结核分枝杆菌复合群四重PCR检测方法的建立及应用

专利名称：检测结核性分枝杆菌复合群和分枝杆菌属的组合物以及使用该组合物用多重实时PCR同时检测结核性
分枝杆菌复合群和分枝杆菌属的方法
专利类型：发明专利
发明人：姜镇锡,朴荣石,俞恩珠
申请号：CN201080036118.X
申请日：20100825
公开号：CN102471806A
公开日：
20120523
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种检测结核性分枝杆菌(M.tuberculosis)和分枝杆菌属的组合物，其包含：(i)靶向结核性分枝杆菌特异性基因(IS6110)的引物和/或探针；和(ii)靶向分枝杆菌属特异性基因(内部转录间隔区(ITS))的引物和/或探针；和非必需地，(iii)靶向作为内对照的源自植物的基因的引物和/或探针。

当使用所述组合物进行实时多重聚合酶链式反应时，可以通过单个反应检测非结核性分枝杆菌和分枝杆菌属，因此可以以高可靠性快速且容易地实现临床诊断。

申请人：株式会社LG生命科学
地址：韩国首尔
国籍：KR
代理机构：北京金信立方知识产权代理有限公司
更多信息请下载全文后查看。

中国防痨杂志2021 年1月第43 卷第1期Chin J A nthuberc，Jamiai~y 2021 ,Vol. 43，No. 1• 47 ••论著•PCR-反向点杂交法检测复治涂阳患者结核分枝杆菌耐药性的价值刘轾彬吴敏吴小翠韩敏肖和平张青【摘要】目的评估PCR-反向点杂交法检测复治涂阳患者痰标本中MTB耐药性的价值。

方法收集2015 年6月至2019年1月上海市肺科医院诊治的400例复治涂阳肺结核患者的痰标本，每份标本量均不少于2 ml;每 例患者采用同一标本进行PCR-反向点杂交法MTB耐药基因检测、GeneXpen MTB/RIF检测和BACTEC MGIT 960液体培养、菌种鉴定、微孔板法药物敏感性试验(简称“药敏试验”），最终纳入357例（株）为研究对象。

以微孔 板法药敏试验结果为参考标准，评价PCR-反向点杂交法的检测效能。

结果以微孔板法药敏试验结果为参考标准.PCR-反向点杂交法检测MTB对利福平耐药性的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率和值分别为 97. 5%(115/118)、97. l%(232/239)、94. 3%(115/122)、98. 7%(232/235)、97. 2%(347/357)和 0•937,对异 烟肼耐药性的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率和Kr//少/值分别为82.5%(113/137)、99.1% (218/220)、98.3%(113/115)、90.1%(218/242)、92.7%(331/357)和 0.841，对链霉素耐药性的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率和 /<«沖a 值分别为 86.5%(115A33)、99. 1%(222/224)、98, 3%(115/117)、92.5%(222/240)、94.4%(337/357)和0.877,对乙胺丁醇耐药性的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率和 值分别为 60.7%(37/61)、98.6%(292/296)、90.2%(37/41)、92.4%(292/316)、92.2%(329/357)和 0.682。

•240 •结核与肺部疾病杂志 2020 年12 月第1卷第3 期J Tuberc Lung Dis，December 2020, Vol. 1，No. 3•论著.三种检测技术鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌的效能评价易俊莉杨新宇张洁田丽丽丁北川武文清【摘要1目的评价对硝基苯甲酸/噻吩-2-竣酸肼（PNB/T C H)生长试验法、结核分枝杆菌抗原（MPB64)检 测法、PCR-荧光探针法在结核分枝杆菌复合群(MTBC)与非结核分枝杆菌(N TM)鉴别中的应用价值。

方法11株 标准菌株包括M T B标准株H37R v及10株N T M标准菌株均来源于国家结核病参比实验室。

238株临床分离株为北京结核病控制研究所2019年1一 12月门诊患者培养阳性冻存菌株，经涂片抗酸染色均为阳性。

应用 PNB/T C H生长试验法、MPB64检测法、PCR-荧光探针法及微阵列基因芯片法对11株标准菌株及238株临床分离 株进行鉴定;以微阵列基因芯片法菌种鉴定结果为参照，评价PNB/T C H生长试验法、MPB64检测法、PCR-荧光探 针法鉴别M T B C与N T M的效能。

