葡聚糖凝胶色谱原理

凝胶色谱法分离原理
在凝胶色谱法中，样品溶液滴加在凝胶柱中，随后样品分子将自由扩散进入凝胶基质内，形成一定的扩散层。

扩散层内的样品分子将受到凝胶基质的孔道大小限制，较大分子会较快地被孔道阻断，无法进一步扩散，而较小的分子则能较容易地扩散到较深的凝胶基质内。

由于扩散系数和凝胶孔道大小的关系，不同分子尺寸的物质在固定时间内扩散距离不同。

因此，通过调节色谱柱的选择性和操作条件，可以分离目标样品和其他杂质。

凝胶色谱法还可通过改变溶剂系统中的组分来调节管柱内的溶剂力和吸附条件，以改变物质在凝胶色谱柱中的保留时间。

例如，可以通过改变聚丙烯酰胺凝胶中的丙烯酰胺浓度来调节凝胶孔道的大小，从而实现对特定分子尺寸的选择性分离。

此外，凝胶色谱法还可以根据分子的电荷性质进行分离。

例如，对于蛋白质的分离，可以使用聚丙烯酰胺凝胶和SDS-聚丙烯酰胺凝胶。

在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，SDS（阴离子型表面活性剂）可以使蛋白质分子全部带上负电荷，从而根据其电荷大小进行分离。

总的来说，凝胶色谱法的分离原理是基于样品分子在凝胶柱中的扩散和滤过作用，通过调节凝胶孔道大小、溶剂组分和电荷性质等因素，可以实现对分子尺寸和性质的选择性分离。

凝胶色谱法在分析和纯化生物大分子方面具有广泛应用，并且可与其他技术相结合，如质谱联用、核酸测序等。

实验五. 葡聚糖凝胶层析【实验目的】1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。

2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。

【实验原理】凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤，是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术，这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法。

层析的固定相载体是凝胶颗粒，目前应用较广的是：具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）。

葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3—氯1，2—环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。

凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制，交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松，网孔的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。

可分离的分子量范围从几百到几十万不等。

葡聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。

分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。

若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间，则在两者之间从柱中流出，由此就可以达到分离目的。

本实验以葡聚糖凝胶G—25作为固定相载体，来分离蓝色葡聚糖—2000和溴酚蓝。

蓝色葡聚糖—2000分子量接近2×106，而溴酚蓝分子量为670，二者分子量相差较大，前者完全排阻，而后者则可完全进入凝胶颗粒网孔内，二者通过层析柱的时间不同而分开。

【实验材料】1.实验器材层析柱(1×20cm)附有一小段乳胶管及螺旋夹；洗脱液瓶(带下口的三角瓶，250m1)；试管及试管架；量筒10m1；721型分光光度计2.实验试剂(1) Tris—醋酸缓冲液(pH7.0):取0.0lmol/L Tris溶液(含0.1mol/L KCl)900m l，用浓醋酸调pH至7.0，加蒸馏水至1000m1。

