酶免疫测定技术

酶免疫技术（Enzyme Immunoassay，EIA）了解：1.酶免疫技术中相关技术环节2.酶免疫测定的应用理解：1.酶免疫技术的分类、测定原理及主要类型2.酶免疫技术的特点掌握：ELISA的基本原理、主要类型、方法、步骤、结果判断一、酶免疫技术概述（一）基本原理：利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高特异性抗原-抗体反应的检测敏感性的一种标记免疫技术。

EIA：抗原抗体反应的特异性、酶高效催化的专一性（二）基本特点：1.①标记后保留酶和抗原(抗体)的活性2.②酶促反应专一性，保证特异性3.③底物反应放大作用，提高敏感性4.④酶标试剂保存稳定5.⑤操作简便，安全易行（三）主要试剂的制备与要求：1.酶与酶作用底物(1)用于标记酶的要求：①酶活性高②标记后酶活性稳定,不影响抗原抗体的免疫反应性③酶催化底物后信号易判定或测定④酶活性不受样品中其他成分的影响⑤酶、辅因子及底物理化性质稳定,安全无害、价廉2.酶标记抗体或抗原(1)通过化学反应或者免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成结合物，也称酶标志物或酶结合物。

(2)酶结合物（conjugate）：①酶免疫技术的核心组成部分②直接影响酶免疫技术的应用效果③它的制备是酶免疫技术中非常关键的一个环节①戊二醛交联法②改良过碘酸钠法（直接法）3.固相载体目的：分离游离和结合的酶标志物(1)基本要求①结合容量高，结合稳定②可与抗原抗体复合物等大分子蛋白结合③生物大分子固化后仍保持活性④固化方法简便易行、快捷经济(2)固相载体的种类与选择1)塑料制品（聚苯乙烯）：材料经济，操作简便，易于自动化，最常用2)微颗粒（免疫磁珠）：结合容量大，反应迅速，普遍用于自动化分析3)膜载体（western-blot）：硝酸纤维素膜（NC）、尼龙膜等微孔滤膜，广泛应用于定性或半定量的斑点ELISA (3)包被与封闭1)包被（coating）：将抗原或抗体结合在固相载体上的过程，一般采用偏碱（pH 9.6）的碳酸盐溶液2)封闭（blocking）：1％-5％牛血清白蛋白或5％-20％小牛血清，再包被以消除固相载体未覆盖位点产生的非特异干扰二、酶免疫技术的分类（一）均相酶免疫测定基本原理利用酶标抗体结合抗原形成复合物后，标记酶的活性发生改变的原理，在不将复合物与游离酶标抗体分离的情况下，直接测定系统中总的标记酶活性的改变，进而推算出待检样品中的抗原量。

酶免疫技术原理酶免疫技术是一种常用的实验技术，其原理是将酶标记的抗体与待检测物相互作用，通过检测酶标记的反应产物来间接检测待检测物的存在或浓度。

酶免疫技术可以用于检测抗体、蛋白质、核酸等生物分子，也可以用于定量或半定量分析。

酶免疫技术的步骤通常包括以下几个步骤：1.抗原或抗体的加样和固定将待检测物加入到试剂盒中的孔洞中，然后使其在盒子表面固定。

2.疫苗抗体的反应将已知的疫苗抗体加入到试剂盒孔洞中，使其与待检测物结合。

3.标记酶的加入将用于标记酶的物质加入到试剂盒孔洞中，使其可以与疫苗抗体结合。

4.洗涤用冷凝水或其他方式，将未结合的物质从孔洞中提取出来，以保证准确性。

5.色素反应加入染料或颜料，使得待检测物和标记酶协同反应，产生色素反应。

6.结果的读取和分析根据产生的颜色和染料的浓度，来分析待检测物的浓度和质量。

酶免疫技术通常有两种形式：1.间接ELISA间接ELISA是酶免疫技术中最常用的一种方法。

它利用酶标记的二抗与待检测物的一抗结合，通过检测酶标记反应产物来间接检测待检测物的存在或浓度。

间接ELISA具有灵敏度高、特异性好、反应快、操作简便等特点。

2.竞争ELISA竞争ELISA是利用酶标记的抗体与水相抗原或待测物相竞争结合的一种方法。

当待测物或水相抗原与标记抗体竞争时，标记抗体附着在固定物上的数量姗姗而后，细胞内的信号会变弱或消失。

通过测定标记抗体的数量，可以计算出被测物质的含量。

酶免疫技术是一种有效的生物分析技术，其通过简单的实验流程和基于酶反应的原理，可以快速准确地检测分析生物分子的存在和浓度。

酶免疫技术在生物医学、环境科学、食品质量检测等领域有广泛的应用。

1.免疫学研究酶免疫技术在免疫学研究中有着重要的作用。

利用酶免疫技术，可以检测和定量各种免疫球蛋白、细胞因子和细胞表面标志物，研究它们在疾病状态和治疗方案中的作用。

2.临床诊断酶免疫技术在临床诊断中也有很重要的应用。

可以用于检测肿瘤标志物、气道标志物和血液蛋白等，帮助诊断癌症、哮喘和重症肌无力等疾病。

酶联免疫吸附测定与酶联免疫印迹技术1. 引言酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA）和酶联免疫印迹技术（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称Western blot）是两种常用的免疫学实验技术。