结果以微阵列基因芯片法菌种鉴定结果为参照，PNB/T C H生长试验法、MPB64检测法、PGR-荧光探针法检测M T B C的敏感度分别为100_ 0%(206/206)、98. 5%(203/206)、100. 0% (206/206);特异度分别为 96. 9%(31/32)、100. 0%(32/32)、100. 0%(32/32);符合率分别为 99. 6%(237/238)、98. 7%(235/238)、100. 0%(238/238); K冲/« 值分别为 0• 98、0. 95、1.00。

PN B/TC H生长试验法、MPB64 检测法、PCR-荧光探针法检测周期分别为28 d、0. 5 h、0. 5 d，检测平均成本分别为20、40、60元。

结核分枝杆菌的优化PCR检测方法的研究王洪君;周宜开;王家玲【期刊名称】《中国卫生检验杂志》【年(卷),期】2002(12)2【摘要】〔目的〕的建立了检测结核分枝杆菌的高灵敏度和高特异性PCR扩增体系。

[方法]以国内结核病人常见病原菌-结核分枝杆菌、牛分枝杆菌特异性抗原Pab编码基因上的419bp段作为扩增靶序列,扩增引物序列为5’-ACC、ACC、GAG、CGG、TTC、CCC、TGA-3’、5’-GAT、CTG、CCG、GTC、GTC、CCA、GGT-3’。

〔结果〕变性温度选择69℃-70℃。

PCR扩增体系的成份经优化,选择引物浓度为0.30μmol/L,dNTP浓度为150μmol/L,MgC12浓度为3.5mmol/L。

〔结果〕该体系对11株标准菌株和12株临床分离菌株提纯的染色体进行扩增,其中卡介苗、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌的扩增为阳性,其他分枝杆菌为阴性。

〔结论〕以提纯的染色体DNA作模板,该体系可检出5fg结核杆菌染色体DNA,相当于一个结核分枝杆菌。

【总页数】3页(P131-133)【关键词】结核分枝杆菌;优化PCR检测;研究【作者】王洪君;周宜开;王家玲【作者单位】石油大学(北京)化工学院环境中心;华中科技大学同济医学院环境医学研究所【正文语种】中文【中图分类】R446.5【相关文献】1.应用三重PCR方法快速特异性检测并鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌DNA(简报) [J], 李子玲;康晓明;杨毓华2.免疫磁珠捕获联合PCR-ELISA定量检测结核分枝杆菌的方法学研究 [J], 王震;龚玉华;钱彩娣;孙春红;周丽萍;傅行礼;邵启祥3.分子信标荧光定量PCR检测结核分枝杆菌的反应体系优化方法对比研究 [J], 陆巧荣;方梅;洪志强;余志祥;胡朝友4.利用荧光定量RT-PCR和PCR方法检测结核分枝杆菌复合群 [J], 姜丽娟;李瑶;吴文娟;吴海;周键;吴伟;李涛;郭建;王洪海;卢水华5.结核分枝杆菌高特异性MB-PCR体系优化及荧光检测研究 [J], 陈庆海;边志衡;张雪;匡红;敖琳;府伟灵因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

结核杆菌基因检测（PCR）
结核杆菌基因检测（PCR）介绍：
结核分枝杆菌在体外培养周期长，阳性检出率不高，因此对临床的早期诊断和确定药物治疗都带来一定的困难，应用聚合酶链反应(PC R)技术检测结核分枝杆菌，能大大提供结核分枝杆菌的检出率和检出特异性，有利于临床即使治疗。

标本采自患者的痰、支气管分泌物、脑脊液、心包积液、胸腔积液、胸腹水等。

结核杆菌基因检测（PCR）正常值：
阴性。

结核杆菌基因检测（PCR）临床意义：
异常结果：
阳性：见于各种结核病。

需要检测的人群：
发热，盗汗，咳嗽，咳痰，胸痛，咯血的人群
结核杆菌基因检测（PCR）注意事项：
检查时：配合医生进行检测
检查后：
若检测结果阳性，应该立即就医，由医生判断是否得进行隔离或者其他医疗措施。

