蛋白FITC标记及葡聚糖凝胶柱使用

葡聚糖凝胶的处理、装柱及平衡
（1）柱材处理
称取一定量的Sephadex G-200干粉，加无离子水或蒸馏水浸泡溶胀48h,去掉悬浮的细微颗粒，为防止凝胶颗粒中的空气存在，影响层析效果，凝胶装柱前一定要将凝胶液中的气体除掉，其办法是将凝胶液放进抽滤瓶中，进行抽真空处理，
直到凝胶液中没有气泡出现为止。

（2）装柱
将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中装有适宜浓度的凝胶液（凝胶的浓度过高会产生气泡，影响蛋白质分离速度，浓度过低易产生凝胶分层，影响蛋白质的分离效果）轻轻倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降在层析柱底部，凝胶沉积直到离层析柱上端1.5-2cm处，停止装柱，剪一与柱内径相等的滤纸片覆盖于凝胶上。

层析柱上端
进液口连接恒流泵，下出液口连接蛋白质监测仪，待层析柱的平衡。

（3）平衡
在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡，所谓平衡就是将层析柱中的溶液用层析过程的缓冲液（洗脱液）置换出来，使层析柱中的缓冲系统与柱层析过程中的系统一致。

其方法是：利用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内，打开层析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，当下出口流出液的PH值与平衡缓冲液的PH值一致时，层析柱达到了平衡。

在本实验中，用0.002M Tris-HCL 缓冲液PH7.4(内含0.0001M EDTA)，平衡Sephadex G-200凝胶。

2．上样：将粗酶液上柱。

3．洗脱：用0.02M Tris-HCL缓冲液Ph7.4（内含0.001M EDTA）洗脱，收集洗脱液进行酶活性、蛋白质浓度、聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量的基本性质分析测定。

葡聚糖凝胶柱的使用方法一、准备工作：1.准备好葡聚糖凝胶柱和所需的缓冲液，如PBS（磷酸盐缓冲液）、TBS（三甲基氨基甲烷缓冲液）等。

2.将葡聚糖凝胶柱放入柱层析设备中，并根据设备的要求进行调整和固定。

3.预冲柱层析设备和葡聚糖凝胶柱，以去除可能的污染和杂质。

二、样品处理：1.将待纯化的生物大分子样品先进行预处理，如去除悬浮物、离心沉淀等。

2.将样品溶液以适当的缓冲液进行稀释，以达到最佳的样品浓度和适合葡聚糖凝胶柱操作的样品体积。

三、样品加载：1.将处理好的样品溶液缓慢地倒入柱顶，让样品从柱顶进入柱内。

避免产生气泡。

2.分子在葡聚糖凝胶柱中会根据分子大小和亲疏水性质的不同而发生分离和吸附。

较大分子会在柱上层析，而较小分子会透过凝胶层均匀流出。

因此，样品会在柱内逐渐被分离和纯化。

四、缓冲液流动：1.样品完成加载后，使用适当的缓冲液进行柱洗涤，以洗掉非特异结合的杂质。

2.缓冲液的选择应根据样品的性质而定，具体的选择和流动条件可以参考相关的文献或经验。

五、洗脱纯化：1.在用于洗脱纯化的缓冲液中，调整适当的条件以实现目标分子的洗脱。

如调整pH值、离子浓度、添加洗脱剂等。

2.根据分子的亲疏水性质，选择适当的缓冲液浓度梯度进行洗脱。

一般来说，较强亲疏水性的分子需要更高浓度的洗脱缓冲液。

六、收集洗脱液：1.将洗脱液通过柱底收集，收集不同时间点或不同分析目的的洗脱液。

2.根据实验需要，将洗脱液分为不同部分进行后续的分析或纯化处理。

七、重复使用：1.柱层析后，葡聚糖凝胶柱可以进行再生，以重复使用。

具体的再生方法可以参考柱层析设备和葡聚糖凝胶柱的说明书。

总结：葡聚糖凝胶柱是一种常用的生物大分子纯化方法，通过分子在柱内的分离和纯化来实现样品纯化的目的。

使用葡聚糖凝胶柱时，需要根据样品的特性和需求进行适当的样品处理、缓冲液选择、洗脱纯化条件的优化等。

如操作规范且配合适当的实验条件，葡聚糖凝胶柱可以快速、高效地纯化和富集生物大分子。

葡聚糖凝胶使用说明书一、产品名称产品名称：葡聚糖凝胶型号:Gel-300二、适用范围葡聚糖凝胶适用于生物实验室、化学实验室、制药厂等场所，用于分离、纯化蛋白质、核酸、肽类等生物分子。

