廖明阳（研究员）盛和章（实验师）郭巧珍（实验师）王建京（助理实验师）摘要用中国仓鼠肺成纤维细胞（CHL）染色体畸变试验检测胃肠安丸的遗传毒性。

培养细胞计数法测定胃肠安丸对CHL细胞的毒性，毒性实验结果显示胃肠安丸在3.1–3200.0μg/ml浓度下，染毒4小时和32小时的细胞生长半数抑制浓度（IC50）大于3200μg/ml。

染色体畸变试验中胃肠安丸设三个受试浓度，为800.0、1600.0与3200.0μg/ml。

两种染毒条件：1）在S9活化和非活化系统条件下染毒4小时，在用新鲜培养基培养至32小时；2）在非活化系统条件下连续染毒32小时。

实验同时设溶剂对照组及阳性对照组。

每组镜下观察200个中期分裂相细胞，观察染色体结构畸变及裂隙细胞发生率，同时计数200个中期分裂相细胞中的数目畸变率。

结果表明，胃肠安丸在上述染毒条件下均不诱发CHL细胞染色体畸变率增高，畸变率均在5%以内，也不诱发染色体数目畸变及裂隙细胞数增加，与溶剂对照相比均无明显的改变。

研究目的胃肠安丸具有芳香化浊，理气止痛，健胃导滞的作用，用于消化不良引起的腹泻，肠炎，菌痢，脘腹胀满，腹痛，食积乳积。

本试验参照国家药品监督管理局关于新药临床前毒理学评价《遗传毒理学研究技术指导原则》的有关要求，用CHL细胞染色体畸变试验评价胃肠安丸的致突变性。

1.材料与方法1.1供试品和对照品：1.1.1供试品基本信息：名称：胃肠安丸批号：A109127供试品编号：-----纯度：每毫升含量相当于80毫克生药。

理化性质：棕红色水溶液。

供试品稳定性和保管（对温度、湿度、光线的要求及保存条件）：在密封、避光、室温条件下保存。

供试品配制方法：用水稀释成其它浓度的使用溶液。

化妆品安全技术规范附件2细菌回复突变试验Bacterial Reverse Mutation Assay1 范围本规范确定了细菌回复突变试验的基本原则、要求和⽅法。

本规范适⽤于化妆品原料及其产品的基因突变检测。

2定义2.1 回复突变 reverse mutation细菌在化学致突变物作⽤下由营养缺陷型回变到原养型(prototroph)。

2.2 基因突变 gene mutation在化学致突变物作⽤下细胞D NA 中碱基对的排列顺序发⽣变化。

2.3 碱基置换突变 base substitution mutation引起D NA 链上⼀个或⼏个碱基对的置换。

碱基置换有转换(transition)和颠换(transversion)两种形式。

转换是D NA 链上的⼀个嘧啶被另⼀嘧啶所替代，或⼀个嘌呤被另⼀嘌呤所代替。

颠换是D NA 链上的⼀个嘧啶被另⼀嘌呤所替代，或⼀个嘌呤被另⼀嘧啶所代替。

2.4 移码突变 frameshift mutation引起D NA 链上增加或缺失⼀个或多个碱基对。

2.5 细菌回复突变试验Bacterial reverse mutation assay利⽤⼀组组氨酸或者⾊氨酸缺陷型试验菌株测定引起细菌碱基置换或移码突变的化学物质所诱发的氨基酸缺陷型→原养型回复突变的试验⽅法。

2.6 S9经多氯联苯(PCB混合物)或苯巴⽐妥钠和β-萘黄酮结合诱导的⼤⿏制备肝匀浆，在9000g 下离⼼10min 后的肝匀浆上清液。

3 原理⿏伤寒沙门⽒组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸，故在缺乏组氨酸的培养基上，仅少数⾃发回复突变的细菌⽣长；⼤肠杆菌⾊氨酸营养缺陷型菌株不能合成⾊氨酸，故在缺乏⾊氨酸的培养基上，仅少数⾃发回复突变的细菌⽣长。

假如有致突变物存在，则营养缺陷型的细菌回复突变成原养型，因⽽能⽣长形成菌落，据此判断受试物是否为致突变物。

某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变，故需加⼊经诱导剂诱导的⼤⿏肝制备的S9混合液。

体外哺乳动物细胞TK基因突变试验原理及注意事项TK基因突变试验的检测终点是TK基因的突变。

TK基因突变属于常染色体基因突变。

TK基因的产物胸苷激酶在体内催化从脱氧胸苷(TdR)生成胸苷酸(TMP)的反应。

在正常情况下，此反应并非生命所必需，原因是体内的TMP主要来自于脱氧尿嘧啶核苷酸(dUMP),即由胸苷酸合成酶催化的dUMP甲基化反应生成TMP。

但如在细胞培养物中加入胸苷类似物(如三氟胸苷,即trifluorothymidine,TFT)，则TFT在胸苷激酶的催化下可生成三氟胸苷酸，进而掺入DNA，造成致死性突变,故细胞不能存活。

若TK基因发生突变，导致胸苷激酶缺陷,则TFT不能磷酸化，亦不能掺DNA，故突变细胞在含有TFT的培养基中能够生长，即表现出对TFT的抗性。

根据突变集落形成数可计算突变频率，从而推断受试物的致突变性。

在TK基因突变试验结果观察中可发现两类明显不同集落，即大/小集落(L5178Y细胞)或正常生长/缓慢生长集落(TK6细胞)，有研究表明，大集落/正常生长集落主要由点突变或较小范围的缺失等引起，而小集落/缓慢生长集落主要由较大范围的染色体畸变，或由涉及调控细胞增殖的基因缺失引起。

北京汇智泰康医药技术有限公司针对小鼠淋巴瘤细胞TK基因突变试验开发染TK基因突变试剂盒，本试剂盒针对小鼠淋巴瘤细胞L5178Y开展TK基因突变试验，试剂盒省去了阳性底物成分、筛选培养基准备、诱导 S9 制备，可以直接使用，大大缩短了实验周期；试剂盒各成分均经过严格的质量检测，无杂菌污染，诱导 S9 活性均符合小鼠淋巴瘤细胞TK基因突变试验要求，实验结果准确、可靠、重现性高。

染色体畸变试验试剂盒应用广泛，可进行食品、化学品、农药、消毒剂、食品添加剂、药物残留、化妆品、容器与包装材料等多个方面的遗传毒理学检测。

TK基因突变试验导则1 范围本标准规定了体外哺乳类胸苷激旃(thymidine kinase TK)基因突变试验的基本试验方法与技术要求。