葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质

一、实验目的1. 掌握葡聚糖凝胶层析的原理及其在生物大分子分离中的应用。

2. 学习并掌握葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。

3. 通过实验，验证葡聚糖凝胶层析对分子量不同的物质具有分离效果。

二、实验原理凝胶层析，又称分子排阻层析或凝胶过滤，是一种基于被分离物质分子量差异的层析分离技术。

该技术利用凝胶颗粒的多孔网状结构，通过分子量差异使不同组分在层析柱中以不同的速度移动，从而达到分离的目的。

葡聚糖凝胶是一种由直链的葡聚糖分子和交联剂3-氯1，2-环氧丙烷交联而成的高分子化合物。

通过调节葡聚糖和交联剂的比例，可以控制凝胶颗粒的孔径大小。

分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随溶剂流动快速流出层析柱；而分子量小的物质可进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程慢，后流出层析柱。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 葡聚糖凝胶（Sephadex）- 标准蛋白质溶液（如牛血清白蛋白、鸡蛋清蛋白等）- 溶剂（如磷酸盐缓冲溶液）- 离心机- 层析柱- 漏斗- 吸管2. 实验仪器：- 电子天平- 移液器- 显微镜四、实验步骤1. 准备层析柱：将葡聚糖凝胶倒入层析柱中，用溶剂冲洗，直至凝胶床均匀。

2. 加载样品：将标准蛋白质溶液加入层析柱中，使其在凝胶床表面形成一薄层。

3. 洗脱：用溶剂缓慢冲洗层析柱，收集不同时间流出的洗脱液。

4. 分析洗脱液：将收集到的洗脱液进行比色分析或电泳分析，确定各组分的位置。

五、实验结果与分析1. 实验结果：- 洗脱液在比色分析或电泳分析中，可观察到不同分子量的蛋白质分别在凝胶层析柱中的位置。

- 小分子量的蛋白质先流出层析柱，大分子量的蛋白质后流出。

2. 结果分析：- 通过实验，验证了葡聚糖凝胶层析对分子量不同的物质具有分离效果。

- 实验结果表明，小分子量的蛋白质在凝胶层析柱中的流动速度较快，大分子量的蛋白质流动速度较慢。

六、实验结论1. 葡聚糖凝胶层析是一种基于分子量差异的层析分离技术，在生物大分子分离中具有广泛的应用。

实训凝胶柱色谱纯化蛋白质类药物［任务描述］凝胶色谱是把样品加到充满着凝胶颗粒的色谱柱中，然后用缓冲液洗脱。

凝胶过滤柱色谱的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。

这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。

本次实训任务采用葡聚糖凝胶G-75作固相载体，可分离分子量范围在2000～70000之间的多肽与蛋白质，上样样品为牛血清蛋白和溶菌酶的混合溶液，当混合液流经色谱柱时，两种物质因Kav值不同而被分离。

［任务实施］一、准备工作1.建立工作小组，制定工作计划，确定具体任务，任务分工到个人，并记录到工作表。

2.收集凝胶柱色谱分离蛋白质工作中必须信息，掌握相关知识及操作要点，与指导教师共同确定出一种最佳的工作方案。

3.完成任务单中实际操作前的各项准备工作。

（1）材料准备葡聚糖凝胶Sephadex G-75。

（2）试剂0.9% NaCl溶液（洗脱液）、牛血清白蛋白：Mw=67000、溶菌酶：Mw =14300。

（3）器具色谱柱、恒流泵、自动部分收集器、紫外检测器、记录仪、量筒、烧杯、试管、吸管、玻璃棒等。

二、操作过程（一）操作流程如图1所示。

（二）操作步骤1.凝胶预处理将Sephadex G-75置烧杯中，加入洗脱液于室温溶胀2～3天，反复倾泻去掉细颗粒，然后减压抽气去除凝胶孔隙中的空气，沸水浴中煮沸2～3小时，在凝胶溶胀时避免剧烈搅拌，以防凝胶交联结构的破坏。