三、使用方法1.准备葡聚糖凝胶和缓冲液。

根据所需的分离纯化效果，选择合适的缓冲液类型和浓度。

2.将缓冲液加入玻璃柱或层析柱中，直至填满整个柱子。

3.加入适量的葡聚糖凝胶，使其均匀分布在柱子的底部。

4.将样品溶液缓慢地加入柱子中，注意不要过快，以免影响分离效果。

5.收集洗脱液，并进行分析。

根据分离纯化的目的，可以采用不同的收集方法，如分步收集或集中收集。

6.在每次使用后，及时清洗和保存凝胶柱，以延长其使用寿命。

四、注意事项1.在使用葡聚糖凝胶前，应仔细阅读本说明书并遵守操作规程。

2.避免直接接触皮肤和眼睛，若不慎接触，应立即用清水冲洗。

3.使用过程中要避免剧烈震动或晃动，以免影响分离效果。

4.在使用前应确认所需缓冲液的种类和浓度是否合适，避免浪费和影响分离效果。

5.不要使用已经过期或变质的凝胶和缓冲液。

6.在储存和使用过程中要保持环境干燥，避免潮湿和高温。

7.使用后要及时清洗和保存凝胶柱，以免被污染和变质。

五、常见问题及解决方案1.分离效果不佳：可能是由于凝胶或缓冲液质量问题、操作不当等原因引起的。

解决方法是检查凝胶和缓冲液的质量和浓度是否合适，确认操作规程是否正确。

若问题仍未解决，建议更换新的凝胶柱。

2.柱子压力过高：可能是由于样品溶液中存在杂质或凝胶柱堵塞等原因引起的。

解决方法是检查样品溶液是否含有杂质，或者对样品进行预处理以去除杂质。

同时检查凝胶柱是否堵塞，若堵塞则进行清洗或更换新的凝胶柱。

3.柱子漏液：可能是由于接头松动或密封圈损坏等原因引起的。

解决方法是重新拧紧接头或更换新的密封圈。

若问题仍未解决，建议联系售后服务与支持部门寻求帮助。

4.洗脱液中含有杂质：可能是由于样品溶液中存在杂质或缓冲液不纯等原因引起的。

蛋白FITC标记及葡聚糖凝胶柱使用一、蛋白FITC标记1. 准备FITC溶液：将FITC溶解在适量的溶剂中（如PBS缓冲液），使其浓度为1 mg/ml。

2. 准备蛋白溶液：将待标记的蛋白溶解在PBS缓冲液中，使其浓度为1 mg/ml。

3. 将FITC溶液加入蛋白溶液中：将适量的FITC溶液加入蛋白溶液中，使其FITC蛋白的浓度为10 μg/ml。

溶液要充分混合，可以轻轻摇晃或使用旋转器。

4.反应：将反应溶液在室温下孵育30分钟至1小时。

反应时间可以根据实验需要进行调整。

5.停止反应：将反应溶液加入适量的停止溶液中，如甘氨酸溶液。

停止溶液可以中和未反应的FITC，并保护标记的蛋白不被降解。

6.蛋白FITC标记的纯化：可以通过蛋白层析或其他纯化方法将蛋白FITC标记纯化。

葡聚糖凝胶柱是一种常用的蛋白层析方法，用于分离和纯化蛋白。

1.准备葡聚糖凝胶柱：将葡聚糖凝胶柱放入层析柱中，并用适量的缓冲液（如PBS）均匀填充柱内。

2.样品加载：将待分离的蛋白样品加入层析柱中，样品可以预先进行适当的处理，如去除杂质、调整pH值等。

3.缓冲液洗脱：通过加入适量的缓冲液（如PBS），将未结合的蛋白从凝胶柱中洗脱。

可以通过监测洗脱液的吸光度或测定蛋白浓度来确定洗脱的程度。

4.目标蛋白洗脱：通过加入适量的洗脱缓冲液（如含有高浓度盐的缓冲液），将目标蛋白从凝胶柱中洗脱。

可以根据实验需要选择不同的洗脱条件，如改变盐浓度、改变pH值等。

5.纯化目标蛋白：通过收集洗脱的蛋白样品，可以进行进一步的纯化步骤，如使用其他层析方法、电泳等。

葡聚糖凝胶柱的使用可以根据实验需要进行调整，如选择不同的凝胶柱大小、调整缓冲液成分和流速等。

通过葡聚糖凝胶柱的分离和纯化，可以获得纯度较高的蛋白样品，用于后续的实验分析。

总结：蛋白FITC标记和葡聚糖凝胶柱使用是常见的蛋白实验技术。

蛋白FITC标记可以用于检测蛋白的位置和定量，通过将FITC与蛋白共价结合。