葡聚糖凝胶分离原理葡聚糖凝胶分离原理是指利用葡聚糖凝胶作为分离介质，根据分子的大小、形状以及电荷等性质进行分离的原理。

这是一种普遍应用于生物大分子分离、纯化的方法，也被广泛应用于各种生物学研究和生产中。

下面我们来分步骤阐述葡聚糖凝胶分离原理。

第一步：准备葡聚糖凝胶首先需要准备葡聚糖凝胶，也叫葡聚糖凝胶珠。

葡聚糖凝胶是一种由葡萄糖聚合而成的大分子化合物，具有空心珠状结构，内部的孔道大小可以通过调整反应条件来控制。

一般来说，制作葡聚糖凝胶是通过交联反应来实现的。

这个反应可以在空气中进行，也可以在水中进行。

反应结束之后，需要将凝胶珠洗涤干净并保存。

（此处省略反应式，不过可以考虑简单描述制作过程）第二步：根据分子大小选用不同的葡聚糖凝胶根据待分离分子的大小，可以选用孔径不一的葡聚糖凝胶珠进行分离。

一般来说，凝胶珠的孔径越大，可以分离的大分子也就越大。

因此，选用合适的葡聚糖凝胶对于分离大分子很关键。

第三步：将待分离混合物加入到葡聚糖凝胶柱中将待分离的混合物加入到葡聚糖凝胶柱中，通常是通过上一端加样，并在另一端接收洗脱液来实现。

当待分离混合物进入凝胶柱后，各种组分便可以进入到凝胶珠中。

此时，分子会因为凝胶珠孔道大小的排斥，或者是因为电荷、极性等原因而被分离开来。

第四步：使用洗脱液进行洗脱分离的分子在分子分离的过程中，分子部分会被“捕获”在葡聚糖凝胶中，而另外一部分则会穿过凝胶珠而漏出柱外。

因此，需要通过洗脱液来脱离已分离出的分子，将它们从凝胶珠中洗脱出来。

一般来说，选择适当的洗脱液并采用合适的洗脱方法，可以获得高纯度和高产率的分离产品。

以上就是葡聚糖凝胶分离原理的分步骤阐述。

葡聚糖凝胶分离原理被广泛地应用于各种生物学实验中，如生物大分子的分离纯化，蛋白质的组分分析等等。

通过掌握葡聚糖凝胶分离原理，我们可以更好地理解生物大分子之间的关系，优化生物大分子的纯化过程，提高生物制品的纯度和质量。

凝胶色谱法凝胶色谱法添加摘要凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需凝胶色谱系统要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。

凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。

凝胶色谱法主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。

目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。

凝胶色谱法-分类根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC）和凝胶渗透色谱（GPC）。

凝胶过滤色谱一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。

凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱凝胶色谱仪溶剂主要是水。

凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶的高聚物 (聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等) 相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。

凝胶色谱不但可以用于分离测定高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布，同时根据所用凝胶填料不同，可分离油溶性和水溶性物质，分离相对分子质量的范围从几百万到100以下。

近年来，凝胶色谱也广泛用于分离小分子化合物。

化学结构不同但相对分子质量相近的物质，不可能通过凝胶色谱法达到完全的分离纯化的目的。

凝胶渗透色谱技术原理凝胶色谱法-分子筛效益一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。

大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。

小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。

高效凝胶渗透色谱法测定多糖纯度及分子量一、本文概述多糖作为一种重要的生物大分子，广泛存在于自然界中，具有多种生物活性，如免疫调节、抗病毒、抗肿瘤等。

因此，对多糖的纯度及分子量的准确测定对于其研究和应用具有重要意义。

高效凝胶渗透色谱法（High Performance Gel Permeation Chromatography，HPGPC）是一种常用的多糖纯度及分子量测定方法，具有操作简便、分辨率高、重现性好等优点。

本文旨在介绍HPGPC法测定多糖纯度及分子量的原理、实验步骤、数据处理及注意事项，以期为多糖的研究和应用提供参考。

二、实验材料与方法1 多糖样品：选择待测定的多糖样品，确保其来源清晰，无杂质污染。

2 高效凝胶渗透色谱（HPGPC）柱：选择适当型号的HPGPC柱，以适用于待测多糖样品的分子量范围。

3 流动相：通常选用适当的溶剂或缓冲液作为流动相，以保证多糖样品在色谱柱上的良好分离。

4 检测器：使用示差折光检测器（RI）或紫外检测器（UV）等，以监测多糖样品在色谱柱上的分离情况。

5 其他试剂与仪器：包括样品制备所需的试剂、色谱仪、注射器、进样针等。

1 样品制备：将多糖样品溶解在适当的溶剂中，制备成一定浓度的溶液，以便进行后续分析。

2 色谱条件优化：通过预实验，优化色谱条件，包括流动相的选择、流速、柱温等，以获得最佳的分离效果。

3 进样与分离：将制备好的多糖样品溶液通过注射器注入HPGPC 仪中，通过色谱柱进行分离。

在分离过程中，利用检测器监测多糖样品的分离情况。

4 数据收集与处理：收集分离过程中的数据，利用相应软件对数据进行处理和分析，包括分子量计算、纯度分析等。

5 结果评价：根据分析结果，评价多糖样品的纯度及分子量分布情况，为后续研究提供依据。

通过以上实验材料与方法，可以高效地进行多糖纯度及分子量的测定，为后续多糖的结构研究、质量控制等提供重要支持。

三、实验结果与讨论在本研究中，我们采用了高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）对多糖样品的纯度和分子量进行了测定。

【凝胶⾊谱法的原理和⽅法】⾎红蛋⽩的提取和分离【课题】：课题6 ⾎红蛋⽩的提取和分离【备课⼈】：【备课时间】：【上课时间】：【课型】：复习【课时数】：1课时【复习⽬标】本课题通过尝试对⾎液中⾎红蛋⽩的提取和分离，使学⽣能够体验从复杂体系中提取⽣物⼤分⼦的基本过程和⽅法，并了解⾊谱法、电泳法等分离⽣物⼤分⼦的基本原理，为今后学习运⽤这些技术打下基础。

