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装柱由于凝胶的分离是靠筛分作用，所以凝胶的填充要求很高，必须要使整个填充柱非常均匀，否则必须重填。
凝胶在装柱前，可用水浮选法去除凝胶中的单体、粉末及杂质，并可用真空泵抽气排出凝胶中的气泡。
最好购买商品中的玻璃或有机玻璃的凝胶空柱，在柱的两端皆有平整的筛网或筛板。
将柱垂直固定，加入少量流动相以排除柱中底端的气泡，在加入一些流动相于柱中约1/4的高度。
柱顶部连接一个漏斗，颈直径约为柱颈的一半，然后在搅拌下、缓慢的、均匀地、连续地加入已经脱气的凝胶悬浮液，同时打开色谱柱的毛细管出口，维持适当的流速，凝胶颗粒将逐层水平式上升，在柱中均匀地沉积，直到所需高度位置。
最后拆除漏斗，用较小的滤纸片轻轻盖住凝胶床的表面，再用大量洗脱剂将凝胶床洗涤一段时间。
3、柱均匀性检查凝胶色谱的分离效果主要决定于色谱柱装填得是否均匀，在对样品进行分离之前，对色谱柱必须进行是否均匀的检查。
由于凝胶在色谱柱中是半透明的，检查方法可在柱旁放一至于柱平行的日光灯，用肉眼观察柱内是否有“纹路”或气泡。
也可向色谱柱内加入有色大分子等，加入物质的分子量应在凝胶柱的分离范围，如果观察到柱内谱带窄、均匀、平整，即说明色谱柱性能良好；如果色带出现不规则、杂乱、很宽时必须重新装填凝胶柱。
4、上样凝胶柱装好后，一定要对柱用流动相进行很好的平衡处理，才能上样。
凝胶柱的上样也是一个非常重要的因素，总的原则是要使样品柱塞尽量的窄和平整。
为了防止样品中的一些沉淀物污染色谱柱，一般在上柱前将样品过滤或离心。
样品溶液的浓度应该尽可能的大一些，但如果样品的溶解度与温度有关时，必须将样品适当稀释，并使样品温度与色谱柱的温度一致。
当一切都准备好后，这时可打开色谱柱的活塞，让流动相与凝胶床刚好平行，关闭出口。
用滴管吸取样品溶液沿柱壁轻轻地加入到色谱柱中，打开流出口，使样品液渗入凝胶床内。
当样品液面恰与凝胶床表面平时，再次加入少量的洗脱剂冲洗管壁。
重复上述操作及此，每一次的关键是既要使样品恰好全部渗入凝胶床，又不致使凝胶床面干燥而发生裂缝。
g-10葡聚糖凝胶色谱柱使用
G-10葡聚糖凝胶色谱柱是一种常用的分离和纯化生物大分子
的柱子，特别适用于分离寡聚糖和多糖混合物。
该柱子采用葡聚糖作为固定相，具有一定的孔隙大小和分子筛效果。
G-10葡聚糖凝胶色谱柱通常用于分离多糖、寡糖和其他大分
子化合物。
在使用之前，需要将柱子进行激活和平衡，具体步骤如下：
1. 将G-10葡聚糖凝胶色谱柱放入柱子支撑架上，并连接到色
谱系统上。
2. 将适当的缓冲液（如适应于样品的缓冲液）通过柱子进行激活，以去除可能存在的杂质和污染物。
3. 进行柱子平衡：将适当的缓冲液通过柱子流经，直到柱子和系统达到平衡状态。
4. 加载样品：将待分离的样品按照柱子载样方法加载到柱子上。
5. 进行色谱分离：根据需要，控制缓冲液的流速和浓度梯度，使待分离的目标化合物在柱子上进行分离。
6. 收集分离物：根据其他方法（如按时间段收集、检测波长等）进行分离物收集和检测。
值得注意的是，G-10葡聚糖凝胶色谱柱通常用于相对较小的
生物大分子分离，如寡聚糖和多糖，对于更大分子的分离可能需要使用其他类型的色谱柱。
此外，在操作过程中需要根据具体样品的特性和需要进行柱子条件的调整。
葡聚糖凝胶色谱柱概述葡聚糖凝胶色谱柱（dextran gel filtration column）是一种分离生物大分子的常见方法之一。
它是利用生物大分子在不同孔径的凝胶中的分布系数不同，实现分离的原理。
具体来说，大分子无法进入凝胶孔隙，因此在表面上滞留更长时间，而小分子能够进入凝胶孔隙，因此在表面上滞留时间更短，从而实现分离。
实验过程使用葡聚糖凝胶色谱柱进行分离实验的步骤如下： 1. 制备样品：将所需的大分子混合液或生物组织样品制备好。
2. 将样品滴到色谱柱顶部，并保持柱顶刚好覆盖样品。
3. 添加移液管中的洗脱液，并在细流下加缓冲液。
4. 在必要的时候，可以连续添加洗脱液、缓冲液和样品，直到滤出大分子为止。
5. 收集样品，并进行下一步实验。
应用领域葡聚糖凝胶色谱柱广泛应用于生物化学和分子生物学领域。