葡聚糖凝胶的操作方法
1.将葡聚糖凝胶粉末放入1.5ml离心管中，并加入所需的培养基或溶液（通常是0.1M PBS缓冲液）
2.用紫外灯或消毒灯照射管子和粉末，以杀菌消毒。

3.将管子在室温下静置15分钟，使凝胶充分水解。

4.在使用前，用无菌过滤器或离心管转运转移液体中的小颗粒或杂质。

5.将细胞或材料悬浮在凝胶中，并快速转移和组装需要的实验器具（如培养皿、培养板等）。

6.将实验器具放置在37的恒温箱中，使凝胶在液体中固定并形成3D结构。

7.根据实验的需要，可以选择添加细胞营养物质或生长因子等，以促进细胞的生长和分化。

8.在实验结束后，可以用酶解剂将凝胶中的细胞和材料溶解，并收集并分离细胞和其他成分，进行后续的分析和研究。

葡聚糖凝胶柱的使用方法：(1) 预处理称取Sephadex G-25（50－100目）约5g，加入蒸馏水100ml，置室温下3h进行溶胀。

(2) 装柱凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。

柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧，用洗净的玻璃丝（约200目尼龙布）垫底或购买类似规格的商品柱。

然后将柱垂直安装好，先加入1/3柱体积蒸馏水，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入，使它们在柱内自然沉降。

同时大开下口慢速流出蒸馏水。

装柱后的凝胶必须均匀，不能有气泡或明显条纹。

否则，必须到出重装，装好后，用蒸馏水平衡2－3h即可加样品分离。

(3) 加样加样前，首先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出，直到柱内液面与凝胶表面相齐（或留一极薄液层）为止。

然后，由柱的上端加水解液2ml，注意不要让溶液把凝胶冲松浮起，加完样品后，打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐，再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器2－3次，待全部进入层析柱后，即可进行洗脱。

(4) 洗脱与收集洗脱时，用蒸馏水作洗脱剂，并且要连续不断地进行，使凝胶柱上端保持一定的液层，防止凝胶柱表面的液体流干。

本实验洗脱液流出的速度应控制在－min。

洗脱液的收集采用分管连续顺序收集，每管收集3ml，共收集10管。

据经验，4或5号管核苷酸浓度最大，可作为层析鉴定的样品液。

但因层析柱长度的差异，管号会有变化，必要时可用紫外检测A260nm，找出浓度最大的管号。

(5) 凝胶的再生和回收凝胶柱使用一次后，必须反冲疏松一次，平衡后再使用。

若使用数次，就需要再生处理。

用L L NaCl溶液浸泡，然后用蒸馏水洗至中性备用。

若实验完毕，将再生后的凝胶在布氏漏斗上用蒸馏水洗涤抽干，再用95%乙醇洗两次，在60℃烘箱中烘干，回收保存。

实验五. 葡聚糖凝胶层析【实验目的】1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。

2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。

【实验原理】凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤，是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术，这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法。