不适宜人群:没有
结核杆菌基因检测（PCR）检查过程：
应用聚合酶链反应(PCR)技术检测结核分枝杆菌。

AIDS伴结核病患者结核分枝杆菌复合群检测结果分析发表时间：2017-05-24T14:11:20.110Z 来源：《心理医生》2017年5期作者：李晓军王晓丹[导读] 对AIDS伴结核病患者进行结核分枝杆菌复合群检测,分析检测结果。

（威海胸科医院山东威海 264200）【摘要】目的：对AIDS伴结核病患者进行结核分枝杆菌复合群检测,分析检测结果。

方法：选择于我院受治疗的36例治疗的疑似AIDS伴结核病患者,设为研究组,选择同期在我院接受治疗的35例疑似结核病患者（不伴AIDS），设为对比组。

结果：两组结核分枝杆菌阳性率分别是47.2%、45.7%,结核分枝杆菌复合群检测均显示阳性,符合率是100%,两组阳性检出率比对未见差异,（P＞0.05）。

结论：对疑似AIDS伴结核病患者实施结核分枝杆菌复合群检测有重要意义,能够尽早明确是否合并结核病,并及时施予干预。

【关键词】结核病；AIDS；结核分枝杆菌复合群；检测【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2017）05-0102-02 对于艾滋病患者而言，结核病是一种较为常见的并发症，结核病的发生与机体免疫力有很大相关性，而艾滋病属于免疫功能障碍性疾病的一种，发病后，患者机体免疫力会严重下降，增大了感染结核病的可能性[1]。

相较于单纯的结核病患者，AIDS伴结核病患者的诊断更为复杂，本次研究同时对单纯疑似结核病、疑似AIDS伴结核病患者进行结核分枝杆菌复合群检测与病原菌培养。

1.对象以及方法1.1 研究对象在2015年7月—2016年7月这一期间疑似AIDS伴结核病到我院接受治疗的患者中选择36例，设为研究对象，男女比例是19:17，20岁～61岁，均值是（41±6.7）岁，均明确存在艾滋病。