常见的应用包括：1. 分离蛋白质：通过分离分子量不同的蛋白质来研究其结构和功能。
2. 分离核酸：通过分离不同长度的DNA片段和转录产物来研究基因的组成和调控机制。
3. 分离糖类：例如分离化合物，如淀粉和糖原，以研究其结构和功能。
4. 生物大分子纯化：通过纯化生物大分子（如酶和抗体）来研究其特性和应用。
常见问题解答葡聚糖凝胶色谱柱可以重复使用吗？可以。
只要正确使用和保持清洁，色谱柱可以反复使用多次，提供不断稳定的分离能力。
色谱柱如何保养？在每次使用后，应使用清洁试剂对色谱柱进行冲洗，以防止残留的生物大分子或洗脱液。
还应防止色谱柱干燥，避免损坏凝胶。
如何选择正确的分离柱？对于不同种类的分析样品，应选择不同孔径的凝胶柱。
一般来说，较小的分子要使用较小的孔径凝胶柱，而较大的分子要使用较大的孔径凝胶柱。
此外，应选择适当的缓冲液，以保证生物大分子的稳定性和稳定性。
总结葡聚糖凝胶色谱柱是一种有效的生物分离方法，具有广泛的应用领域，特别是在研究蛋白质、核酸和糖类方面。
正确选择和使用凝胶柱，以及正确维护和保养，可以确保稳定的分离效果。
葡聚糖凝胶75的操作方法葡聚糖凝胶75是一种常用的凝胶材料，适用于生物学分离、电泳、柱层析等实验。
下面是葡聚糖凝胶75的详细操作方法。
1. 材料准备- 一定量的葡聚糖凝胶75。
根据实验需要，确定所需凝胶的重量。
- 缓冲溶液。
根据实验需要，选择合适的缓冲溶液，并按照实验方案调制好。
- 试管或实验室常规操作用品。
2. 准备葡聚糖凝胶- 将葡聚糖凝胶75取出，称取所需重量，放入一个干净的容器中。
3. 膨胀葡聚糖凝胶- 在称量容器中，加入足够的缓冲溶液，使葡聚糖凝胶逐渐膨胀，在液体中悬浮。
- 注意需加入的液体量，以保证膨胀后的葡聚糖凝胶具有所需的性质。
4. 筛选葡聚糖凝胶- 等待膨胀约30分钟，葡聚糖凝胶会逐渐膨胀并在液体中扩散。
- 使用数个试管架，每个试管架上插入一根取下的注射器针头，将其作为筛选葡聚糖凝胶的框架。
- 将膨胀的葡聚糖凝胶倒入筛选框架中，允许其自由流动并同时通过针头间的缝隙中流出。
- 这一步的目的是去除空气泡，并筛选出凝胶颗粒均匀、没有结块的葡聚糖凝胶。
5. 保存和激活- 将筛选后的葡聚糖凝胶用缓冲溶液保存，避免葡聚糖凝胶干燥。
- 如需激活葡聚糖凝胶，将其置于适当的缓冲溶液中，加入一定浓度的盐类或其他激活剂，并在较高温度（通常为60-80C）下固化一段时间，以激活葡聚糖凝胶。
6. 实验操作- 根据实验需求，将激活后的葡聚糖凝胶放入柱层析设备中。
- 将样品加入柱中，并使用缓冲溶液洗脱，或者使用适当的溶液进行柱层析。
- 注意柱层析过程中的操作，避免葡聚糖凝胶碎裂或溢出。
7. 结果分析- 根据实验的结果，可以通过检测样品组分的移动速率、表型等参数，进行结果的分析和解释。
葡聚糖凝胶75的操作方法主要包括材料准备、膨胀葡聚糖凝胶、筛选葡聚糖凝胶、保存和激活、实验操作以及结果分析等步骤。
每一步操作都需要仔细严谨，以确保实验的准确性和重复性。
葡聚糖凝胶使用说明Sephadex Gel Manuals1化学和物理性质葡聚糖凝胶是一种珠状的凝胶，含有大量的羟基，很容易在水中和电解质溶液中溶胀。
G型的葡聚糖凝胶有各种不同的交联度，因此它们的溶胀度和分级分离范围也有所不同。
葡聚糖凝胶的溶胀度基本上不因盐和洗涤剂的存在而受影响。
葡聚糖凝胶有不同的粒度。
超细级的葡聚糖凝胶是用于需要极高分辨率的柱色谱和薄层色谱。
粗级和中级的凝胶用于制备性色谱过程，可在较低的压力下获得较高的流速。
另外，粗级也可用于批量工艺。
1.1化学稳定性葡聚糖凝胶不溶于一切溶剂（除非它被化学降解）。
它在水、盐溶液、碱和弱酸性溶液中都是稳定的，在强酸中凝胶骨架的糖苷键被水解。
长期接触氧化剂将破坏凝胶，因而应避免使用。
1.2物理稳定性葡聚糖凝胶并不熔融，可以在湿态、中性PH进行灭菌。
干态的凝胶加热至120℃以上将开始焦糖化。
葡聚糖凝胶的机械强度取决于交联度。