葡聚糖凝胶柱使用及注意事项葡聚糖凝胶柱是一种常用的色谱柱，其主要由多糖聚合物构成，具有多孔结构以及极高的比表面积。

葡聚糖凝胶柱在生物分离、蛋白质纯化以及分析等方面有重要的应用。

下面将介绍葡聚糖凝胶柱的使用方法以及注意事项，并列举了几种常见溶剂的溶胀系数作为参考。

使用方法：1.预处理：新柱使用前需进行预处理。

首先，在使用前用适当的缓冲液再生柱子，一般推荐使用PBS缓冲液进行再生。

其次，用去离子水进行洗脱，去除缓冲液中的离子。

2.样品准备：准备好带有样品的溶液，可以是蛋白质溶液、核酸溶液或者其他需要分离的溶液。

3.进样：将样品溶液注入到柱子中，可以使用曲线尖管或者注射器进行。

4.溶剂流动：使用适当的流动缓冲液进行柱子的着色，常用的缓冲液有PBS缓冲液、甲醇和乙醇。

5.收集分离的组分：通过收集分离的组分，可以进行后续的实验操作或者分析。

注意事项：1.柱子的平衡：在使用柱子前，将柱子放入合适的缓冲液中，进行平衡处理，通常需要约30分钟。

2.柱子的保管：使用完毕后，需将柱子用适当的缓冲液保存，避免干燥。

3.柱子的温度：柱子的运行温度一般在室温下进行，避免过高温度的使用，以免影响柱子的性能。

4.溶液选择：在选择适当的缓冲液时，应根据样品的性质以及需求进行选择，不同的缓冲液对分离的效果会有影响。

5.柱子的清洗：使用完毕后的柱子需要进行彻底的清洗工作，尤其是对于经常使用的柱子，清洗工作要做得彻底。

下面是几种常见溶剂的溶胀系数参考值：1.水：溶胀系数为1，对于葡聚糖凝胶柱来说，水是适用的溶剂。

2.硫酸：溶胀系数为0.57，硫酸能够完全渗透葡聚糖凝胶柱。

3.乙醇：溶胀系数为0.44，适量的乙醇可以使用，但过高浓度的乙醇可能会影响柱子的性能。

4.甲醇：溶胀系数为0.65，甲醇也可以使用，但同样需要注意控制浓度。

总结：葡聚糖凝胶柱是一种常见的色谱柱，具有广泛的应用。

在使用葡聚糖凝胶柱时，需进行适当的处理以及注意事项，以保证柱子的性能和寿命。

异硫氰酸荧光素(fitc)-葡聚糖法异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖法是一种常用的荧光染色方法，主要用于标记葡聚糖以及其他聚糖类物质。

本文将详细介绍该方法的原理、步骤、优点和应用。

一、原理异硫氰酸荧光素（FITC）是一种荧光染料，它能与葡聚糖等聚糖发生共价键结合。

FITC在草酰胺环上有反应活性的异硫氰基，可以与聚糖的胺基反应形成络合物。

该法通过共价键结合的方式将FITC与聚糖分子连接起来，从而实现荧光标记。

二、步骤1.准备试样：将待标记的聚糖溶解在适当的缓冲液中，使其浓度在合适的范围内（一般为1-5 mg/mL）。

2.加入异硫氰酸荧光素(FITC)：将适量的FITC溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，制备10-100倍稀释液。