在同期进入我院治疗的疑似单纯结核病患者中选择35例，设为对比组，男女比例是18:17，20岁～60岁，均值是（40±6.5）岁。

如何用PCR技术检测结核杆菌结核杆菌可以导致全身性疾病，特别是在发展中国家，其发病率较高，危害性极大.近几年结核杆菌的变异性较大，对抗痨药物的耐药性增加，从而使结核病的发病大幅度增高.虽然传统的涂片抗酸染色、细菌培养以及胸片检查对大部分结核能作出正确的诊断，但对某些病人亦可造成误诊或漏诊;动物接种虽特异性较高，但因时间较长，不能满足临床快速诊断的需要.近几年也出现了几种快速诊断方法，但也存在较大的缺陷，如短期培养后抗原免疫原性分析，即用放免方法或酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BACTEC培养瓶中被培养标本所分泌的抗原，该方法可在BACTEC瓶本身鉴定出细菌之前，结合ELISA和涂片抗酸染色有效地鉴别典型和非典型分枝杆菌，敏感性较高，但存在培养时间长，重复性尚差的缺点.另一种是短期培养后核酸探针杂交法，即用特异性DNA探针与BACTEC瓶中培养的细菌染色体DNA杂交.该方法能有效地防止培养的假阴性结果，但却易发生假阳性结果，加之采用的方法较为复杂和繁琐，又有涉及同位素操作之嫌等，因而近来已较少应用.上面两种方法都要借助细菌培养来进行，虽然在时间上比传统培养大大缩短，但缺乏快速诊断的优势.近几年兴起的PCR 方法基本实现了快速、灵敏、准确地诊断结核的目的，并且该方法正趋于常规化地应用于临床一般实验室.应用PCR方法检测结核杆菌的首要条件是设计一对特异性DNA引物.该引物所引导的DNA扩增序列应是结核杆菌独有的，且是结核杆菌的保守序列，这样才能保证检测结果的特异性.PCR方法的另外几个关键因素是:①DNA提取，即对有限的结核杆菌应尽量地将其DNA完整、全部地提取;②TaqDNA聚合酶的活性;③PCR产物的检测方法，即将PCR产物进行快速、灵敏、安全、准确的检测.一、结核杆菌DNA的提取在该技术上，目前仍无一种统一常规化的方法.现有各方法都存在着提取DNA不足的缺点，因此，敏感性受到影响.现在主要的细菌裂解方法是:①蛋白酶K加表面活性剂法;②蛋白变性剂加表面活性剂煮沸法;③反复冻融法;④超声波法;⑤溶菌酶加表面活性剂法.提取DNA的方法主要有:①酚一氯仿提取法:即用酚一氯仿抽提含有裂解菌体的溶液，然后用乙醇从抽提后的溶液中沉淀DNA.有的学者将硅酮加入酚一氯仿中，使水相和有机相的界面更牢固，这样不但能减少抑制因子混入水相，而且使DNA提取量比未加硅酮方法高20%～30%;②Chaotrop-silica法:用二氧化硅(sio2)吸附裂解菌体释放出的DNA，该二氧化硅用70%乙醇洗涤，而后干燥，最后用双蒸水洗脱(55℃).有报道认为该方法可以消除痰中的某些抑制因子.有的学者发现未预裂解的结核杆菌直接煮沸进行PCR的效果与预先处理的相仿，提示结核杆菌不预裂解也可直接进PCR.但加入的菌数应约1000个，否则细菌蛋白会对PCR产生抑制作用.二、引物的设计根据不同型结核杆菌的序列，目前常在下列几种序列内进行引物设计.(一)编码结核杆菌抗原的基因序列1.编码65-KDa蛋白抗原的基因序列:结核杆菌65-KDa蛋白抗原为存在于所有分枝杆菌细胞壁中的热休克蛋白，也是一种交叉反应蛋白.所以依据该序列设计合成的引物，PCR能扩增出所有分枝杆菌的靶DNA片段，没有属内特异性.这种PCR较适用于结核病高发区大规模筛选和流行病普查.另外，对65-KDa蛋白基因的PCR扩增产物进行限制性酶切分析(RFLP)，也可以准确地检测出结核杆菌的属内归属.2.编码MPB64蛋白的基因序列：MPB64蛋白为结核杆菌复合群(MTBC，包括人型结核杆菌、牛型结核杆菌、BCG、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌)所特有.根据该蛋白的基因序列设计的引物进行PCR，对MTBC模板DNA显示出高的特异性.3.编码38-KDa蛋白抗原b(Pab)的DNA序列:该序列仅存在于人型和牛型结核杆菌.采用在此基因内设计合成的引物和探针进行PCR，只能扩增人型和牛型结杆菌的DNA序列，能检出少至10个结核杆菌的纯化DNA.4.