它们在生物医学研究和临床诊断中具有广泛的应用。

本文将对这两种技术进行详细介绍，并比较它们的优势和局限性。

2. 酶联免疫吸附测定（ELISA）2.1 原理ELISA是一种通过酶标记的抗体与待测物相互作用来检测目标分子的方法。

它主要包括固相吸附、特异性抗体结合、酶标记抗体结合和底物反应四个步骤。

首先，将待测物固定在微孔板上，形成固相吸附。

然后，加入特异性抗体与待测物结合。

接着，加入酶标记的二抗与特异性抗体结合，形成抗原-抗体-酶标记抗体复合物。

最后，加入底物反应，酶催化底物反应产生可测量的信号。

根据信号的强度可以定量测定待测物的浓度。

2.2 应用ELISA技术在生物医学研究和临床诊断中有广泛的应用。

它可以用于检测病原微生物、肿瘤标志物、激素、抗体等多种生物分子。

在临床诊断中，ELISA可以用于早期筛查、疾病诊断和疫苗效果评估等方面。

在研究中，ELISA可以用于分析蛋白质相互作用、药物筛选和基因表达分析等。

2.3 优势和局限性ELISA的优势在于其灵敏度高、特异性强、操作简单、结果可定量等特点。

它可以同时处理多个样本，适用于大规模实验。

此外，ELISA的结果可以通过光学密度或荧光强度来定量，结果可靠。

然而，ELISA也存在一些局限性。

首先，ELISA只能检测已知的目标分子，无法发现新的生物标志物。

其次，ELISA的结果受到固相吸附和抗体选择的影响，可能存在交叉反应和误差。

此外，ELISA对样本的处理和保存要求严格，操作不当容易导致误差。

3. 酶联免疫印迹技术（Western blot）3.1 原理Western blot是一种通过检测目标蛋白在蛋白电泳分离后的特异性抗体结合来定性和定量目标蛋白的方法。

酶放大免疫测定法原理酶放大免疫测定法（Enzyme Amplified Immunoassay，EAI）是目前广泛应用于生物医学领域的一种检测方法。

它的原理是利用酶的特异性和高效性，以及免疫学技术对抗体和抗原的强烈互作用，实现对生物分子的高灵敏度检测。

在EAI中，抗体和抗原的结合将会启动与酶的结合，从而使酶的活性得到放大。

这种放大效应的实现有两个重要步骤。

首先，选择合适的抗体和抗原可以使它们在试剂盒中形成稳定的和高度特异的互作用。

其次，在酶的选择和调节方面，需要特别注重它的基本性质，如稳定性、特异性和敏感性等。

这种放大效应的实现可以通过多种不同的酶进行，常见的有辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）、碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，AP）和β-半乳糖苷酶（β-Galactosidase，β-Gal）等。

此外，其检测原理也分为直接和间接检测两种方式。

在直接检测中，抗体或抗原会附着在表面或载体上，当待测物与它们结合，酶便进一步识别并与待测物发生互作用。

而在间接检测中，则是通过一系列特定步骤来实现。

如首先，当待测物与表面上的抗体或抗原结合时，与其结合的二抗或二元复合体被加入到其中，酶也在其中发挥作用进行信号放大，最终通过比色法或荧光法等检测方式，对待测物进行定性或定量分析。

由于EAI具有灵敏度、特异性和多样性等方面的优势，因此在生物医学领域中具有广泛的应用前景。

其中涉及到的内容可能包括疫苗研究、细胞学研究等方面。

比如，通过对疫苗通过EAI的检测，可以反映其在人体内的免疫反应情况，有助于疾病诊断和治疗；而在细胞学研究方面，EAI还可以用于对基因表达和蛋白质分布状况等进行定量分析。

总之，EAI的原理和应用内容非常广泛，它是一种高灵敏度和高特异性的检测方法，通过合适的酶放大效应，可以实现对生物分子的定性和定量检测。

酶免疫测定技术酶免疫测定技术（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA）是一种常用的生物分析技术，用于检测样品中特定蛋白质或其他分子的存在和浓度。