将聚糖溶液与FITC稀释液按照一定比例混合，并在温暖的条件下搅拌反应，通常反应时间为2-4小时。

3.滤除未反应的FITC：使用分子量筛选膜（如离心凝胶柱）将反应液进行透析，去除未反应的FITC。

4.染色剂存储：将染色剂存储在阴暗、冷冻的条件下，避免光、热以及湿气的影响。

三、优点1.显著荧光信号：FITC具有强荧光特性，能够发出明亮的绿色荧光，易于观察和检测。

2.高灵敏度：FITC的共振频率在488 nm处，与常用的激光器相吻合，因此能够获得高信噪比的荧光信号。

3.稳定性：FITC标记的样品可以在不同条件下存储和使用，不易失活和褪色。

4.适用范围广：该方法适用于各种形态和结构的聚糖，包括线性聚合物、支化聚合物、天然聚糖等。

四、应用1.生物医学研究：在生物医学领域，FITC-葡聚糖法被广泛用于细胞标记、分子探针制备、免疫组织化学染色等方面。

通过标记聚糖，能够实现对特定细胞或组织的可视化观察和定量分析。

2.药物传递系统研究：聚糖在药物传递系统中具有良好的生物相容性和生物可降解性。

通过FITC-葡聚糖法，可以制备药物载体，实现对药物的靶向传递和释放。

3.环境监测：聚糖在环境监测中具有重要的应用价值。

葡聚糖凝胶柱使用及注意事项1 Sephadex G型葡聚糖凝胶只适合在水中使用，Sephadex G-25羟丙化后就是Sephadex LH-20。

其既有分子筛作用，在由极性与非极性溶剂组成的溶剂中还有反相层析效果。

虽然价位很高，但由于性能颇佳，可再生利用，所以倍受亲睐。

此外上柱样品损失很少，对处理小样品较好，这也是我们实验室常用的原因之一。

2 Sephadex LH20 的原理。

Sephadex LH20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用(在反相溶剂中)。

因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。

如果使用反相溶剂洗脱，Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。

如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。

3 Sephadex LH20 洗脱溶剂。

看完第2点后，就应该清楚Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种。

用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇--水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100%甲醇冲柱。

正相系统以氯仿--甲醇最为常见，先用50%氯仿--甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100%甲醇冲柱。

4 Sephadex LH20 样品的处理和洗脱溶剂的选择。

如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱(甲醇--水)，样品用最少体积的甲醇--水(尽可能甲醇少一些)溶解，过滤后，湿法上样(一定要滤喔!要是把Sephadex LH20 堵啦，就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去，很心痛呀)。

如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱(氯仿--甲醇)，样品用最少体积的氯仿--甲醇溶解，过滤后，湿法上样。

5 Sephadex LH-20的步骤。

(1) 选择条件：梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。

蛋白FITC 标记及葡聚糖凝胶柱使用 荧光素FITC 标记抗体纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。

有两种异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。

当FITC 在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r 氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。

一个IgG 分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG 分子可结合2～8个分子的FITC ，其反应式如下:FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质 → FITC -NS-C-N-H2-蛋白质FITC 是在荧光素的基础上通过化学反应增加硫氰酸基团得到的，硫氰酸基团可以荧光标记步骤：(1)试剂和材料 ①0．01mol ／L(pH7．2)PBS 配法中，校定pH 至7．2。

NaCI18g 、Na2HP04 1．15g ，溶于2000ml 蒸馏水②0．1mol ／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液配法 取0．5mol ／LNa 2CO 3(5．3％)10ml 加入0．5mol ／LNaHC03(4．2％)90ml ，混合后，校定pH 至9．0。

③3％碳酸钠水溶液配法 称5g 无水碳酸钠充分溶解于50ml 灭菌蒸馏水中即成。

④其他试剂和材料 l ％叠氮化钠、离心机及离心管、烧杯(25m1)、搅拌器、无菌吸管及毛细滴管、烧杯(500m1)透析袋等。

(2)方法及步骤 ①取高效价的抗人球蛋白兔免疫血清，分离球蛋白，用盐水(0．15mol ／LNaCl)及缓冲液(0．5mol ／LNaHC03—Na 2C03，pH9．0)稀释使每毫升内含蛋白质1-5mg ，缓冲液为总量的10％，降温至4℃。

②加入异硫氰酸盐(FITC)荧光素[蛋白：荧光素＝(50—80)mg‘lmg]，在0～4℃下电磁搅拌12～14h 。

③然后用半饱和的硫酸铵将标记球蛋白沉淀分离，除去未结合的荧光素，再用缓冲盐水透析，除去硫酸铵(用Nessler 试剂测验，至隔夜透析的盐水无氨离子及荧光色素为止)。

葡聚糖凝胶柱使用及注意事项1 Sephadex G型葡聚糖凝胶只适合在水中使用，Sephadex G-25羟丙化后就是Sephadex LH-20。

其既有分子筛作用，在由极性与非极性溶剂组成的溶剂中还有反相层析效果。

虽然价位很高，但由于性能颇佳，可再生利用，所以倍受亲睐。

此外上柱样品损失很少，对处理小样品较好，这也是我们实验室常用的原因之一。

2 Sephadex LH20 的原理。

Sephadex LH20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。

因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。

如果使用反相溶剂洗脱，Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。

如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。

3 Sephadex LH20 洗脱溶剂。

看完第2点后，就应该清楚Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种。

用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇－－水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。