2.装柱选取色谱柱，将色谱柱固定在支架上，调整色谱柱与水平面垂直。

烧结板下端的死区用蒸馏水充满，然后关闭色谱柱的出口。

将凝胶悬液沿玻璃棒小心地徐徐灌入柱中，待底部凝胶沉积1～2cm时，再打开出口，继续加入凝胶悬液至凝胶沉积约15cm高度即可（注意：凝胶悬液尽量一次加完，以免出现分层的凝胶带）。

3.平衡装柱完成后，接上恒流泵，以0.9%的氯化钠为流动相，以0.75mL/min或0.5mL/min的速度开始洗脱，用1～2倍床体积的洗脱液平衡，平衡1h，使柱床稳定。

葡聚糖凝胶分离原理葡聚糖凝胶分离原理是指利用葡聚糖凝胶作为分离介质，根据分子的大小、形状以及电荷等性质进行分离的原理。

这是一种普遍应用于生物大分子分离、纯化的方法，也被广泛应用于各种生物学研究和生产中。

下面我们来分步骤阐述葡聚糖凝胶分离原理。

第一步：准备葡聚糖凝胶首先需要准备葡聚糖凝胶，也叫葡聚糖凝胶珠。

葡聚糖凝胶是一种由葡萄糖聚合而成的大分子化合物，具有空心珠状结构，内部的孔道大小可以通过调整反应条件来控制。

一般来说，制作葡聚糖凝胶是通过交联反应来实现的。

这个反应可以在空气中进行，也可以在水中进行。

反应结束之后，需要将凝胶珠洗涤干净并保存。

（此处省略反应式，不过可以考虑简单描述制作过程）第二步：根据分子大小选用不同的葡聚糖凝胶根据待分离分子的大小，可以选用孔径不一的葡聚糖凝胶珠进行分离。

一般来说，凝胶珠的孔径越大，可以分离的大分子也就越大。

因此，选用合适的葡聚糖凝胶对于分离大分子很关键。

第三步：将待分离混合物加入到葡聚糖凝胶柱中将待分离的混合物加入到葡聚糖凝胶柱中，通常是通过上一端加样，并在另一端接收洗脱液来实现。

当待分离混合物进入凝胶柱后，各种组分便可以进入到凝胶珠中。

此时，分子会因为凝胶珠孔道大小的排斥，或者是因为电荷、极性等原因而被分离开来。

第四步：使用洗脱液进行洗脱分离的分子在分子分离的过程中，分子部分会被“捕获”在葡聚糖凝胶中，而另外一部分则会穿过凝胶珠而漏出柱外。

因此，需要通过洗脱液来脱离已分离出的分子，将它们从凝胶珠中洗脱出来。

一般来说，选择适当的洗脱液并采用合适的洗脱方法，可以获得高纯度和高产率的分离产品。

以上就是葡聚糖凝胶分离原理的分步骤阐述。

葡聚糖凝胶分离原理被广泛地应用于各种生物学实验中，如生物大分子的分离纯化，蛋白质的组分分析等等。

通过掌握葡聚糖凝胶分离原理，我们可以更好地理解生物大分子之间的关系，优化生物大分子的纯化过程，提高生物制品的纯度和质量。

Sephadex G-75 凝胶层析法分离蛋白质一.实验原理凝胶层析(gel chromatography)又称为凝胶排阻层析(gel exclusion chromatography)、分子筛层析(molecular sieve chromatography)、凝胶过滤(gel filtration)、凝胶渗透层析(gel permeation chromatography)等。

凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。

当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。

比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；而分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。

这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。

二.试剂器材Sephadex G-75粉末洗脱液(10mmol/L Tris，10mmol/L NaCl，：取Tris 1.2114g和NaCl5.844g分别溶于适量的蒸馏水中，将两种溶液合并，用4mol/L的盐酸溶液调节pH值至，再用蒸馏水定容至1000mL；其他器材：18mm试管、层析柱、紫外分光光度计、分部收集器等三.操作步骤凝胶的制备：称取Sephadex G-75粉末20g，加双蒸水400ml浸泡，置于水浴锅中加热至100℃，保持温度3hr，冷却至室温抽真空30min以排除气泡，待其沉降后以倾泻法除去上层悬浮微粒；装柱：取洗净的内径18mm，长为490mm的层析柱，管底内部放置一层丝网，将层析柱垂直，关闭出水口，加入1/2柱体积的双蒸水，然后将己溶胀好的凝胶连续缓慢地从上口加入层析柱中，同时打开出水口，使凝胶自然沉降；平衡：凝胶床用洗脱液平衡过夜，约2个柱体积；加样：称取样品溶解于5mL的洗脱液中。