该技术基于抗原与抗体之间的高度特异性反应，通过酶的催化作用来实现信号放大，从而实现对目标分子的灵敏检测。

一、ELISA的原理ELISA技术主要包括间接ELISA、竞争ELISA、直接ELISA和夹心ELISA等多种变种。

其中，间接ELISA是最常用的一种。

在间接ELISA中，首先将待检样品溶液加入到微孔板中，使得目标分子与固相抗体结合。

然后，通过加入与目标分子特异性结合的二抗，与固相抗体结合。

最后，加入酶标记的二抗，使其与二抗结合，形成“抗原-固相抗体-二抗-酶标记二抗”复合物。

接下来，通过加入底物，使酶催化底物发生可见的颜色反应。

最后，根据反应的颜色强度测定目标分子的浓度。

二、ELISA的应用ELISA技术具有高灵敏度、高特异性和高通量的特点，因此在医学、生命科学研究、药物开发等领域得到了广泛应用。

1. 医学诊断ELISA技术在临床医学中被广泛应用于疾病的诊断和监测。

例如，ELISA技术可以用来检测人体内的病毒、细菌或其他病原体引起的感染。

通过检测患者体液中的特定抗体或病原体抗原，可以确定疾病的存在和严重程度。

2. 生物学研究ELISA技术在生物学研究中被广泛用于分析细胞因子、激素、细胞表面受体等生物分子的表达和调控。

例如，科研人员可以利用ELISA技术来测定细胞培养液中特定蛋白质的浓度，从而研究其在细胞信号传导、细胞分化和细胞凋亡等生物过程中的作用机制。

3. 药物开发ELISA技术在药物开发过程中发挥着重要的作用。

通过ELISA技术，药物研发人员可以测定药物在体内的药物浓度和药物代谢产物的浓度。

这有助于评估药物的吸收、分布、代谢和排泄（ADME）特性，从而指导药物的优化设计和临床应用。

三、ELISA的优势和局限性ELISA技术具有以下优势：1. 高灵敏度：ELISA技术可以检测非常低浓度的目标分子，通常在纳克/毫升的水平上。

第九章酶免疫技术第一节酶免疫技术的特点酶免疫技术是将抗原抗体反应的特异性和酶高效催化反应的专一性相结合的一种免疫检测技术。

它是将酶与抗体或抗原结合成酶标记抗体或抗原，此结合物既保留了抗体或抗原的免疫学活性，同时又保留了酶对底物的催化活性。

在酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应完成后，加入酶的相应底物，通过酶对底物的显色反应，对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析。

它通过利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高了抗原抗体反应的敏感性。

它具有检测灵敏度高、特异性强、准确性好、酶标记试剂能够较长时间保持稳定、操作简便、对环境没有污染等优点，而且容易与其他技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。

一、酶和酶作用底物（一）酶的要求1.酶的活性要强，催化反应的转化率高，纯度高。

2.易与抗体或抗原偶联，标记后酶活性保持稳定，且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性。

3.作用专一性强，酶活性不受样品中其他成分的影响，受检组织或体液中不存在与标记酶相同的内源性酶或抑制物。

4.酶催化底物后产生的产物易于判断或测量，方法简单易行、敏感和重复性好。

5.酶、辅助因子及其底物对人体无害，酶的底物易于配制、保存，酶及其底物应价廉易得。

（二）常用的酶1.辣根过氧化物酶（HRP）2.碱性磷酸酶（AP）3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）（三）常用的底物1.辣根过氧化物酶的底物（1）邻苯二胺（OPD）0PD均以片剂或粉剂供应，临用时再溶解于相应的缓冲液中。

（2）四甲基联苯胺（TMB） ELISA中应用最广泛的底物。

（3）其他：5-氨基水杨酸（5-ASA）和2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）也是HRP常用的底物。

2.碱性磷酸酶（AP）的底物3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）常用对-硝基苯磷酸脂（p-NPP），p-NPP经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。

常用4-甲基伞酮基-R-D半乳糖苷（4-MUU），酶作用后，生成高强度荧光物4-甲基伞形酮（4-MU），其敏度性较HRP高30～50倍，但测量时需用荧光计。

酶联免疫吸附试验ELISA一种酶联免疫技术。

用于检测包被于固相板孔中的待测抗原（或抗体）。

即用酶标记抗体，并将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，最后通过酶作用于底物后显色来判断结果。

酶联免疫吸附试验（以下简称ELISA）:是酶免疫测定技术中应用最广的技术。

其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。

常用的ELISA法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。

ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。

此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。

滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。

因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。

此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。

用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室温下稳定；反应产物易于显现；能商品化生产。

目前应用较多的有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用最广。

1•辣根过氧化物酶（HRP）过氧化物酶广泛分布于植物中，辣根中含量最咼，从辣根中提取的称辣根过氧化物酶（HRP），是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白（含糖量18%）,分子量约40000,约由300个氨基酸组成，等电点为pH3-9，催化反应的最适pH值因供氢体不同而稍有差异，一般多在pH5左右。

此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。