【复习重点与难点】复习重点：凝胶⾊谱法的原理和⽅法。

复习难点：样品的预处理；⾊谱柱填料的处理和⾊谱柱的装填。

【知识回顾】：⼀、实验原理蛋⽩质的物化理性质：形状、⼤⼩、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和⼒等千差万别，由此提取和分离各种蛋⽩质。

1．凝胶⾊谱法（分配⾊谱法）：（1）原理：分⼦量⼤的分⼦通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分⼦量⼩的分⼦穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。

（2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。

（3）分离过程：混合物上柱→洗脱→⼤分⼦流动快、⼩分⼦流动慢→收集⼤分⼦→收集⼩分⼦＊洗脱：从⾊谱柱上端不断注⼊缓冲液，促使蛋⽩质分⼦的差速流动。

（4）作⽤：分离蛋⽩质，测定⽣物⼤分⼦分⼦量，蛋⽩质的脱盐等。

2．缓冲溶液（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3，HC－NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的⽤量，可配制不同pH的缓冲液。

（2）缓冲液作⽤：抵制外界酸、碱对溶液pH的⼲扰⽽保持pH稳定。

3．凝胶电泳法：（1）原理：不同蛋⽩质的带电性质、电量、形状和⼤⼩不同，在电场中受到的作⽤⼒⼤⼩、⽅向、阻⼒不同，导致不同蛋⽩质在电场中的运动⽅向和运动速度不同。

（2）分离⽅法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。

（3）分离过程：在⼀定pH下，使蛋⽩质基团带上正电或负电；加⼊带负电荷多的SDS，形成“蛋⽩质－SDS复合物”，使蛋⽩质迁移速率仅取决于分⼦⼤⼩。

⼆、实验步骤1．样品处理①红细胞的洗涤洗涤红细胞的⽬的是去除杂蛋⽩，采集的⾎样要及时采⽤低速短时间离⼼分离红细胞，然后⽤胶头吸管吸出上层透明的黄⾊⾎浆，将下层暗红⾊的红细胞液体倒⼊烧杯，再加⼊五倍体积的⽣理盐⽔，缓慢搅拌10min，低速短时间离⼼，如此重复洗涤三次，直⾄上清液中没有黄⾊，表明红细胞已洗涤⼲净。

吸附色谱：吸附色谱是利用吸附剂对被分离化而实现分离的一类色谱。

（常用吸附剂包括硅胶、氧化铝、活性炭、聚酰胺）凝胶过滤色谱：凝胶过滤色谱原理主要是分子筛作用，根据凝胶的孔径大小和被分离化合物分子大小而达到分离目的。

（常用葡聚糖凝胶、羟丙基葡聚糖凝胶）离子交换色谱：主要基于混合物中各成分解离子交换剂有离子交换树脂、离子交换纤维和离子交换凝胶三种。

大孔树脂色谱：大孔树脂是一类没有可解离不溶于水的固体高分子物质。

它可以通过物理吸附有选择地吸附有机物质而达到分离的目的（反相色谱）。

分配色谱：利用被分离物质在固定相和流动（正相色谱：固定相极性大于流动相）ORD：旋光光谱，用不同波长（200-760nm）并利用波长对比旋光度或者摩尔旋光度作图所得的曲线即旋光谱。

CD：圆二色谱，根据眩光化合物对组成平面数的测定来推断化合物的构型和构象、确定某些官能团在手性分子中的位置。

糖（saccharides）：是多羟基醛或者多羟基苷类(glycosides)：是糖或糖的衍生物与另的一类化合物，又称为配糖体。

苷中的非糖部分称为苷元或配基。

醌类化合物：是中药中一类具有醌式结构的苯丙素类（phenylpropanoids）：是指基本母机化合物类群，是一类广泛存在于中药中的天然产物，具有多方面的生理活性。

香豆素（coumarins）：是一类具有苯骈α－在结构上可以看成是顺势邻羟基桂皮酸脱水而形成的内酯类化合物。

木脂素（lignans）:一类由两分子苯丙素衍主要存在于植物的木部和树脂中，多数呈游离状态，少数与糖结合成苷。

黄酮类化合物（flavonoids）：主要是指基本母核为2-苯基色原酮的一系列化合物，（泛指两个苯环通过三个碳原子相互联结而成的一系列化合物）在植物体内由莽草酸和乙酸-丙二酸复合途径转化而成。

诊断试剂：其主用作用是使样品生成其酚盐（生成络合物）。

其结果引起样品在ＵＶ中的吸收波长发生位移，根据位移变化的大小来判断其结构特点从而提供重要的信息。