2产品说明名称分离范围（球蛋白）应用葡聚糖凝胶G-10<700缓冲液交换、脱盐，分离小分子，去除小分子葡聚糖凝胶G-15<1500缓冲液交换、脱盐，分离小分子，去除小分子葡聚糖凝胶G-251000-5000工业上脱盐及交换缓冲液葡聚糖凝胶G-501000-30000多肽分离、脱盐、清洗生物提取液、分子量测定葡聚糖凝胶G-752000-70000蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定葡聚糖凝胶G-1002000-120000蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定葡聚糖凝胶G-1505000-300000蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定葡聚糖凝胶G-2005000-600000蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定3使用方法3.1乙醇浸泡在室温下，将干粉浸泡于50-60%乙醇中至少24小时，并不断搅拌以保证凝胶溶胀，用无盐水洗去残存的乙醇滤干。
3.2无盐水浸泡室温下，在无盐水中充分溶胀24小时，间隙搅拌，以保证凝胶的完全溶胀。
产品简介：Sephadex G型葡聚糖凝胶只适合在水相中使用，羟基化得到的Sephadex LH-20适合用于有机溶剂分离嗜脂性分子，在有机溶剂中纯化天然产物。
葡聚糖凝胶LH-20分离主要以凝胶过滤为主，兼具反相分配的作用。
在凝胶过滤的作用下，大分子化合物的保留力弱，先被洗脱下来，分子最小的最后出柱；在反相洗脱溶剂中，起反相分配作用，极性大的物质的保留弱先被洗脱，极性小的化合物后出柱；
产品名称: 葡聚糖凝胶LH-20
英文名称：Sephadex LH-20
规格：25g
性状：多孔，白色微球
基质：交联葡聚糖
粒径：100-200目
工作Ph：2-11
操作温度：4-40度
球蛋白分离范围：100-4000
排阻极限：4-5kd(与所用溶剂有关)
保存条件：4-25度
使用说明：
1.凝胶悬浮液的制备
将干粉浸泡于60-70%乙醇中，充分搅拌过夜，洗去可能存在的残留物，根据自己的洗脱液平衡层析至少两个柱体积直到基线平稳为止。
2.洗脱溶剂
如果样品极性大，选用反相溶剂洗脱（甲醇-水），样品用最少体积的甲醇-水溶解，
过滤上柱；如果样品极性小，选用氯仿-甲醇正相洗脱。
3样品处理
用尽量少的洗脱试剂溶解样品，常压过滤。
4.湿法上柱
5.洗脱
控制流速，一般小于1drop/s。
6.再生以后下次使用。
葡聚糖凝胶柱的使用方法一、准备工作：1.准备好葡聚糖凝胶柱和所需的缓冲液，如PBS（磷酸盐缓冲液）、TBS（三甲基氨基甲烷缓冲液）等。
2.将葡聚糖凝胶柱放入柱层析设备中，并根据设备的要求进行调整和固定。
3.预冲柱层析设备和葡聚糖凝胶柱，以去除可能的污染和杂质。
二、样品处理：1.将待纯化的生物大分子样品先进行预处理，如去除悬浮物、离心沉淀等。
2.将样品溶液以适当的缓冲液进行稀释，以达到最佳的样品浓度和适合葡聚糖凝胶柱操作的样品体积。
三、样品加载：1.将处理好的样品溶液缓慢地倒入柱顶，让样品从柱顶进入柱内。
避免产生气泡。
2.分子在葡聚糖凝胶柱中会根据分子大小和亲疏水性质的不同而发生分离和吸附。
较大分子会在柱上层析，而较小分子会透过凝胶层均匀流出。
因此，样品会在柱内逐渐被分离和纯化。
四、缓冲液流动：1.样品完成加载后，使用适当的缓冲液进行柱洗涤，以洗掉非特异结合的杂质。
2.缓冲液的选择应根据样品的性质而定，具体的选择和流动条件可以参考相关的文献或经验。
五、洗脱纯化：1.在用于洗脱纯化的缓冲液中，调整适当的条件以实现目标分子的洗脱。
如调整pH值、离子浓度、添加洗脱剂等。
2.根据分子的亲疏水性质，选择适当的缓冲液浓度梯度进行洗脱。
一般来说，较强亲疏水性的分子需要更高浓度的洗脱缓冲液。
六、收集洗脱液：1.将洗脱液通过柱底收集，收集不同时间点或不同分析目的的洗脱液。
2.根据实验需要，将洗脱液分为不同部分进行后续的分析或纯化处理。
七、重复使用：1.柱层析后，葡聚糖凝胶柱可以进行再生，以重复使用。
具体的再生方法可以参考柱层析设备和葡聚糖凝胶柱的说明书。
总结：葡聚糖凝胶柱是一种常用的生物大分子纯化方法，通过分子在柱内的分离和纯化来实现样品纯化的目的。