编码32-KDa蛋白的基因序列:32-KDa是蛋白分枝杆菌的一种分泌蛋白，由它的基因序列设计的引物和探针进行PCR，可以特异地检测出分枝杆菌的DNA片段，能检测出50fg的纯化DNA，相当于10个结核杆菌.5.编码MPB70抗原的基因序列:MPB70为牛型结核杆菌所特有，由该基因序列设计的引物进行PCR，对牛型结核杆菌的检测具有高度的特异性和敏感性.(二)结核杆菌基因组重复序列1.克隆DNA序列:目前所应用的DNA序列都是MTBC所特有，拷贝数在10个以上，包括亚克隆重组质粒pPH7301和克隆质粒PMTb4，分别含KpnI-SmaI插入片段和EcoRI-BamHI插入片段.根据这些基因序列设计的引物，其检出限在20个结核杆菌以下.2.插入序列:结核杆菌的插入序列主要有IS6110和IS986，它们仅见于MTBC.这两种插入序列在基因组中的拷贝数为1--20个，选择插入序列作为扩增的靶序列，可以得到较高的敏感性和特异性.尤其是IS6110，是目前进行临床PCR检测的首选区段.(三)人型结核杆菌特异序列mtp40是人型结核杆菌特异性DNA片段，Portillo等选择mtp40作为靶序列，用PCR检测结核杆菌，结果只能扩增人型结核杆菌DNA，敏感性达到10fg纯化DNA量.(四)分枝杆菌dnaJ基因该基因为分枝杆菌共有，但种间又存在差别，在该基因序列内设计合成的引物和探针用于PCR检测，能检出50fg的纯化分枝杆菌DNA，相当于10个结核杆菌.并可用于区分结核杆菌和非典型结核杆菌的鉴别诊断.(五)rRNA序列用“通用”引物在逆转录酶作用下，将16SRNA逆转录合成cDNA，然后对cDNA进行PCR扩增，检出限达0.1fg化的结核杆菌rRNA.临床标本中少至10个结核杆菌亦可被检出，该方法由于加了一步反转录过程相对增加了难度，临床一般少用.三、PCR产物的检测方法通常PCR产物的检测方法是经琼脂糖电泳后，用溴化乙锭染色，然后在紫外灯下观察或进一步采用标记的DNA探针杂交.为了进一步提高检测的灵敏度，现多在引物和探针的标记上进行改进.由于放射性标记物的危害性，现多采用非放射性标记，如生物素、荧光素、酶及化学发光剂.Wilson等在巢式PCR的内侧引物上分别掺入生物素和地高辛配基，这样PCR产物两端就分别带有生物素和地高辛配基.PCR 产物上的生物素和附着在微型滴定板表面的生物素蛋白结合，使PCR 产物附着在滴定板上，另一端的地高辛配基和加入的抗地高辛配基碱性磷酸脂酶结合形成抗地高辛配基碱性磷酸脂酶偶合物，利用该偶合物405nm的吸收峰做光密度(OD)测定.另外，还可用吖啶酯标记探针进行杂交，用硼酸钠将未杂交的探针分解，然后加入H2O2溶液和NaOH 溶液使吖啶酯水解，最后测量吖啶的光通量.虽然这些方法安全、快速、但其敏感性还需进一步提高，操作还需进一步简化.四、PCR检测结核杆菌的敏感性和特异性(一)PCR的特异性PCR特异性的关键首先取决于所选靶序列的特异性.现在常用的靶序列有:①分枝杆菌共有的靶序列，如65-KDa蛋白基因序列;②MTBC特有的靶序列，如MpB64蛋白基因序列、IS6110序列.③人型结核杆菌特异的靶序列，如mpt40序列.引物设计对PCR的特异性也至关重要.引物序列在靶DNA上的专一性、以及引物的特异性和保守性，以及引物本身的许多特性，如G+C含量引物3&#39;未端序列的特异性和保守性及引物长度等都影响PCR的特异性，另外在设计引物时也要防止出现引物间的过多配对，以免形成过多的引物聚合体，造成非特异性扩增.PCR扩增TB的特异性除上述先决条件外，也与PCR反应本身有极重要的关系.其中退火温度是一个重要因素，退火温度过低时，引物易发生非特异性结合，造成非特异性扩增.由于结核杆DNA中G+C含量高，因此可以适当提高退火温度，以获得更高的特异性.另外，PCR缓冲液的组成，尤其是Mg2+浓度对PCR的特异性也有较大影响，Mg2+浓度过高，会提高PCR产物的产量，但同时也会增加非特异性扩增.(二)PCR的敏感性PCR的敏感性很高，一般可以检测出1～100fg纯化的结核杆菌DNA，相当于1～20个结核杆菌，这种敏感性明显高于涂片法和培养法.PCR还可以检出培养法易发生失败的病例，从而大大提高菌阴结核病的诊断.另外PCR检测TBDNA不受抗痨治疗的影响，可以准确观察抗痨治疗的效果，防止血清学方法所带来的假阴性结果.PCR敏感性受下列因素影响:①扩增靶序列的拷贝数.