正相系统以氯仿－－甲醇最为常见，先用50％氯仿－－甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。

4 Sephadex LH20 样品的处理和洗脱溶剂的选择。

如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（一定要滤喔！要是把Sephadex LH20 堵啦，就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去，很心痛呀）。

如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱（氯仿－－甲醇），样品用最少体积的氯仿－－甲醇溶解，过滤后，湿法上样。

5 Sephadex LH-20的步骤。

(1) 选择条件：梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。

葡聚糖凝胶使用说明化学和物理性质葡聚糖凝胶是一种珠状的凝胶，含有大量的羟基，很容易在水中和电解质溶液中溶胀。

G型的葡聚糖凝胶有各种不同的交联度，因此它们的溶胀度和分级分离范围也有所不同。

葡聚糖凝胶的溶胀度基本上不因盐和洗涤剂的存在而受影响。

葡聚糖凝胶有不同的粒度。

超细级的葡聚糖凝胶是用于需要极高分辨率的柱色谱和薄层色谱。

粗级和中级的凝胶用于制备性色谱过程，可在较低的压力下获得较高的流速。

另外，粗级也可用于批量工艺。

化学稳定性葡聚糖凝胶不溶于一切溶剂（除非它被化学降解）。

它在水、盐溶液、有机溶剂、碱和弱酸性溶液中都是稳定的，在强酸中凝胶骨架的糖苷键被水解。

长期接触氧化剂将破坏凝胶，因而应避免使用。

物理稳定性葡聚糖凝胶并不熔融，可以在湿态、中性PH进行灭菌或在高压灭菌器120℃、30分钟而不影响它的色谱性质。

干态的凝胶加热至120℃以上将开始焦糖化。

葡聚糖凝胶的机械强度取决于交联度。

产品说明：使用方法：1. 乙醇浸泡：在室温下，将干粉浸泡于50-60%乙醇中至少24小时，并不断搅拌以保证凝胶溶胀，用无盐水洗去残存的乙醇滤干;2. 无盐水浸泡：室温下，在无盐水中充分溶胀24小时，间隙搅拌，以保证凝胶的完全溶胀，然后；3. 盐酸浸泡：在常温下再用0.2N HCl浸泡12小时，间隙搅拌，滤干，水洗只中性；4. 将溶胀好的凝胶脱气后（真空抽滤或超声波）根据装柱要求一次性置入柱内，注意保持湿态装柱，并避免柱内产生气泡或断层；5. 上样前平衡层析柱至少3-5个柱体积直到记录仪基线变得平稳为止（流出液的PH值等于上柱的Buffer的PH值）；6. 凝胶过滤的上样量一般为5%的柱床体积，我们建议初次上样控制在1-2%的床体积，视分离情况可以调整；脱盐时上样量可以达到20%的柱床体积，柱高的选择也与分离要求相关，柱高控制在40-50cm 以下，过高的凝胶层会引起较大的反压，应当尽可能避免。

难分离物质要有一定柱高和流速控制，脱盐时高径比为5：1即可；7. 洗脱方法：可以用无盐水，也可以采用上柱时的缓冲液洗脱；在上柱Buffer中加入NaCl等梯度洗脱或盐梯度洗脱也可以完全分离纯化；8. 在位清洗（CIP）凝胶使用十次后作一次CIP，目的是去除柱床内沉淀的及顽固残留的蛋白。

葡聚糖凝胶色谱柱使用说明：一、凝胶的选择1.型号的选择凝胶型号不同，筛分范围也不同。

SephadexG型一般适用于分离蛋白质。

根据下图选择所需要的SephadexG型凝胶的型号2．凝胶用量的计算根据层析柱的体积和干凝胶的膨胀度，按下面公式可计算出所需干凝胶用量：干凝胶用量=πr2h膨胀度（床体积g)用此法计算出的干胶用量还需增加10%～20%，因为凝胶在处理过程中会有一部分损失。

3.凝胶的处理将所用的干胶慢慢倾入5～10倍的纯水中，参照表格凝胶所需时间来进行充分浸泡使胶溶胀。

用0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液在室温下浸泡0.5h，以抽滤法去除碱液，用蒸馏水洗至中性。