使用葡聚糖凝胶柱时，需要根据样品的特性和需求进行适当的样品处理、缓冲液选择、洗脱纯化条件的优化等。
如操作规范且配合适当的实验条件，葡聚糖凝胶柱可以快速、高效地纯化和富集生物大分子。
葡聚糖凝胶柱的使用方法：(1) 预处理称取Sephadex G-25（50－100目）约5g，加入蒸馏水100ml，置室温下3h进行溶胀。
(2) 装柱凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。
柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧，用洗净的玻璃丝（约200目尼龙布）垫底或购买类似规格的商品柱。
然后将柱垂直安装好，先加入1/3柱体积蒸馏水，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入，使它们在柱内自然沉降。
同时大开下口慢速流出蒸馏水。
装柱后的凝胶必须均匀，不能有气泡或明显条纹。
否则，必须到出重装，装好后，用蒸馏水平衡2－3h即可加样品分离。
(3) 加样加样前，首先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出，直到柱内液面与凝胶表面相齐（或留一极薄液层）为止。
然后，由柱的上端加水解液2ml，注意不要让溶液把凝胶冲松浮起，加完样品后，打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐，再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器2－3次，待全部进入层析柱后，即可进行洗脱。
(4) 洗脱与收集洗脱时，用蒸馏水作洗脱剂，并且要连续不断地进行，使凝胶柱上端保持一定的液层，防止凝胶柱表面的液体流干。
本实验洗脱液流出的速度应控制在0.8－1.0ml/min。
洗脱液的收集采用分管连续顺序收集，每管收集3ml，共收集10管。
据经验，4或5号管核苷酸浓度最大，可作为层析鉴定的样品液。
但因层析柱长度的差异，管号会有变化，必要时可用紫外检测A260nm，找出浓度最大的管号。
(5) 凝胶的再生和回收凝胶柱使用一次后，必须反冲疏松一次，平衡后再使用。
若使用数次，就需要再生处理。
用0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液浸泡，然后用蒸馏水洗至中性备用。
若实验完毕，将再生后的凝胶在布氏漏斗上用蒸馏水洗涤抽干，再用95%乙醇洗两次，在60℃烘箱中烘干，回收保存。
实验五. 葡聚糖凝胶层析【实验目的】1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。
2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。
【实验原理】凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤，是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术，这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法。
层析的固定相载体是凝胶颗粒，目前应用较广的是：具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）。
葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3—氯1，2—环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。
凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制，交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松，网孔的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。