一般认为，结核杆菌染色体中含靶序列拷贝数越多，PCR敏感性越高，如38-KDa蛋白的基因序列在结核杆菌染色体中只有一个，而IS6110序列的拷贝数却有10～12个，结果PCR敏感性后者比前者高100倍;②PCR的循环次数.在一定程度上，PCR循环次数越多，其敏感性就越高，但要合适.因为，循环次数过多会增加非特异性问题，造成结果判断上的失误，产生假阳性结果;③结核杆菌DNA的提取技术.处理标本时首先要富集(如离心)标本中的TB，使单位体积内TB含量变高，从而增加了起始模板数，有利于提高PCR的灵敏性.同时提取过程要尽可能减少抑制成份，并提高DNA的提取率.④PCR产物的检测方法.虽然DNA探针杂交要比直接电泳法敏感性高得多，但步骤繁琐，这也是影响PCR临床应用的原因之一.但一般情况下，直接电泳法的敏感性完全能够达到检测的需要.五.PCR在结核病临床诊断中的应用PCR检测结核杆菌的优点决定了它在临床上的应用价值和范围，PCR检测TB的优点主要表现如下:1.能早期诊断TB菌血症:在TB感染的早期，特别是在TB病灶通过血源性外传播时、及在外周血中存在极少量的TB时，PCR就能给于扩增并确诊.此外，由于外周血中TB的含量甚微，又没有新的病灶形成，因而血清学方法和物理方法均难以达到确诊的目的，而对这类病灶的早期诊断在临床治疗上具有指导意义，因为早期菌血症是较易控制的，并可以防止继发性TB病灶的形成.2.时间短;PCR检测TB仅需2-4h对于某些培养法难以实施的病例，PCR法则行之有效，同时提高了敏感性和特异性，可以检测到1个TB菌.3.有利于鉴别诊断:对于肺结核来说，其中的结核球和成人型原发性结核等，经常易于同肺癌的诊断相混淆.病灶中心部位经常出现既未见TB又未见癌细胞的坏死区.此时涂片检测常是阴性的.在这种情况下，PCR检测就显得特别有效.它不但可以扩增能着色的活菌，还可以扩增已死亡的，但DNA尚未降解的死菌，从而确定这样的病灶是恶性还是良性.在许多情况下，TB可以导致脑膜炎、胸膜炎、腹膜炎等.涂片法尽管在诊断上具有直接、简便的优点，但敏感性差就局限了它的诊断范围和实用价值.PCR检测这类标本，可以说极其有效.其极高的特异性和敏感性可以很容易地确定TB性脑膜炎及TB性胸腹水.另外，对于肾结核、泌尿生殖系统结核的诊断，PCR都可以予以完成.4.抗痨治疗的评价:对于抗痨治疗效果的评价，以前的方法显得软弱无力.而PCR法则可以通过定期检测，采用定量PCR法确切地评价抗痨药物的疗效及残存菌的数量和活性度.在体内一般情况下，细菌死后，其蛋白系统很快崩溃，而DNA则能相对较长时间地保存下来.这些DNA在某种情况下又会复活.所以，细胞的死亡最可靠的评价指标是其基因DNA的完全降解.特别是在许多问题未搞清楚以前，更应该以DNA的降解来判定病原体的死与活.从理论上讲，PCR扩增结果将是最可靠的疗效评价指标.5.修正以往所谓“正确”的观念:致病菌与机体的防御系统是一对激烈的矛盾，致病菌可以以任何方式和通路打击人体的防御系统，以便其生存和繁殖.在健康人群和周围环境中都携带或存在有大量的TB，但何时何地才会造成机体致病呢?以往认为TB很少存在于外周血，这主要是因为外周血中查不到TB，或TB已被局限在肺组织中.但很难让人相信的是，肺部血管极其丰富，淋巴组织和血管网共同构成人体的细胞外液贮存和交换的场所.所以，二者之间的交换是经常的.这种交换就包括能透过毛细血管壁的致病菌.当然，对于TB来讲，大多数细菌将被机体的免疫器官禁固起来.但仍有不少“漏网之鱼”，只是以前所用的方法敏感性及特异性均不够.但在某些情况下，如情绪低落、过度劳累、感冒等情况下，机体防御系统功能减弱，就会造成致病菌的攻击发生疾病.所以PCR技术对于评估临床疗效、疫情的检控、发病机理的探讨均有十分重要的意义.六、PCR在检测TB中的注意事项PCR如操作不严格会出现假阳性和假阴性结果.发生假阳性最常见的原因是:样品间的污染和扩增产物的污染.样品间的交叉污染最易发生在样品的处理过程之中.如大家共用一个加样器、剪刀、位置等，因此在处理活检标本时，用剪刀剪碎组织块，每个标本用后，剪刀应在火上烧数分钟，以彻底清除污染在剪刀上的DNA.对于液态标本的处理，尽可能在同一管子内处理.用具应为一次性的.要解决好扩增物的污染，最佳的方式是减少操作的时间，简化操作手续并使用一次性离心管及接头.因为扩增产物的量一般很高，易于污染实验室任何地方.所以减少打开反应管的次数会降低假阳性的发生率.。