丙烯葡聚糖凝胶柱丙烯葡聚糖凝胶柱（Acrylamide-grafted-dextran gel column）是一种用于生物大分子分离纯化的柱层析材料。

它的主要特点是基质材料采用了由Dextran和Acrylamide共聚物构成的凝胶，具有良好的化学稳定性、物理强度、较高的柱效以及优秀的卫生性等优点。

丙烯葡聚糖凝胶柱广泛应用于生物医学、制药、食品及环境领域等，是纯化比较复杂的生物大分子时的首选柱层析材料之一。

丙烯葡聚糖凝胶柱的制备的主要步骤包括：基质制备、柱层析填料、柱装填、洗脱条件的选择。

基质制备时，首先制备一定浓度的Dextran/丙烯酰胺共聚物水溶液，然后将其加入化学引发剂，并在反应后迅速凝胶化。

柱层析填料时，制备出适当大小的凝胶颗粒，并进行化学处理，使其能够在柱层析过程中稳定地固定在柱内。

柱装填时，将处理好的凝胶颗粒装入柱体中，并使其达到充填度。

洗脱条件的选择则需要根据大分子的特性选择不同的缓冲液、pH和盐度等，以最大限度地提高纯化效果。

1. 高柱效：丙烯葡聚糖凝胶柱具有良好的化学稳定性和物理强度，使其在高线速度下运行时也能保持良好的传质条件和柱效。

2. 容量大：由于基质凝胶中Acrylamide含量较高，其微孔结构也比较丰富，因此其容量比市面上其他吸附性柱层析材料大不少。

3. 极佳的卫生性：丙烯葡聚糖凝胶柱的基质对微生物生长、热辐射、紫外线等均有较好的抵抗力，能够在保证高生物质量的前提下有效防止杂质交叉污染。

4. 广泛应用：丙烯葡聚糖凝胶柱广泛应用于制药、食品、环境和生物领域，例如：分离免疫球蛋白、病毒蛋白、血凝素、酶、细胞因子、抗原和肽等。

丙烯葡聚糖凝胶柱在生物大分子的分离纯化中发挥着重要的作用。

在免疫学领域，丙烯葡聚糖凝胶柱可用于分离IgG和IgM。

在病毒学领域，丙烯葡聚糖凝胶柱可用于纯化HIV、疱疹病毒、流感病毒等。

在药物研发领域，丙烯葡聚糖凝胶柱则可用于纯化药物，如重组蛋白、激素等。

葡聚糖凝胶层析实验报告一、实验目的1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理；2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。

二、实验原理凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。

对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。

分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。

一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。

这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。

三、仪器、材料和试剂1、仪器：内直径为1cm，外直径为1.5cm的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。

2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。

四、实验步骤1、装柱将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。

2、上样装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。

3、洗脱和收集打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层析柱中加入3-4ml的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。

4、样品的检测收集一段时间后，将样品取出，依次编号，依次加入200μl到酶标版上，选用一个孔加入双蒸水作为对照，用酶标仪在280nm下测检测。

五、实验结果及分析1、实验结果：序号 2 4 6 8 10 12 14吸光0．051 0.045 0.051 0.071 0.195 0.127 0.067 度A序号16 8吸光0.055 0.039 0.066 0.027 0.053 0.049 0.011度A2、蛋白质样品洗脱曲线：收集样品时设置的时间为3min每管，收集得到每管的体积为1.4ml，则计算：流速=每管体积/每管时间=1.4/3=0.47ml/min。