可分离的分子量范围从几百到几十万不等。
葡聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。
分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。
若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间，则在两者之间从柱中流出，由此就可以达到分离目的。
本实验以葡聚糖凝胶G—25作为固定相载体，来分离蓝色葡聚糖—2000和溴酚蓝。
蓝色葡聚糖—2000分子量接近2×106，而溴酚蓝分子量为670，二者分子量相差较大，前者完全排阻，而后者则可完全进入凝胶颗粒网孔内，二者通过层析柱的时间不同而分开。
【实验材料】1.实验器材层析柱(1×20cm)附有一小段乳胶管及螺旋夹；洗脱液瓶(带下口的三角瓶，250m1)；试管及试管架；量筒10m1；721型分光光度计2.实验试剂(1) Tris—醋酸缓冲液(pH7.0):取0.0lmol/L Tris溶液(含0.1mol/L KCl)900m l，用浓醋酸调pH至7.0，加蒸馏水至1000m1。
(2) 溴酚蓝溶液：称取溴酚蓝10毫克，溶于5毫升乙醇中，充分搅拌使其溶解，然后逐滴加入Tris—醋酸缓冲液(pH7.0)至溶液呈深蓝色。
(3) 蓝色葡聚糖—2000溶液：称取蓝色葡聚糖—200010毫克，溶于2毫升Tris—醋酸缓冲液(pH7.0)中即成。
(4) 样品溶液：取溴酚蓝溶液0.1毫升，蓝色葡聚糖—2000溶液0.5毫升混匀后为上柱样品溶液。
(5)葡聚糖凝胶G-25 (Sephadex-G-25)【实验操作】1.实验凝胶的制备：商品凝胶是干燥的颗粒，使用时需经溶胀处理，称取4克葡聚糖凝胶G—25，加50毫升蒸馏水，搅拌均匀，在室温溶胀6小时，或沸水浴溶胀2小时，一般采用后一种方法。
再用倾泻法除去凝胶上层水及细小颗粒，用蒸馏水反复洗涤几次，再以缓冲溶液(pH7.0的Tris—醋酸溶液)洗涤2—3次，使pH和离子强度达到平衡，最后抽去溶液及凝胶颗粒内部气泡，凝胶可保存在缓冲液内。
2.装柱：将层析柱洗净，垂直固定在铁支架上，选择有薄膜端作为层析柱下口，将下口接上乳胶管并用螺旋夹夹紧。
层析柱中加入洗脱液，打开下口螺旋夹，让溶液流出，排除残留气泡，最后保留约2厘米高度的洗脱液，拧紧螺旋夹。
将凝胶轻轻搅动均匀，用玻璃棒沿层析柱内壁缓缓注入柱中，待凝胶沉积到柱床下已超过l厘米时，打开下口螺旋夹，继续装柱至柱床高度达到8厘米,关闭出口。
装柱过程中严禁产生气泡，尽可能一次装完，避免出现分层。
再用洗脱液平衡l至2个柱床体积，凝胶面上始终保持有一定的洗脱液。
平衡后，拧紧下端螺旋夹。
3.加样品：打开螺旋夹使柱面上的洗脱液流出，直至床面与液面刚好平齐为止，关闭下端出口。
取溴酚蓝及蓝色葡聚糖—2000混合液0.3毫升，小心地加于凝胶表面上，切勿搅动层析柱床表面。
打开下端出口，使样品溶液进入凝胶内，并开始收集流出液。
当样品溶液恰好流至与凝胶表面平齐时，关闭下端出口。
用少量洗脱液清洗层析柱加样区，共洗涤三次，每次清洗液应完全进入凝胶柱内后，再进行下一次洗涤。
最后在凝胶表面上加入洗脱液，保持高度为3—4cm。
4.洗脱与收集：连接好凝胶柱层析系统，调节洗脱液流速为每分钟1毫升，进行洗脱。
仔细观察样品在层析柱内的分离现象，收集洗脱液，每收集3毫升即换一支收集管(试管预先编号)，收集约20管左右，样品即可完全被洗脱下来。
将各收集管中的洗脱液分别用721型分光光度计在波长540nm处测定其光密度。
5.凝胶回收处理方法：将样品完全洗脱下来后，继续用三倍柱床体积的洗脱液冲洗凝胶后，将柱下口放在小烧杯中，慢慢打开，再将上口慢慢松开，使凝胶全部回收至小烧杯中，备用。
2 Sephadex LH20 的原理。
Sephadex LH20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。
因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。
如果使用反相溶剂洗脱，Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。