如何用PCR技术检测结核杆菌PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种常用的分子生物学技术，可以在体外迅速扩增目标DNA片段。

结核杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是引起结核病的主要致病菌，PCR技术可以帮助快速、敏感地检测结核杆菌的存在。

PCR技术的基本原理是在适当的温度和条件下，通过DNA的模板作用，采用DNA聚合酶酶促反应，不断重复进行DNA的复制和扩增。

PCR主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。

检测结核杆菌的PCR方法通常基于目标DNA序列的选择。

结核杆菌的完整基因组中有很多可供选择的DNA序列，其中包括ESAT-6（Early Secreted Antigenic Target 6-kDa protein）和MPB64（Mycobacterial Protein of 64 kDa）等。

这些DNA序列作为靶序列，能够准确、特异地识别结核杆菌。

PCR检测结核杆菌的具体步骤如下：1.样本采集：从患者的痰液、组织或其他临床样本中采集目标DNA。

对于结核杆菌的检测，通常采集深咳嗽产生的痰液样本。

2.DNA提取：利用商业化的DNA提取试剂盒或其他方法，从样本中提取出DNA。

DNA提取过程中需要注意避免污染和降解DNA。

3. PCR反应体系的制备：准备PCR反应体系，包括引物（primer）、缓冲液、聚合酶、模板DNA等。

4.PCR反应条件的设置：设置合适的PCR反应条件，包括退火温度、延伸温度和时间等。

这些反应条件的选择需要根据引物的退火温度和特异性来确定。

5.PCR反应的进行：将PCR反应体系加热至相应温度，开始PCR反应。

PCR反应通常经历多个循环，每个循环包括变性、退火和延伸三个步骤。

6.PCR产物的分析：利用凝胶电泳等方法对PCR产物进行分析。

凝胶电泳可以通过检测标记在PCR产物上的荧光剂或染料来确定PCR反应的结果。

7.结果判断：根据PCR反应产物的大小、形状和荧光信号等特征，判断是否存在结核杆菌DNA。

经验交流182 2015年19期结核分枝杆菌复合群检测在AIDS 合并结核病诊断中的应用田金峰1王先化21.山东省沂水县结核病防治所，山东 沂水 2764002.青岛大学医学院，山东 青岛 266021摘要：目的：对MTD （结核分枝杆菌复合群）检测在AIDS 合并结核病诊断中的应用价值进行探究。

方法：选取我院2013年1月-2014年12月期间收治的AIDS 并疑似结核病患者68例（观察组），并随机选取同期住院的非AIDS 并疑似结核病患者54例（对照组），对两组患者的痰标本分别进行MTD 、病原菌培养和抗酸染色检测，比较检测结果的差异性。

结果：观察组患者的MTD 检测阳性率、病原菌培养阳性率及抗酸染色阳性率分别为26.5%、30.9%、19.1%，对照组患者的MTD 检测阳性率、病原菌培养阳性率及抗酸染色阳性率房分别为37.0%、37.0%、35.2%。

结论：结核分枝杆菌复合群检测对于AIDS 合并结核病患者的临床诊断具有重要作用，能提高诊断的阳性率，促进患者的早期治疗。

关键词：结核分枝杆菌复合群；AIDS ；结核病；诊断价值 中图分类号：R446.5 文献标识码：A 文章编号：1671-5837（2015）19-0182-02结核病是艾滋病的较常见并发症，目前，我国的结核杆菌感染率较高，但临床发病率相对较低，这说明结核病的发病不仅和细菌毒性及数量相关，同时也与机体的免疫能力相关。

艾滋病是一种严重免疫功能障碍性疾病，患者的免疫能力发生明显降低，因此易感染其他传染性疾病，如结核病。

艾滋病并结核病和单纯结核病的实验室检查方法存在差异，由于患者免疫能力显著下降，因而对结核菌素试验及抗酸染色的阳性反应较小，外加痰菌培养时间过长，不利于患者的诊断及治疗，因此选择适宜的实验室检测指标显得十分必要。

本文对我院收治的结核病患者及艾滋病并结核病患者实施了结核分枝杆菌复合群检测，发现检测价值较高，现汇报如下。