也可以采用煮沸的方式，能加快凝胶溶胀的速度，但是必须置于弱酸或弱碱溶液中煮沸。

然后用对胶进行脱气处理。

二、凝胶柱的制备1.凝胶柱的选择对层析柱选择的合理与否，将直接影响分离结果。

当用同样直径的层析柱分离两种以上的物质时，长层析柱比短的分离效率高；当用同样长度的层析柱分离两种以上物质时，层析柱直径大的比小的分辨率高；当用同样体积的层析柱分离两种以上物质时，仍是层析柱长的比短的分辨率高。

一般理想的层析柱的直径与长度之比是1:25～1:100。

2.装柱(1)将层析柱垂直固定在支架上，拧紧柱的下端出口。

（2）脱气后的填料表面若有杂质，用胶头滴管吸走。

检查溶胀后的填料应与柱体积相当，若溶胀时候加水多一些，可以吸走一些水。

将凝胶调成较稀薄的浆液用玻璃棒引流，灌入柱子内，注意连续灌入，一定不要有气泡或纹路，否则要重新灌。

将凝胶全部灌入柱子后，拧紧上出水口，让凝胶自然沉降，并打开下面的出水口。

当出现明显的填料与水的分层时，打开泵注入水，等柱床稳定后做个标记，过夜平衡，直到柱床体积不变时，柱子平衡好。

三、加样与洗脱1.加样（1）首先关闭下端出水口，打开上端出水口，吸走柱内凝胶上部分的水，注意贴近凝胶时一定用胶头滴管，不要把凝胶吸起来。

葡聚糖凝胶使用说明化学和物理性质葡聚糖凝胶是一种珠状的凝胶，含有大量的羟基，很容易在水中和电解质溶液中溶胀。

G型的葡聚糖凝胶有各种不同的交联度，因此它们的溶胀度和分级分离范围也有所不同。

葡聚糖凝胶的溶胀度基本上不因盐和洗涤剂的存在而受影响。

葡聚糖凝胶有不同的粒度。

超细级的葡聚糖凝胶是用于需要极高分辨率的柱色谱和薄层色谱。

粗级和中级的凝胶用于制备性色谱过程，可在较低的压力下获得较高的流速。

另外，粗级也可用于批量工艺。

化学稳定性葡聚糖凝胶不溶于一切溶剂（除非它被化学降解）。

它在水、盐溶液、有机溶剂、碱和弱酸性溶液中都是稳定的，在强酸中凝胶骨架的糖苷键被水解。

长期接触氧化剂将破坏凝胶，因而应避免使用。

物理稳定性葡聚糖凝胶并不熔融，可以在湿态、中性PH进行灭菌或在高压灭菌器120℃、30分钟而不影响它的色谱性质。

干态的凝胶加热至120℃以上将开始焦糖化。

葡聚糖凝胶的机械强度取决于交联度。

产品说明：使用方法：1. 乙醇浸泡：在室温下，将干粉浸泡于50-60%乙醇中至少24小时，并不断搅拌以保证凝胶溶胀，用无盐水洗去残存的乙醇滤干;2. 无盐水浸泡：室温下，在无盐水中充分溶胀24小时，间隙搅拌，以保证凝胶的完全溶胀，然后；3. 盐酸浸泡：在常温下再用0.2N HCl浸泡12小时，间隙搅拌，滤干，水洗只中性；4. 将溶胀好的凝胶脱气后（真空抽滤或超声波）根据装柱要求一次性置入柱内，注意保持湿态装柱，并避免柱内产生气泡或断层；5. 上样前平衡层析柱至少3-5个柱体积直到记录仪基线变得平稳为止（流出液的PH值等于上柱的Buffer的PH值）；6. 凝胶过滤的上样量一般为5%的柱床体积，我们建议初次上样控制在1-2%的床体积，视分离情况可以调整；脱盐时上样量可以达到20%的柱床体积，柱高的选择也与分离要求相关，柱高控制在40-50cm 以下，过高的凝胶层会引起较大的反压，应当尽可能避免。