如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。
3 Sephadex LH20 洗脱溶剂。
看完第2点后，就应该清楚Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种。
用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇－－水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。
正相系统以氯仿－－甲醇最为常见，先用50％氯仿－－甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。
4 Sephadex LH20 样品的处理和洗脱溶剂的选择。
如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（一定要滤喔！要是把Sephadex LH20 堵啦，就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去，很心痛呀）。
如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱（氯仿－－甲醇），样品用最少体积的氯仿－－甲醇溶解，过滤后，湿法上样。
5 Sephadex LH-20的步骤。
(1) 选择条件：梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。
首先你的样品须要能溶解在尽量少量的洗脱剂中。
极性在的用甲醇水系统;极性小者一般用不含水的系统。
我们实验室常用正己烷二氯甲烷甲醇系统，用了很多年，效果较好。
(2) 饱和层析柱：用洗脱剂将凝胶摇匀，直立柱身，让其自然沉降，此时要防止气泡留在其中。
至少半小时打开开关，流出几个柱体种的洗脱剂，目的是使其膨胀在正确比例的洗脱剂中。
(3) 样品处理：用尽量少的洗脱剂溶解样品，常压过滤。
(4) 湿法上柱。
这也是要有技巧的步骤。
(5) 洗脱：控制流速，一般1drop/s以下，可参见厂家的一些参数;必要时更改极性（很多时一个极性就可以将样品洗脱完毕）。
再生以备下次使用。
6 分离的技巧，最后说说我的使用心得（1）流速不可太快，切切不可新急，所谓欲速则不达。
（2）柱子尽可能长，Sephadex LH20 柱长的增加将极大地改善分离，所不要吝惜填料，宁可将填料全装在一根大柱子中，不要将填料装成几根小柱。
所谓集中优势兵力，打击敌人。
（3）馏分一定要接的细，可1／10，或1／20 个保留体积接成一馏分。
（4）洗脱体积一般为2-3个保留体积，对特殊保留强的化合物，可洗脱5个保留体积。
（5）鞣质成分死吸附严重，如不在乎填料者，可用Sephadex LH20 分鞣质（6）Sephadex LH20 对黄酮类成分的分离效果极佳，方法很成型，有大量文献参考。
（7）填料反复使用，每次用完，一般可用甲醇将柱子洗干净，然后用下一次分离的起步溶剂将甲醇替换出来，待用。
Sephadex LH-20是由葡聚糖G-25羟丙基化加工而成，属于分子筛凝胶，尤其适用于天然产物在有机溶剂中的纯化。
例如：类固醇、萜类、脂类以及小分子多肽等，Pharmadex LH-20同时适用于分子类别非常相似的物质的分离和工业规模的制备，既可用于初步纯化步骤，也可用于最终精制步骤，如非对映同分异构体的分离。
1.装柱装填的重要原则之一就是需要形成一个稳定均一的柱床。
胶颗粒越均一（粒径分布越窄），越容易获得稳定均一的柱床。
但是对于Sephadex LH-20而言，25～100μm的粒径范围相对于许多用于制备色谱的填料而言，不能说分布均一，也就是说其粒径分布较宽。
然而当胶溶胀后就相对容易得到均一的柱床。
这对于长柱（最高至250cm）而言也是同样的。
在装柱前，层析柱和储槽都必须进行彻底的清洗。
Sephadex LH-20在使用之前必须进行溶胀。
在溶胀的过程中，要尽量避免过分搅拌，否则会破坏球形胶粒，且要避免使用磁力搅拌器。