凝胶层析技术——葡聚糖凝胶的使用摘要：本文综述了凝胶层析技术中所使用的葡聚糖凝胶的使用方法，及注意事项。

关键词：凝胶层析，葡聚糖凝胶，使用，注意事项引言：凝胶层析又称为凝胶排阻层析、分子筛层析、凝胶过滤、凝胶渗透层析等。

1959年，Porath和Flodin 首次用一种多孔聚合物——交联葡聚糖凝胶作为柱填料，分离水溶液中不同分子量的样品，成为凝胶过滤。

1964年，Moore制备了具有不同孔径的交联聚乙苯烯凝胶，能够进行有机溶剂中的分离，成为凝胶渗透层析（流动相为有机溶剂的凝胶层析一般称为凝胶渗透层析）。

随后这一技术得到不断的完善和发展，目前广泛应用于生物化学、高分子化学等很多领域。

此项技术中，凝胶的选择尤为重要，因此凝胶的使用及使用时的注意事项尤为重要。

1、凝胶层析原理凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。

凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。

当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。

比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，他们经历的流程短，流动速度快，所以先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；而分子大小介于两者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于两者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。

这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。

2、葡聚糖凝胶的化学和物理性质葡聚糖凝胶是一种珠状的凝胶，含有大量的羟基，很容易在水中和电解质溶液中溶胀。

G型的葡聚糖凝胶有各种不同的交联度，因此它们的溶胀度和分级分离范围也有所不同。

葡聚糖凝胶的溶胀度基本上不因盐和洗涤剂的存在而受影响。

(1)预处理称取葡聚糖凝胶（有不同型号）若干克，加入洗脱剂（通常为甲醇或者水，这里以甲醇为例）约20倍凝胶量，置室温下3h进行溶胀，溶胀必须彻底，否则会使上柱后流速变慢，凝胶断裂等。

(2) 装柱凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。

柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧，用洗净的玻璃丝（约200目尼龙布）垫底或购买类似规格的商品柱。

然后将柱垂直安装好，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边缓缓连续装入，色谱柱的出口流速m维持在5~10ml/min。

凝胶颗粒沉积到柱底后关紧色谱柱，等沉降到1-2cm时再2打开色谱柱。

直至降到满意高度为止，等凝胶柱内的液体留的与凝胶高度差不多时，用较小的滤纸盖住凝胶床表面，再用洗脱剂洗脱过夜。

装柱后的凝胶必须均匀，不能有气泡或明显条纹。

否则，必须到出重装。

(3) 加样装好的色谱柱至少要用相当于3倍保留体积的洗脱剂平衡，待洗脱剂流至与凝胶柱液面相平时（不能流干，否则会带入气泡），用滴管吸取样品溶液，在高于凝胶表面约1cm 处，沿管壁四周缓缓滴加样品液，加完后打开下面的出口，使样品渗入凝胶内。

再关闭出口，用少量洗脱液将管壁残留的样品洗下，再打开出口，至溶液渗入柱内，再关闭出口。

可以考虑再加一层薄薄的脱脂棉以保护柱表面（我一般不加），然后即可进行洗脱。

(4) 洗脱与收集洗脱时，用甲醇作洗脱剂，并且要连续不断地进行，使凝胶柱上端保持一定的液层，防止凝胶柱表面的液体流干。

一般酸性洗脱剂中碱性物质容易洗脱，碱性洗脱剂中酸性物质容易洗脱。

多糖类物质等极性大的物质考虑用水洗脱，常用的洗脱剂是水-甲醇，水-乙醇，水-丙酮等，一般根据自己样品的性质选择洗脱液，洗脱液可一直用单一梯度。

凝胶色谱的共性是流速慢，每份一般体积较小。

（内径1.3cm左右，长80cm左右的柱子我一般每份收集液为8ml）(5) 凝胶的再生和回收凝胶柱多次使用后，若污染严重，则考虑用50度左右的2%的NaOH和0.5mol/LNaCl 混合液浸泡后，再用水洗净即可。

实验六凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质一、实验目的1. 了解凝胶层析的原理及其应用。

2. 掌握利用凝胶层析法分离纯化蛋白质的实验技能二、实验原理凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。

该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。

大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。

凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。

这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。

任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。

Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。

分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。

Ve（洗脱体积）为某一成分从加入样品算起，到组分的最大浓度（峰）出现时所流出的体积。

Ve随溶质的相对分子质量的大小和对凝胶的吸附等因素而不同。

一般相对分子质量较小的溶质，它的Ve值比相对分子量较大的溶质要大。

通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。

该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。

但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，不宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。