难分离物质要有一定柱高和流速控制，脱盐时高径比为5：1即可；7. 洗脱方法：可以用无盐水，也可以采用上柱时的缓冲液洗脱；在上柱Buffer中加入NaCl等梯度洗脱或盐梯度洗脱也可以完全分离纯化；8. 在位清洗（CIP）凝胶使用十次后作一次CIP，目的是去除柱床内沉淀的及顽固残留的蛋白。

葡聚糖凝胶柱使用及注意事项1 Sephadex G型葡聚糖凝胶只适合在水中使用，Sephadex G-25羟丙化后就是Sephadex LH-20。

其既有分子筛作用，在由极性与非极性溶剂组成的溶剂中还有反相层析效果。

虽然价位很高，但由于性能颇佳，可再生利用，所以倍受亲睐。

此外上柱样品损失很少，对处理小样品较好，这也是我们实验室常用的原因之一。

2 Sephadex LH20 的原理。

Sephadex LH20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。

因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。

如果使用反相溶剂洗脱，Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。

如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。

3 Sephadex LH20 洗脱溶剂。

看完第2点后，就应该清楚Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类：反相与正相两种。

用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇－－水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。

正相系统以氯仿－－甲醇最为常见，先用50％氯仿－－甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。

4 Sephadex LH20 样品的处理与洗脱溶剂的选择。

如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（一定要滤喔！要是把Sephadex LH20 堵啦，就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去，很心痛呀）。

如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱（氯仿－－甲醇），样品用最少体积的氯仿－－甲醇溶解，过滤后，湿法上样。

5 Sephadex LH-20的步骤。

(1) 选择条件：梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。

葡聚糖凝胶使用说明1.葡聚糖凝胶的制备2.葡聚糖凝胶的特性-生物相容性好：葡聚糖是一种天然产物，具有良好的生物相容性，不会产生免疫反应。

-可调节性强：葡聚糖凝胶的凝胶特性可以通过改变制备方法、葡聚糖浓度和pH值等条件来调节，以满足不同应用的需要。

-凝胶稳定性好：葡聚糖凝胶具有较好的物理稳定性和化学稳定性，能够在一定条件下保持凝胶状态。

-良好的保水性：葡聚糖凝胶具有良好的保水性能，可用作保湿剂，防止水分的蒸发。

-微生物阻隔性：葡聚糖凝胶的网络结构可以起到一定的微生物阻隔效果，可应用于医疗和食品包装等领域。

3.葡聚糖凝胶的应用3.1医疗应用-创面敷料：葡聚糖凝胶具有良好的吸附性和保湿性能，可用于制备创面敷料，促进伤口愈合。

-药物载体：葡聚糖凝胶的网状结构可以将药物包裹在其中，用于制备药物缓释系统。

-组织工程：葡聚糖凝胶可用作细胞培养的基质材料，用于组织工程的研究和临床应用。

3.2食品应用-增稠剂：葡聚糖凝胶可作为增稠剂添加到食品中，改善食品的口感和质感。

-稳定剂：葡聚糖凝胶具有良好的稳定性，可以作为乳化剂和稳定剂添加到食品中，延长食品的保质期。

-包装材料：葡聚糖凝胶的微生物阻隔性能可以应用于食品包装材料，起到保鲜的作用。

3.3化妆品应用-保湿剂：葡聚糖凝胶可用作化妆品中的保湿剂，增加产品的保湿性能。

-凝胶基质：葡聚糖凝胶可作为凝胶基质，在其中悬浮其他活性成分，提高产品的稳定性和渗透性。

-敏感肌肤护理：葡聚糖凝胶具有良好的生物相容性，可用于敏感肌肤的护理产品中，减少刺激和过敏反应。

3.4农业应用-保水剂：葡聚糖凝胶可用作土壤保水剂，改善土壤的水分状况，提高植物的生长。

-植物保护剂：葡聚糖凝胶可作为植物保护剂的载体，将其包裹在凝胶中，减少化学农药的使用量。

总结：葡聚糖凝胶具有许多优异的特性，广泛应用于医疗、食品、化妆品和农业等领域。

在使用葡聚糖凝胶时，需要根据具体的应用要求选择适当的制备方法和条件，并在应用过程中注意遵守相关的法律法规和安全操作规程，以确保产品的质量和安全性。